CN114134211B

CN114134211B - Usp30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用

Info

Publication number: CN114134211B
Application number: CN202111489506.XA
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 朱紫祥; 赵振翔; 齐晓兰; 杨帆; 曹伟军; 张向乐; 陈淑莹; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114134211A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用。(1)本发明发现抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制塞内卡谷病毒的复制，即USP30可作为靶点用于筛选抑制塞内卡谷病毒复制的药物；(2)本发明提供了干扰塞内卡谷病毒复制的小干扰RNA，能够抑制塞内卡谷病毒的复制；(3)本发明提供了一种特异性靶向USP30基因的sgRNA，结合CRISPR‑Cas9技术实现了USP30基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系USP30‑KOs对SVA具有抗性表型，能够显著抑制SVA在细胞内的复制，为进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

Description

USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用。

背景技术

塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属，属于单股正链RNA病毒，主要感染猪。SVA感染引发的水泡病与***(FMD)、猪水泡病(SVD)和水泡性口炎(VS)引起的病变极为类似，具体表现为病畜鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等症状。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止该病的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。但由于SVA感染与致病机制仍不清楚，仍未有商品化的疫苗或药物问世。因此深入了解宿主蛋白抑制SVA复制的机制，通过CRISPR-Cas9技术构建抑制SVA病毒复制的细胞系对于塞内卡谷疫苗的生产意义重大。

RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，设计合成靶向塞内卡谷病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制塞内卡谷病毒感染的有效途径。

USP30(ubiquitin specific peptidase 30)是位于线粒体外膜上的跨膜去泛素化酶(deubiquiti nating enzymes，DUBs)，可以抑制由泛素连接酶PARK2和蛋白激酶PINK1介导的线粒体自噬，调节线粒体的动态变化。之前的研究表明，USP30主要逆转线粒体上Parkin底物的泛素化。在神经元中，过表达USP30大大减弱了由CCCP诱导线粒体去极化而引起的线粒体自噬对线粒体的清除作用；而降低USP30的活性则增强了线粒体的降解。敲低USP30能缓解Parkin病理活性突变所引起的线粒体自噬障碍，以及在Parkin或者PINK1缺陷的果蝇中增强其线粒体的完整性。

本发明发现，通过抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制SVA的复制，可作为靶点用于制备抑制塞内卡谷病毒复制的药物。基于此，本发明以USP30基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰SVA的复制，可用于制备抑制SVA复制的药物。而且为了进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向USP30基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向USP30基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了USP30基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系USP30-KOs对SVA具有抗性表型，能够显著抑制SVA在细胞内的复制，为研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗SVA的动物育种。

发明内容

针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制塞内卡谷病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制塞内卡谷病毒复制的药物；其次，以USP30基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰塞内卡谷病毒复制，可用于制备抑制塞内卡谷病毒的复制的药物；并且，本发明提供了一种特异性靶向USP30基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向USP30基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了USP30基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系USP30-KOs对SVA具有抗性表型，能够显著抑制SVA在细胞内的复制，为进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种USP30基因/蛋白作为靶点在筛选用于预防或治疗塞内卡谷病毒感染药物中的应用，所述药物以USP30基因/蛋白为靶点，抑制或者沉默USP30基因/蛋白的表达。

第二方面，本发明提供了一种抑制USP30基因/蛋白表达的试剂或药物在制备预防或治疗塞内卡谷病毒感染药物中的应用。

优选地，所述试剂或药物为以USP30基因/蛋白为靶点设计的小干扰RNA。

优选地，所述小干扰RNA的序列为：

USP30-siRNA-F:5’-GGAGUACAAGUCUGAAGAATT-3’；

USP30-siRNA-R:5’-UUCUUCAGACUUGUACUCCTT-3’。

优选地，所述试剂或药物包括靶向敲除USP30基因的sgRNA，

优选地，所述试剂或药物还包括Cas9蛋白的mRNA序列。

优选地，所述药物通过药物递送载体将携带靶向USP30基因的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列递送至动物体内抑制USP30基因表达。

优选地，所述药物递送载体为脂质体纳米颗粒。

优选地，所述sgRNA包括USP30-sgRNA1、USP30-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

USP30-sgRNA1-F：5’-CACCGTCGCTCATCTTCCAATGACG-3’；

USP30-sgRNA1-R：5’-AAACCGTCATTGGAAGATGAGCGAC-3’；

USP30-sgRNA2-F：5’-CACCGCTCACCCTACATCCAATCAC-3’；

USP30-sgRNA2-R：5’-AAACGTGATTGGATGTAGGGTGAGC-3’。

第三方面，本发明提供了一种特异性靶向敲除USP30基因的sgRNA，所述sgRNA包括USP30-sgRNA1、USP30-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

USP30-sgRNA1-F：5’-CACCGTCGCTCATCTTCCAATGACG-3’；

USP30-sgRNA1-R：5’-AAACCGTCATTGGAAGATGAGCGAC-3’；

USP30-sgRNA2-F：5’-CACCGCTCACCCTACATCCAATCAC-3’；

USP30-sgRNA2-R：5’-AAACGTGATTGGATGTAGGGTGAGC-3’。

第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在制备USP30基因敲除细胞系中的应用。

第五方面，本发明提供了一种USP30基因敲除细胞系的构建方法，所述方法为通过基因打靶技术使宿主细胞中USP30基因编码蛋白功能丧失。

优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备上述第三方面所述的特异性靶向USP30基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向USP30基因的sgRNA寡聚核苷酸；

(2)将步骤(1)制备的双链片段***到PX459表达质粒载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；

(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选杀死阴性细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得USP30基因功能缺失细胞系。

第六方面，本发明提供了一种根据上述第五方面所述的方法构建的USP30基因敲除细胞系。

第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的USP30基因敲除细胞系在非诊断治疗目的的检测中的应用。

第八方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的USP30基因编码蛋白功能丧失细胞系在动物抗塞内卡谷病毒育种中的应用。

本发明的有益效果是：①本发明发现通过抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制塞内卡谷病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制塞内卡谷病毒复制的药物；②本发明以USP30基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰塞内卡谷病毒复制，可用于制备抑制塞内卡谷病毒的复制的药物；③本发明提供了一种靶向USP30基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向USP30基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中USP30基因的完全敲除；将靶向USP30基因的sgRNA通过药物载体递送至动物体内，可实现USP30基因的抑制，进而抑制塞内卡谷病毒的复制；④本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建USP30基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使USP30基因编码蛋白功能丧失，获得的了具有SVA抗性表型的细胞系，能够显著抑制SVA的复制，为进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗SVA的动物育种。

附图说明

图1小干扰RNA干扰后HEK293T细胞中USP30基因的表达结果；

图2小干扰RNA干扰后HEK293T细胞中SVA病毒的表达结果；

图3 PX459-USP30-sgRNA重组质粒构建测序比对结果；其中A为PX459-USP30-sgRNA1，B为PX459-USP30-sgRNA2；

图4转染PX459-USP30-sgRNA质粒后，HEK293T细胞DNA check引物PCR扩增结果；

图5转染PX459-USP30-sgRNA1质粒后，HEK293T细胞DNA check引物扩增片段测序图谱；

图6 USP30基因敲除HEK293T备选细胞USP30蛋白Western blotting检测结果；

图7 USP30基因敲除HEK293T细胞经SVA攻毒后细胞内病毒复制结果。

图8 USP30基因敲除HEK293T细胞经SVA攻毒后细胞内病毒蛋白复制水平的Western blotting检测结果；

图9 USP30基因敲除HEK293T细胞经SVA攻毒后细胞内病毒mRNA水平的qPCR检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

定义

术语“基因沉默”是指在不损伤原有DNA的情况下使基因低表达或不表达的现象，主要包括两个方面，一是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默；二是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制、基因抑制、RNA干扰和微小RNA介导的翻译抑制等。本发明可通过基因沉默技术，抑制宿主细胞中的USP30基因的表达，从而抑制SVA感染后的病毒复制，用于预防或治疗SVA感染。

术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的USP30基因敲除，获得的USP30基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能抑制SVA感染后的病毒复制；本发明也可以通过对宿主细胞中的USP30基因突变，或缺失基因片段，导致USP30基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出USP30基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。

术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基***或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。

本发明通过人工合成了靶向USP30基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向USP30基因的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；

本发明在直接靶向剪接USP30基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除USP30基因的方法，以人胚胎肾细胞293T为例，进行了USP30基因敲除(所述USP30基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，为SVA的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对人胚胎肾细胞293T中USP30基因进行敲除，获得了一种具有SVA抗性的基因敲除细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中USP30基因敲除，构建具有SVA抗性的基因敲除细胞。

CRISPR/Cas9***对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对USP30基因的sgRNA序列，实现USP30基因的准确、高效地敲除，获得一种具有抑制SVA病毒复制的USP30基因敲除单克隆细胞系，从而为SVA感染的预防或治疗提供新的策略。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向USP30基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到USP30基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或***等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。

细胞培养：HEK293T细胞衍生自人胚胎肾细胞；用含有10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的DMEM培养基置于含有5％CO₂温箱(37℃)中进行培养。

病毒来源：SVA-eGFP毒株保存于中国农业科学院兰州兽医研究所***与新发病流行病学团队与国家***参考实验室。

实施例1 USP30基因沉默后SVA病毒复制结果

1.小干扰RNA(siRNA)的设计

设计USP30基因的RNA干扰靶点序列USP30 siRNA(SEQ ID NO.3-4)和NC siRNA(SEQ ID NO.5-6)所示，具体序列如下：

USP30-siRNA-F:5’-GGAGUACAAGUCUGAAGAATT-3’(SEQ ID NO.3)；

USP30-siRNA-R:5’-UUCUUCAGACUUGUACUCCTT-3’(SEQ ID NO.4)；

NC siRNA-F:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.5)；

NC siRNA-R:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.6)。

2.USP30基因沉默细胞系构建：

(1)USP30基因沉默siRNA Oligo制备：将设计好的干扰RNA序列送至上海吉玛公司进行合成，得到相对应的siRNAOligo，用DEPC H₂O重悬1OD的siRNA使其终浓度为20Μm。溶解前先离心，10000rpm，2min,再慢慢打开管盖，溶解时加足DEPC水后充分振荡使其溶解。对照组siRNA(NC)用同样的方法溶解备用。

(2)USP30基因沉默细胞系的构建：HEK293T细胞计数后铺在六孔板中，待细胞融合度至70％～80％融合度时，将溶解好的siRNA6μL分别与Lipofectamine2000 6μL加至100μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-siRNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养6h后换液，24-36h检测mRNA表达，36-48h检测蛋白表达。

3.USP30基因表达水平检测

HEK293T细胞分别转染NC siRNA和USP30 siRNA，转染24h后，收取细胞，利用Western blotting和荧光定量PCR的方法检测USP30蛋白和基因的表达水平。检测结果如图1所示，相较于NC siRNA，转染USP30 siRNA后HEK293T细胞中USP30蛋白的表达水平显著下降、USP30基因的转录水平显著降低，说明USP30 siRNA能够抑制USP30基因的表达。

4.SVA病毒感染后的SVA病毒结果

细胞转染和感染方法如上述3所述，感染SVA12h后，收取细胞，利用Westernblotting的方法检测SVA病毒的表达水平、荧光定量PCR的方法检测SVA病毒的表达水平。结果如图2所示，相比较于NC siRNA转染的HEK293T细胞，转染USP30 siRNA后的HEK293T细胞感染SVA后，能够显著抑制SVA VP2蛋白的表达和SVA病毒的复制。

上述结果表明，以USP30为靶点涉及的小干扰RNA能够显著抑制USP30基因的表达，进而抑制SVA病毒的复制。因此，USP30作为靶点能够用于筛选或设计用于抑制SVA病毒复制的药物，进而用于预防或治疗塞内卡谷病毒感染。

实施例2 USP30基因敲除HEK293T细胞系

1.靶向USP30基因sgRNA的设计

利用Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段，用于靶点设计。

根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispor.tefor.net/进行sgRNA的设计，分别命名为：USP30-sgRNAsp1、USP30-sgRNAsp2；在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向USP30基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA1-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表1。

表1靶向USP30基因的sgRNA寡聚核苷酸

注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列(SEQ ID NO.7-10)。

2.sgRNA重组质粒PX459-sgRNA的构建

双链sgRNA-oligo的获得：将合成的sgRNA-oligo稀释至100μmol/L，配制共10μL反应体系：上游引物4.5μL；下游引物，4.5μL；10×LA PCR Buffer，1μL，轻柔混匀。退火程序：95℃，10min；后从PCR仪中拿出来自然放凉。

PX459载体质粒的酶切：利用Bbs I限制性内切酶酶切PX459载体，共配制20μL酶切体系如下：PX459载体，5μL；BbsI，1μL；10×Buffer，2μL；ddH₂O，12μL。37℃中放置3h进行酶切。之后进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收含有粘性末端的PX459载体线性化片段。

PX459-sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收PX459线性化片段产物与双链sgRNA-oligo进行连接反应，反应体系：T4 Ligase，0.5μL；10×T4Ligase Buffer，0.5μL；PX459酶切纯化片段，0.5μL；双链sgRNA-oligo，3.5μL，共5μL体系。16℃过夜连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。转化程序：将50μL的Trans5α感受态细胞与500ng连接产物混合，冰上放置30分钟。42℃水浴热激45秒，取出冰浴2分钟。加入无抗性LB培养液500mL，37℃，220rpm摇菌60分钟。将复苏好的菌液4000rpm室温离心5min。吸去400μL上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。

挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用

质粒提取试剂盒提取并测序验证，测序结果如图3所示，利用TRC通用引物检测所构建质粒得到的序列与原载体进行比对，与预期结果相符。表明表达sgRNA的质粒PX459-USP30-sgRNA1，PX459-USP30-sgRNA2构建成功；其中A为PX459-USP30-sgRNA1，B为PX459-USP30-sgRNA2。

3.细胞转染

在转染前复苏HEK293T细胞于T25细胞瓶中，使用含有10％的FBS、1％双抗的DMEM培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待细胞融合度至70％～80％时，将成功构建的重组质粒2μg分别与Lipofectamine2000，4μL(按照比例1μg：2μL)加至50μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-质粒DNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时后，用puromycin浓度8μg/mL的培养基处理细胞2-3天，筛选出转染阳性的细胞。随后通过细胞计数，数100个阳性细胞铺在96孔板中获得单个细胞克隆。

(1)细胞DNA的提取及基因打靶效率检测：

按照微量DNA提取试剂盒的操作说明，提取单个细胞克隆的基因组，进一步利用DNA check引物扩增含有打靶位点区段的USP30基因片段，所述DNAcheck引物为：

USP30-check-F：GTAGGGTGTCTGCCCGAGGTGGGTAGTT(SEQ ID NO.15)；

USP30-check-R：TATCAAGTGTTGGTATTGTATTTACCTG(SEQ ID NO.16)。

结果如图4所示，以野生型HEK293T细胞为对照，所有单个细胞克隆均扩增到了约2000bp大小片段，与预期设计片段大小相符。紧接着将目标位置的核酸凝胶切胶纯化回收后送样进行测序，测序图谱如图5所示，测序峰图中出现了大量的套峰，表明扩增片段中发生了有效的基因编辑。

(2)USP30-KOs Western blotting验证

以未发生基因编辑的HEK293T细胞(野生型细胞)作为阴性对照。取野生型细胞(WT)株与3株敲除型候选细胞株(分别编号为KO1-KO3)分别培养，待细胞长满后，收取细胞放置冰上。加入适量1×SDS loading Buffer充分搅拌裂解，待细胞全部脱落后吸取至EP管中，做好标记；金属浴放置15分钟变性，离心后，取上清进行SDS-PAGE。电泳后通过湿转法转移至NC膜，转印后使用5％的脱脂奶粉封闭，用购买的60kDa USP30兔抗为一抗，羊抗兔IgG(IgG-HRP)为二抗，进行抗原抗体复合物检测，对USP30基因敲除的HEK293T单克隆细胞系在蛋白表达水平进行验证。

实验结果如图6所示，WT检测到清晰的USP30蛋白条带，在3株候选细胞株中均未检测到USP30蛋白条带，说明KO1、KO2和KO3三株候选株中USP30基因打靶成功，说明采用本发明提供的sgRNA，并应用CRISPR-Cas9技术实现了对宿主细胞中USP30基因的完全敲除。

实施例3 USP30基因敲除HEK293T细胞系对SVA复制的影响

用USP30基因敲除HEK293T细胞和野生型HEK293T细胞，进行正常传代培养后，将细胞铺至35mm细胞培养皿，接种SVA-eGFP病毒，分别用Western blotting和qPCR方法检测SVA复制情况。

荧光检测结果如图7所示，结果表明，USP30基因敲除HEK293T细胞中SVA的复制结果显著降低。Western blotting检测结果如图8所示，结果表明，USP30基因敲除HEK293T细胞中SVA的VP2蛋白表达水平显著降低。

qPCR检测结果如图9所示，USP30基因敲除HEK293T细胞接种SVA后病毒的mRNA水平相比野生型细胞均显著下调。

以上结果表明，通过基因编辑技术获得USP30基因敲除HEK293T细胞能够显著抑制SVA的复制，具有SVA抗性。因此，构建的USP30基因编码蛋白的功能丧失细胞可用于动物抗SVA病毒的育种。

综上所述，本发明通过CRISPR-Cas9技术成功构建了USP30基因编码蛋白功能丧失的细胞系。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使USP30基因编码蛋白功能丧失也能够获得USP30基因编码蛋白功能丧失的细胞系。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 517

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 1

Met Leu Ser Ser Arg Ala Glu Ala Ala Met Thr Ala Ala Asp Arg Ala

1 5 10 15

Ile Gln Arg Phe Leu Arg Thr Gly Ala Ala Val Arg Tyr Lys Val Met

20 25 30

Lys Asn Trp Gly Val Ile Gly Gly Ile Ala Ala Ala Leu Ala Ala Gly

35 40 45

Ile Tyr Val Ile Trp Gly Pro Ile Thr Glu Arg Lys Lys Arg Arg Lys

50 55 60

Gly Leu Val Pro Gly Leu Val Asn Leu Gly Asn Thr Cys Phe Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Leu Gln Gly Leu Ser Ala Cys Pro Ala Phe Ile Arg Trp Leu

85 90 95

Glu Glu Phe Thr Ser Gln Tyr Ser Arg Asp Gln Lys Glu Pro Pro Ser

100 105 110

His Gln Tyr Leu Ser Leu Thr Leu Leu His Leu Leu Lys Ala Leu Ser

115 120 125

Cys Gln Glu Val Thr Asp Asp Glu Val Leu Asp Ala Ser Cys Leu Leu

130 135 140

Asp Val Leu Arg Met Tyr Arg Trp Gln Ile Ser Ser Phe Glu Glu Gln

145 150 155 160

Asp Ala His Glu Leu Phe His Val Ile Thr Ser Ser Leu Glu Asp Glu

165 170 175

Arg Asp Arg Gln Pro Arg Val Thr His Leu Phe Asp Val His Ser Leu

180 185 190

Glu Gln Gln Ser Glu Ile Thr Pro Lys Gln Ile Thr Cys Arg Thr Arg

195 200 205

Gly Ser Pro His Pro Thr Ser Asn His Trp Lys Ser Gln His Pro Phe

210 215 220

His Gly Arg Leu Thr Ser Asn Met Val Cys Lys His Cys Glu His Gln

225 230 235 240

Ser Pro Val Arg Phe Asp Thr Phe Asp Ser Leu Ser Leu Ser Ile Pro

245 250 255

Ala Ala Thr Trp Gly His Pro Leu Thr Leu Asp His Cys Leu His His

260 265 270

Phe Ile Ser Ser Glu Ser Val Arg Asp Val Val Cys Asp Asn Cys Thr

275 280 285

Lys Ile Glu Ala Lys Gly Thr Leu Asn Gly Glu Lys Val Glu His Gln

290 295 300

Arg Thr Thr Phe Val Lys Gln Leu Lys Leu Gly Lys Leu Pro Gln Cys

305 310 315 320

Leu Cys Ile His Leu Gln Arg Leu Ser Trp Ser Ser His Gly Thr Pro

325 330 335

Leu Lys Arg His Glu His Val Gln Phe Asn Glu Phe Leu Met Met Asp

340 345 350

Ile Tyr Lys Tyr His Leu Leu Gly His Lys Pro Ser Gln His Asn Pro

355 360 365

Lys Leu Asn Lys Asn Pro Gly Pro Thr Leu Glu Leu Gln Asp Gly Pro

370 375 380

Gly Ala Pro Thr Pro Val Leu Asn Gln Pro Gly Ala Pro Lys Thr Gln

385 390 395 400

Ile Phe Met Asn Gly Ala Cys Ser Pro Ser Leu Leu Pro Thr Leu Ser

405 410 415

Ala Pro Met Pro Phe Pro Leu Pro Val Val Pro Asp Tyr Ser Ser Ser

420 425 430

Thr Tyr Leu Phe Arg Leu Met Ala Val Val Val His His Gly Asp Met

435 440 445

His Ser Gly His Phe Val Thr Tyr Arg Arg Ser Pro Pro Ser Ala Arg

450 455 460

Asn Pro Leu Ser Thr Ser Asn Gln Trp Leu Trp Val Ser Asp Asp Thr

465 470 475 480

Val Arg Lys Ala Ser Leu Gln Glu Val Leu Ser Ser Ser Ala Tyr Leu

485 490 495

Leu Phe Tyr Glu Arg Val Leu Ser Arg Met Gln His Gln Ser Gln Glu

500 505 510

Cys Lys Ser Glu Glu

515

<210> 2

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 2

atgctgagct cccgggccga ggcggcgatg accgcggccg acagggccat ccagcgcttc 60

ctgcggaccg gggcggccgt cagatataaa gtcatgaaga actggggagt tataggtgga 120

attgctgctg ctcttgcagc aggaatatat gttatttggg gtcccattac agaaagaaag 180

aagcgtagaa aagggcttgt gcctggcctt gttaatttag ggaacacctg cttcatgaac 240

tccctgctac aaggcctgtc tgcctgtcct gctttcatca ggtggctgga agagttcacc 300

tcccagtact ccagggatca gaaggagccc ccctcacacc agtatttatc cttaacactc 360

ttgcaccttc tgaaagcctt gtcctgccaa gaagttactg atgatgaggt cttagatgca 420

agctgcttgt tggatgtctt aagaatgtac agatggcaga tctcatcatt tgaagaacag 480

gatgctcacg aattattcca tgtcattacc tcgtcattgg aagatgagcg agaccgccag 540

cctcgggtca cacatttgtt tgatgtgcat tccctggagc agcagtcaga aataactccc 600

aaacaaatta cctgccgcac aagagggtca cctcacccta catccaatca ctggaagtct 660

caacatcctt ttcatggaag actcactagt aatatggtct gcaaacactg tgaacaccag 720

agtcctgttc gatttgatac ctttgatagc ctttcactaa gtattccagc cgccacatgg 780

ggtcacccat tgaccctgga ccactgcctt caccacttca tctcatcaga atcagtgcgg 840

gatgttgtgt gtgacaactg tacaaagatt gaagccaagg gaacgttgaa cggggaaaag 900

gtggaacacc agaggaccac ttttgttaaa cagttaaaac tagggaagct ccctcagtgt 960

ctctgcatcc acctacagcg gctgagctgg tccagccacg gcacgcctct gaagcggcat 1020

gagcacgtgc agttcaatga gttcctgatg atggacattt acaagtacca cctccttgga 1080

cataaaccta gtcaacacaa ccctaaactg aacaagaacc cagggcctac actggagctg 1140

caggatgggc cgggagcccc cacaccagtt ctgaatcagc caggggcccc caaaacacag 1200

atttttatga atggcgcctg ctccccatct ttattgccaa cgctgtcagc gccgatgccc 1260

ttccctctcc cagttgttcc cgactacagc tcctccacat acctcttccg gctgatggca 1320

gttgtcgtcc accatggaga catgcactct ggacactttg tcacttaccg acggtcccca 1380

ccttctgcca ggaaccctct ctcaactagc aatcagtggc tgtgggtctc cgatgacact 1440

gtccgcaagg ccagcctgca ggaggtcctg tcctccagcg cctacctgct gttctacgag 1500

cgcgtccttt ccaggatgca gcaccagagc caggagtgca agtctgaaga atga 1554

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaguacaag ucugaagaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uucuucagac uuguacucct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccgtcgct catcttccaa tgacg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaccgtcat tggaagatga gcgac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgctcac cctacatcca atcac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacgtgatt ggatgtaggg tgagc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccgtcgct catcttccaa tgacg 25

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccgtcat tggaagatga gcga 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccgctcac cctacatcca atcac 25

<210> 14

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacgtgatt ggatgtaggg tgag 24

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtagggtgtc tgcccgaggt gggtagtt 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tatcaagtgt tggtattgta tttacctg 28

Claims

1.抑制USP30基因/蛋白表达的试剂在制备预防或治疗塞内卡谷病毒感染药物中的应用；所述试剂为以USP30基因/蛋白为靶点设计的小干扰RNA；

或，所述试剂包括靶向敲除USP30基因的sgRNA和 Cas9蛋白的mRNA序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小干扰RNA的序列为：

USP30-siRNA-F：5’-GGAGUACAAGUCUGAAGAATT-3’；

USP30-siRNA-R：5’-UUCUUCAGACUUGUACUCCTT-3’。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述sgRNA包括USP30-sgRNA1、USP30-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

USP30-sgRNA1-F：5’-CACCGTCGCTCATCTTCCAATGACG-3’；

USP30-sgRNA1-R：5’-AAACCGTCATTGGAAGATGAGCGAC-3’；

USP30-sgRNA2-F：5’-CACCGCTCACCCTACATCCAATCAC-3’；

USP30-sgRNA2-R：5’-AAACGTGATTGGATGTAGGGTGAGC-3’。