CN115725586A

CN115725586A - 一种靶向ptk7的核酸适配体修饰结构及其偶联药物、制备方法和用途

Info

Publication number: CN115725586A
Application number: CN202110986513.4A
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 殷红; 刘庄; 陈思凯
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种修饰后的核酸适配体(式II)，包含该核酸适配体的靶向PTK7的核酸偶联药物SGCR‑YH及其制备方法和用途。所述核酸偶联药物具有式III所示的结构。该核酸偶联药物既能靶向PTK7，又有强烈的杀伤肿瘤细胞的活性。本发明所述偶联药物表现出更好的肿瘤抑制活性，适用于对乳腺癌，卵巢癌，胃癌，肠癌，非小细胞肺癌肝癌，胰腺癌，三阴乳腺癌，食管癌，鳞状上皮细胞癌，头颈癌或***癌等肿瘤的治疗，具有广泛应用前景。

Description

一种靶向PTK7的核酸适配体修饰结构及其偶联药物、制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向PTK7的核酸适配体修饰结构及其偶联药物、制备方法和用途，具体而言，涉及一类可以产生靶向肿瘤杀伤作用的核酸偶联药物(尤其涉及靶向于PTK7的核酸偶联药物)、其制备方法及其用途。

背景技术

目前已知受体酪氨酸激酶(RTK)是可将细胞外环境的生物信号传递至细胞内部的跨膜信号传导蛋白。RTK对于调节细胞生长，分化，上皮生长，发育，黏附，迁移和凋亡等都很重要，参与多种形式的癌症的发生和发展。

酪氨酸激酶7(PTK7)是RTK家族的一个成员。作为PTK7/Otk的一个多功能的共同受体，在Wnt、Semaphorin/Plexin和血管内皮生长因子所介导的信号传导通路中起到分子开关功能，对促进肿瘤的生长，血管形成，迁移和血管内皮细胞的入侵，起着重要的作用。PTK7在许多人类恶性肿瘤中出现高表达，包括结肠癌，肺癌，胃癌和急性髓细胞白血病等。

核酸作为药物或者靶向分子在体内容易被核酸酶等的作用下快速代谢掉，且具有稳定性低、特异性低等问题。因此，亟需开发靶向PTK7的药物以及此类药物的构建方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能提高核酸亲和性、靶向性等的核酸适配体的方法，还相应提供了包含该核酸适配体的药物偶联物，该核酸适配体能够与PTK7高特异性和高亲和力结合，具有分子量小、无免疫原性、生物相容性好、稳定性高、偶联物循环时间长、易于保存、易于化学合成等优势，可应用于作为药物载体，应用于药物分离与纯化，应用于具有PTK7表达的肿瘤的药物制备等领域。

本发明筛选获得的靶向结合PTK7蛋白的核酸适配体，通过化学修饰方法获得，本发明对所得修饰后的核酸适配体序列的稳定性、靶向性以及亲和性等的分析，证明所述修饰后的核酸适配体能够特异性地靶向结合PTK7蛋白，并和表达PTK7蛋白的肿瘤细胞结合从而起到靶向输送的作用。

本发明的目的在于提供具有亲和性高、靶向性强、半衰期长、选择性高、副作用小等优点的核糖核酸适配体及包含其的核酸适配体药物偶联物、药物组合物等。

本发明通过用特定修饰基团来修饰核酸适配体，一方面可以增强核酸适配体的稳定性，另一方面利用修饰后的核酸适配体对肿瘤细胞的特异性识别能力将抗肿瘤药物靶向输送到肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性。同时本发明中的核酸适配体还能偶联上其它抗肿瘤机制的药物，从而从不同的作用靶点***，具有协同效果。本发明所述偶联药物表现出更好的肿瘤抑制活性。

本发明一方面是提供一种对核酸适配体进行修饰的方法，所述方法包括对核酸适配体采用如下式I基团进行修饰，获得修饰后的核酸适配体：

式I

其中，R1为H或者PO3^–-CnH2n+1，n为0-24；优选地，n为10-20；进一步优选地，n为12-18。

R2为PO3^-、羧基、马来酰胺或叠氮基团。

x为1-24；优选地，x为1-8或4-24；

y为1-6；优选地，y为2-3；进一步优选地，y为1。

本发明另一方面是提供一种修饰后的核酸适配体，其结构如式II：

式II

R2为PO3^-、羧基、马来酰胺或叠氮基团。

x为1-24；优选地，x为1-8或4-24；

y为1-6；优选地，y为2-3。

Aptamer为核酸适配体。

进一步优选地，当R2为PO3^-时，x为1-8；y为1-6，通过O与核酸适配体连接；

当R2为羧基，马来酰胺，叠氮基团时，Z为Aptamer上的氨基，巯基，或者炔基/DBCO等，x为4-24，y为1。作为举例说明，当R2为羧基时，Aptamer提供氨基，羧基与氨基进行反应，将R2与Aptamer进行连接；当R2为马来酰胺时，Aptamer提供巯基，马来酰胺与巯基进行反应，将R2与Aptamer进行连接；当R2为叠氮基团时，Aptamer提供炔基或DBCO，叠氮基团与炔基或DBCO进行反应，将R2与Aptamer进行连接。

进一步优选地，当R为H，x为6，y为2，Aptamer为巯基修饰的SEQ ID NO.1所示的SGC8序列，且修饰后的核酸适配体的3’端末端由反向T碱基(inverted dT)，得到的修饰后的核酸适配体标记为2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR4。

进一步优选地，R为PO₃ ^–-C_nH_2n+1，n为18，x为6，y为2时，Aptamer为巯基修饰的SEQID NO.1所示的SGC8序列，且修饰后的核酸适配体的3’端末端由反向T碱基(inverted dT)，得到的修饰后的核酸适配体标记为C18-2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR5。

其中，所述核酸适配体Aptamer选自核苷酸分子或核苷酸类似物。

其中，所述核苷酸分子包括双链核苷酸分子，单链核苷酸分子；所述单链核苷酸分子选自cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反义RNA、核酶、非编码RNA、反义寡核苷酸。

所述核苷酸类似物选自1)可以和核苷酸分子或核酸类结构分子结合后起调控功能的核酸类似物，2)核苷酸分子或核酸类结构分子的部分改造的肽核酸、纳米核酸、锁核酸、核酸蛋白，3)核苷酸分子或核酸类结构分子被取代获得的硫代核苷酸、2′-甲氧基核苷酸、2′-氟代核苷酸；或4)核苷酸分子与其他功能核苷酸，功能多肽，功能蛋白，抗体等其一或组合以化学偶联或组装等任意形式结合形成的核酸衍生物。

作为优选地，所述核苷酸分子选自以下序列中的任意一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(SGC8)、或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(PDL1)；

SGC8：5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’(SEQID NO.1)；

PD-L1：5'-TAC AGG TTC TGG GGG GTG GGT GGG GAA CCT GTT-3’(SEQ ID NO.2)。

(2)与(1)中所述核苷酸序列的同一性在80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；进一步更佳地95％以上；进一步更佳地99％以上)且具有特异性结合人肿瘤细胞功能的核苷酸序列；

(3)(1)中所述核苷酸序列的截短体，且具有相同/相似特异性结合人肿瘤细胞功能的核苷酸序列；

(4)在严格条件下能够与(1)中所述核苷酸序列杂交且具有相同/相似特异性结合人肿瘤细胞功能的核苷酸序列；

(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(6)(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列转录的RNA序列；

(7)(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列改造成的相应锁核酸或肽核酸；

(8)(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列与其他功能核苷酸，功能多肽，功能蛋白，抗体等其一或组合以化学偶联或组装等任意形式结合形成的核酸衍生物。

本发明另一方面是提供如上所述的核酸适配体的应用，选自以下用途中的一个或多个：

用于作为药物载体中的用途；

用于药物设计与开发中的用途；

用于研究肿瘤细胞表面蛋白中的用途；

用于药物分离与纯化中的用途；

用于制备共聚物、生物制品中的用途。

具体地，本发明提供的所述核酸适配体用于制备靶向PTK7的药物或用于治疗具有PTK7表达的肿瘤的药物中的用途；其中，所述药物选自共聚物、药物组合物，其中所述共聚物包括核酸偶联药物。

本发明一方面是提供如上一种共聚物，所述共聚物包含如上所述的核酸适配体和药物分子，所述核糖核酸适配体和药物分子通过偶联、聚合、附着等方式中的一种或几种进行连接。

本发明另一方面是提供如上所述的共聚物，当所述核糖核酸适配体和药物分子通过偶联方式连接时，所述共聚物为核酸偶联药物；其中，所述核酸偶联药物是靶向于PTK7的核酸偶联药物SGCR-YH，所述偶联药物由修饰后的核酸适配体片段、药物片段和连接子组成，所述偶联药物具有如下式III所示的结构：

式III

式中R-Aptamer为如上所述的修饰后的核酸适配体，其中各基团定义同上文所述；

所述R3为药物片段。

本发明中，所述药物为细胞毒性药物，选自核苷类似物和碱基类似物、代谢类药物、高活小分子、生物碱、中药提取物、小分子抑制剂、植物碱类、抗肿瘤小分子靶向药物、核酸药物、蛋白药物等中的一种或几种。优选地，所述药物为MMAE、MMAF、DM1、DM4或PBD二聚体(PBD dimer)等中的一种或几种。

本发明另一方面是提供如上所述的核酸偶联药物在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途，所述的肿瘤为具有PTK7表达的肿瘤。

其中，所述具有PTK7表达的肿瘤包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌，结直肠癌，非小细胞肺癌，肝癌，胰腺癌，三阴乳腺癌，食管癌，鳞状上皮细胞癌，头颈癌，***癌等中的一种或几种。优选地，所述肿瘤选自卵巢癌，结直肠癌或非小细胞肺癌。

在一优选实施方式中，所述具有PTK7表达的肿瘤细胞选自卵巢癌细胞OVCAR3、结直肠癌细胞HCT116、非小细胞肺癌细胞NCI-H446、三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231、胰腺癌细胞PANC-1或胃癌细胞NCI-87。

本发明所提供的所述共聚物(包括核酸适配体偶联药物)能够明显的抑制癌细胞的生长、迁移、浸润、骨转移，促进肿瘤细胞的凋亡等。

本发明另一方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的核酸适配体或如上所述的共聚物，包含或不包含药学上可接受的载体或赋形剂或佐剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

与现有技术相比，本发明的有益效果还包括：

(1)本发明人经过大量实验筛选，获得一种可以对核苷酸分子或核苷酸类似物特性进行有效改进的修饰基团，所述修饰基团通过与核苷酸分子或核苷酸类似物连接，可以改变核苷酸分子或核苷酸类似物的立体构象，进而获得具有高亲和性、高选择性和高特异性的核酸适配体，且修饰后的核酸适配体还具有靶向性强、半衰期长，副作用小等特点。

(2)本发明将特定筛选的修饰基团修饰核苷酸分子或核苷酸类似物得到的修饰后的核酸适配体及其偶联药物可以高亲和力结合肿瘤细胞，例如修饰后，对PTK7表达的结肠癌细胞HCT116的亲和力增强。

(3)本发明将特定筛选的修饰基团修饰核苷酸分子或核苷酸类似物得到的核酸适配体及其偶联药物能够特异性识别NCI-H446和OVCAR3，对这两种肿瘤细胞的毒性最大。

(4)选择经本发明特定筛选的修饰基团修饰获得的核酸适配体作为药物载体，能够保护药物免受环境影响，可获得适宜的释药速度，起到延长偶联物循环时间，获得持久的药效。其中修饰基团的碳链对于实现修饰基团的特性起着重要作用。

(5)本发明将特定筛选的修饰基团修饰核苷酸分子或核苷酸类似物得到的核酸适配体具有化学稳定性好、药代动力学性质佳、无免疫原性、无毒性、且序列长度较短等优点，有利于大规模工业化生产及应用。

(6)本发明所述的核酸适配体可体外合成及修饰，具有易修饰特性，可以通过本发明特定筛选的修饰基团连接到核苷酸分子或核苷酸类似物上获得；合成周期短，重现性好。

(7)本发明利用修饰后的核酸适配体与PTK7结合的特性，有望提高核酸适配体的稳定性，进一步提高核酸适配体偶联药物的安全性和溶解度，延长药效，减少药物与其他血液内源性物质的结合。

(8)对本发明所述核酸适配体进行标记与修饰有利于PTK7蛋白相关的新药物的开发等。

(9)本发明所述核酸适配体在肿瘤细胞生物学新技术开发以及靶向治疗方面具有广阔的应用前景和重要的学术价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案和优点，下面将对实施例所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1核酸适配体修饰前后对细胞亲和性比较图。

图2核酸适配体化学修饰前后在小鼠体内分布成像比较图；其中，修饰后的核酸适配体为SGCR4。

图3核酸偶联药物对不同细胞的活性影响，IC50曲线；其中，每幅图的纵坐标Inh％表示抑制率(inhibition)。

图4NCI-H446小细胞肺癌小鼠模型中肿瘤抑制效果。

图5NCI-H446小细胞肺癌小鼠模型在治疗过程中体重变化。

其中，当R为H，x为6，y为2，Aptamer为SGC8时，得到的修饰后的核酸适配体标记为2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR4；当所述核酸适配体SGCR4与药物MMAE通过linker(vc)连接时，相对应的核酸适配体偶联药物标记为2spacer18-SGC8-inverted-dT-vc-MMAE，记作：SGCR4-vc-MMAE(YH2502)。

其中，R为PO₃ ^–-C_nH_2n+1，n为18，x为6，y为2时，Aptamer为SGC8时，得到的修饰后的核酸适配体标记为C18-2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR5；当所述核酸适配体SGCR5与药物MMAE通过vc连接时，相对应的核酸适配体偶联药物标记为C18-2spacer18-SGC8-inverted-dT-vc-MMAE，并记作SGCR5-vc-MMAE(YH2504)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明提供了一种对核酸适配体进行修饰的方法，所述方法包括对核酸适配体采用如下式I基团进行修饰，获得修饰后的核酸适配体。例如，为了提高核糖核酸适配体的稳定性或体内有效作用时间(如提高半衰期)等特性，在核糖核酸适配体序列的两端或中间位置的部分碱基上进行如下式I基团的化学修饰，得到式II所示的修饰后的核酸适配体R-Aptamer。

式I

式II

式I或式II中，R1为H或者PO3^–-CnH2n+1，n为0-24；优选地，n为10-20；进一步优选地，n为12-18。

R2为PO3^-、羧基、马来酰胺或叠氮基团。

x为1-24；优选地，x为1-8或4-24；

y为1-6；优选地，y为2-3。

Aptamer为核酸适配体。

在一具体实施方式中，式I或II中，所述R基团为PO₃ ^–-C_nH_2n+1时，碳原子数n为0-24或10-20或10-15或15-20或12-18或13-19或15-18或16-19或16-18或18-20个。在一具体实施方式中，碳原子数n可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个。

在一具体实施方式中，式I或II中，x可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。

在一具体实施方式中，式I或II中，y可以为1、2、3、4、5、6。

本发明中，适用于所述修饰方法的核酸适配体包括核苷酸分子或核苷酸类似物。

其中，所述核苷酸分子包括双链核苷酸分子，单链核苷酸分子；所述单链核苷酸分子包括cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反义RNA、核酶和非编码RNA、反义寡核苷酸，以及与前述序列具有一定同一性的核苷酸分子或片段。

其中，“与前述序列具有一定同一性的核苷酸分子或片段”通过如下方法获得：与前述所示的序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)碱基而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)碱基而得到的，且具有与前述序列具有相同/相似功能的核苷酸分子或片段。

本发明中，序列“同一性”是指按照位置，相应碱基相同的百分比，其能指示两条或多条核酸之间的相似水平(也称为序列同源性、相似性或同一性)。在一具体实施方式中，所述“与前述序列具有一定同一性的核苷酸分子或片段”中，“同一性”是指与天然核酸序列或已知核酸序列的相似性，包括具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

其中，所述核苷酸类似物选自可以和核苷酸分子或核酸类结构分子结合后起调控功能的核酸类似物，核苷酸分子或核酸类结构分子的部分改造的肽核酸、纳米核酸、核酸蛋白，或将核酸适配体的骨架的部分或全部改造为硫代磷酸酯骨架获得的核苷酸，或核苷酸分子或核酸类结构分子的某一位置(包括5’端、3’端、部分骨架或全部骨架的糖环)被取代或修饰获得的包括硫代核苷酸、2′-甲氧基核苷酸、2′-氟代核苷酸、磷酸化的核苷酸、氧甲基化的核苷酸、锁核酸修饰的核苷酸、甲基化的核苷酸、氨基化的核苷酸(如2-NH₂修饰)、巯基化的核苷酸、生物素化的核苷酸、荧光(如FITC等)标记的核苷酸、酶标记的核苷酸、纳米发光材料标记的核苷酸、叶酸标记的核苷酸或同位素化的核苷酸、PEG修饰的核苷酸、经PEG-脂质体混合物包埋的核酸适配体。

其中，几种对核苷酸修饰的例子如下：

式A

在一具体实施方式中，所述核酸适配体为单价或者多价巯基或二硫保护的巯基基团修饰的核苷酸，其结构包括但不仅限于如下所示，其修饰位点在核酸3'端、5'端或者中间：

式B

式B中，x为1-40，优选的，x为1-6；y为0-10，优选的，y为1-3；z为2-20，优选的，z为2-6；a为2-20，优选的，a为2-8；b为2-20，优选的，b为2-6；c为1-20，优选的，c为1-3。

本发明所述核酸适配体是一种利用自身折叠的高级结构与特定靶标结合的寡核苷酸，如一段DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或者修饰的DNA和RNA。DNA是由多个脱氧核苷酸组成，一个脱氧核苷酸分子由一分子碱基(腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C和鸟嘌呤G)、一分子脱氧核糖和一分子磷酸偶联而成；RNA是由多个核糖核苷酸组成，一个核糖核苷酸是由一分子碱基(腺嘌呤A、尿嘧啶U、胞嘧啶C、鸟嘌呤G)、一分子核糖和一分子磷酸偶联而成。

优选的，本文所述核苷酸分子选自以下序列中的任意一种：

PD-L1：5'-TAC AGG TTC TGG GGG GTG GGT GGG GAA CCT GTT-3’(SEQ ID NO.2)；

(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(6)(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列转录的RNA序列；

本发明中，所述修饰后的核酸适配体的3’端末端由反向T碱基(inverted dT)合成。目的是抵抗DNA外切酶的剪切，提高核酸适配体的稳定性。

本发明中，所述核酸适配体包括核苷酸分子或核苷酸类似物。所述核苷酸分子或核苷酸类似物中的核苷酸的全长序列或其片段选自天然存在、体外转录、重组或人工合成(固相合成或合成后修饰获得)的序列，或任何其他来源的同样的序列。

本发明所述的核酸适配体具有更高的亲和力与特异性，无免疫原性，能够化学合成，成本低，可进行标记，稳定性好，易于保存等优点。

以上经修饰核苷酸类似物获得的修饰后的核酸适配体，都具有与经修饰核苷酸分子(或基础核苷酸分子)获得的原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于与PTK7特异性结合。

本发明中，所述修饰后的核酸适配体为可与疾病相关分子特异结合。所述核酸适配体可以通过3D构象互补与靶分子结合，具有亲和性和特异性，且具有水溶性好、稳定性高、免疫原性低、制备简单、成本低等优点，并且是安全的。并且，由于可以实现细胞水平的特异性递送，本发明所述核酸适配体作为靶向分子可以被应用在药物的靶向递送中。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述核酸适配体的用途，上述的任意一种核酸适配体用于作为药物载体。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述修饰后的核酸适配体的用途，上述的任意一种修饰后的核酸适配体用于药物设计与开发。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述修饰后的核酸适配体的用途，上述的任意一种修饰后的核酸适配体用于研究肿瘤细胞表面蛋白。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述修饰后的核酸适配体的用途，上述的任意一种修饰后的核酸适配体用于药物分离与纯化。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述修饰后的核酸适配体的用途，上述的任意一种核酸适配体用于制备核酸适配体共聚物，所述核酸适配体和药物分子的偶联方式可以采用本领域公知的方式进行，如核酸适配体和药物分子可以通过偶联、聚合或附着的方式进行连接。

在本发明的其中一种方案中，利用物理镶嵌的方式将药物和修饰后的核酸适配体连接，获得能靶向结合的核酸适配体-细胞毒偶联物，并探究其靶向性、亲和性、细胞毒性作用等，为临床上筛选和研究新型靶向药物提供较好的靶标，也为临床治疗提供新的方法和思路。

其中，所述共聚物(核酸适配体共聚物)为单特异核酸适配体药物共聚物、双特异核酸适配体药物共聚物、或多特异核酸适配体药物共聚物。

其中，当所述核酸适配体和药物分子通过偶联方式进行时，核酸适配体共聚物为核酸适配体药物偶联物，所述偶联是指通过在核酸适配体5’端或3’端连接上连接子linker从而偶联细胞毒性药物，或所述偶联是指核酸适配体的5’端或3’端直接与药物分子偶联获得偶联细胞毒性药物。所述偶联可以通过固相合成或化学合成方法合成于所述5’端或3’端。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种所述核酸适配体的用途，上述的任意一种核酸适配体用于制备药物组合物中的用途，所述药物组合物可以包含如前所述的任意一种修饰后的核酸适配体(较佳地，其含量为有效量的)，或与其它抗肿瘤药物连接、偶联或聚合形成的共聚物。通常，为药学用途，本发明所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。进一步地，本发明所述药物组合物还包括任选一种或多种其他具有药学活性的化合物。

较佳地，所述核酸偶联药物为靶向PTK7的核酸偶联药物，用于治疗PTK7阳性的肿瘤。

在一具体实施方式中，本发明提供了靶向PTK7的核酸偶联药物在***中的应用。

本发明中，所述的肿瘤为具有PTK7表达的肿瘤，包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌，结直肠癌，非小细胞肺癌，肝癌，胰腺癌，三阴乳腺癌，食管癌，鳞状上皮细胞癌，头颈癌，***癌。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种共聚物，所述共聚物包含如上所述的核酸适配体和药物分子，所述核糖核酸适配体和药物分子通过偶联、聚合或附着的方式连接。

本发明所述的共聚物，当所述核糖核酸适配体和药物分子通过偶联方式连接时，所述共聚物为核酸偶联药物；其中，所述核酸偶联药物是靶向于PTK7的核酸偶联药物，命名为SGCR-YH，其中SGCR为具有修饰基团的核酸适配体。R2与核酸适配体偶联，将通过固相合成或化学合成方法合成于所述5’端或3’端。所述偶联药物由修饰后的核酸适配体片段、药物片段(如小分子药物)和连接子组成，所述偶联药物具有如下式III所示的结构：

式III

其中，各基团的定义见上文所示。

本发明中，所述药物为细胞毒性药物，如化疗药物(细胞毒性药物)，可以用于***、治疗炎症、治疗感染以及免疫性疾病等，例如可以包括的是核苷类似物和碱基类似物(如吉西他滨、五氟尿嘧啶，及其他活性小分子的核苷结构或碱基结构)、高活小分子海兔毒素类(或Auristatins类，比如MMAE和MMAF)和美登素类(比如DM1和DM4)、与DNA相互作用的毒素-卡其霉素(calicheamicins)、杜卡霉素(duocarmycin)类似物、吡咯并苯并二氮杂二聚体类(PBD dimer)、生物碱、中草药提取物(如雷公藤甲素等)、小分子抑制剂(如喜树碱、SN38、拓扑替康、阿霉素、康普瑞汀等)。具体地，所述药物包括但不限于：代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

更优选地，上述药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、MMAE、MMAFE、PBD dimer、美登素、美登醇、紫杉醇、甲氨蝶呤、雷公藤甲素、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、表阿霉素、阿霉素、卡铂、顺铂、多烯紫杉醇、吉西他滨，或核酸药物(如siRNA或shRNA)或蛋白药物、多西他赛，奥沙利铂，异长春花碱、表柔比星、吡柔比星、卡奇霉素、他托布林、尾海兔素、澳瑞他汀F、道诺霉素、环磷酰胺、依维莫司、卡培他滨。

作为本发明的优选方式，所述药物为抗肿瘤药物为MMAE、MMAF、PBD dimer、DM1或DM4。

合适的适用于本发明所述核酸适配体的几种药物分子的例子如下：

式C

本发明中，所述药物可以通过本发明公知的或常规的方式与所述修饰后的核酸适配体相连，或通过与连接子linker再与药物分子相连；如通过DNA固相合成方法与核酸适配体进行偶联得到核酸偶联药物分子等。

本发明中，所述linker为化学连接子或化学连接键或连接元件时，其结构如下：

本发明中，连接子linker包含Aptamer偶联区(Y)，功能区和药物分子偶联区(X)。所述linker为磷酸酯键(如磷酸二酯键)，可切割键(如式d所示的vc，SPBD)，或不可切割键(如式D所示的SMCC)。

本发明核酸适配体可以通过固相合成或合成后修饰的氨基、巯基、叠氮基、炔基、羧基、反式环辛烯、四嗪等官能团，与linker的Y基团包括羧基及其活性物种、马来酰亚胺、炔基、叠氮基、氨基、四嗪、反式环辛烯等官能团进行偶联。药物分子R₃的氨基、羟基或者羧基，与linker的X基团包括羧基及其活性物种、羟基、或氨基等基团进行偶联。

在一具体实施方式中，所述R₃药物分子通过磷酸二酯键与核酸适配体相连，或所述R3药物分子与氧被硫全取代或部分取代的核酸适配体相连，或所述R3药物分子嵌入核酸适配体的5’端或3’端或中间。在一优选实施方式中，本发明所述的连接子linker为磷酸二酯基。

在一优选实施方式中，本发明采用的linker一端含有羟基或羧基，另一端含有马来酰氨基团。

式D

作为本发明的一个例子，当linker为可切割化学键时，其为vc，结构如下式e所示：

式E

本发明中，所述连接子linker与修饰后的核酸适配体可以通过本领域公知的任何方法进行连接，如通过磷氧键，磷硫键、进行连接。在一具体实施方式中，所述linker与核酸适配体上的NH₂-，SH-基团进行连接。

本发明中，所述linker与药物分子可以通过本领域公知的任何方法进行连接，如通过磷酸酯键进行连接。当R3为核苷结构形式时，式中linker与R3的连接键为磷酸二酯键。在一具体实施方式中，所述linker上的羟基与药物分子上的NH₂-，COOH-基团进行连接。

优选的，本发明修饰后的核酸适配体为巯基修饰的核酸适配体时，所述核酸适配体提供巯基，Linker为式E所示的vc，其中Y基团为马来酰亚胺，巯基与马来酰亚胺可以偶联形成化学键；linker的X基团提供羧基或羟基，药物R3基团提供氨基，羧基或羟基与氨基可以偶联形成化学键。

在一具体实施方式中，当所连药物分子R3为核苷类似物、碱基类似物结构形式时(优选的，为吉西他滨或五氟尿嘧啶的核苷结构)，式中linker为连接元件如磷酸二酯键。

在一具体实施方式中，当所连药物分子R3为化学分子例如高活小分子如海兔毒素类如MMAE或MMAF、美登素类如DM1或DM4等，生物碱、中药提取物、小分子抑制剂等时，式中linker为端基含有羟基，羧基，及马来酰氨基团的任意化学键，通过化学反应与核酸适配体上的NH₂-，SH-等基团相连接；

式F

在一具体实施方式中，当核酸适配体为巯基修饰的核酸适配体，药物分子为mMMAE时，所述核酸适配体提供巯基，Linker的Y基团为马来酰亚胺，巯基与马来酰亚胺可以偶联形成化学键；linker的X基团提供羧基，药物mMMAE提供氨基，羧基与氨基可以偶联形成化学键。

在另一具体实施方式中，当核酸适配体为巯基修饰的核酸适配体，药物分子为vc-MMAE时，所述核酸适配体提供巯基，Linker的Y基团为马来酰亚胺，巯基与马来酰亚胺可以偶联形成化学键；linker的X基团提供羟基，药物vc-MMAE提供氨基，羟基与氨基可以偶联形成化学键。

式G

在一具体实施方式中，本发明还提供了所述的核酸偶联药物在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途，所述的肿瘤为具有PTK7表达的肿瘤。

其中，所述具有PTK7表达的肿瘤包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌，结直肠癌或肠癌，肝癌，非小细胞肺癌，胰腺癌，三阴乳腺癌，食管癌，鳞状上皮细胞癌，头颈癌，***癌等中的一种或几种。

本发明中，所述核酸适配体靶向药物既能靶向PTK7，又有强烈的杀伤肿瘤细胞的活性，能够明显的减少癌细胞的生长、迁移、浸润、骨转移，促进肿瘤细胞的凋亡等。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种靶向PTK7的药物组合物，所述药物组合物包含有上述任意一种所述核酸适配体或任意一种核酸适配体药物共聚物(如核酸适配体药物偶联物)，包含或不包含药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂中的一种或几种。

所述药物组合物选自外用制剂、口服制剂和注射制剂中的任意一种。其中，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂；所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种；所述注射制剂由修饰后的核酸适配体，助溶剂，和0.9％氯化钠溶液或注射用水组成。所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的任意一种或多种。

所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。

在一具体实施方式中，本发明提供上文所述修饰后的核酸适配体、共聚物、药物组合物中的用途，用于制备抑制肿瘤药盒。

在一具体实施方式中，本发明提供一种用于制备抑制肿瘤的药盒，该药盒中包括：

所述的药物组合物；或

所述的修饰后的核酸适配体；或

所述的共聚物。

在一个优选例中，所述的核糖核酸适配体其半衰期比非修饰形式的核糖核酸适配体长，或其稳定性比非修饰形式的核糖核酸适配体增强；

在一个优选例中，所述的化疗药物是MMAE或MMAF，且核酸适配体与MMAE或MMAF相偶联形成共聚物，共聚物中核酸适配体与MMAE或MMAF摩尔比为1:(6～20)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:(9～10)。

在一优选实施方式中，所述药物为MMAE或MMAF。

本发明还提供了一种***的方法，包括向有治疗需要的个体中施用有效量的上述修饰后的核酸适配体、含有所述修饰后的核酸适配体的共聚物、药物组合物等。

在一具体实施方式中，本发明提供了一种靶向结合PTK7的核酸适配体药物偶联物的制备方法，首先在核酸适配体的5’端连接上一段连接子，随后再将上述核酸适配体和药物分子进行孵育，摩尔浓度比例如可以是1:10，并以此获得所述核酸适配体药物偶联物——SGCR-YH。

更具体地，所述方法包括以下步骤：将120mg修饰后的DNA溶于24.50mL RNA-free水中，加入24.50mL磷酸盐缓冲液，涡旋振荡器混匀后加入溶解好的vc-MMAE(8eq，96mg，50.18mL DMSO)，室温下反应过夜(16h)，反应完后用3M NaCl(10mL)和无水乙醇(500mL)沉淀，留沉淀，加水溶解并过膜后进行HPLC纯化，得到所述核酸适配体药物偶联物——SGCR-YH。

本发明的发明人在研究的过程中，突破了以往对核酸进行稳定性修饰的常规思路，以所筛选的具有特定性质(包括碳链)的基团来修饰核酸适配体，得到了新结构的修饰后的核酸适配体，其不仅对核酸酶具有显著提高的稳定性，能够高特异性地、高亲和性地与人肿瘤在体内或体外结合，发挥抑制肿瘤的作用。其还能够与其它肿瘤治疗药物连接、偶联或聚合，实现更为优异的抑制肿瘤的作用。本发明还提高了抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，并且该修饰后的核酸适配体进入肿瘤细胞后，会在细胞质的作用下释放出药物分子，从而发挥抗肿瘤效果。

本发明中，多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还包括与本发明的核糖核酸适配体的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、或98％)相同性的多核苷酸，所述核酸也具有特异性结合人肿瘤细胞的功能。

本发明中，特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有特异性结合人肿瘤细胞的功能。

术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物组合物施用于所需治疗的对象。术语“有效量的”是指对于接受药物的对象而言，可以发挥核糖核酸适配体(或与之连接、偶联或聚合的抗肿瘤药物)药学活性的量。

本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用上述的药物、组合物、制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

根据对象的不同，这种有效量通常是本领域技术人员或临床医师根据所需用药的对象的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素可以评估的量。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

作为本发明的优选方式，所述的核酸进行了以提高靶向性、亲和性，延长药物循环时间等为目的的修饰。本发明人首次发现，本发明的修饰后的核糖核酸适配体能特异性地显著抑制肿瘤细胞的增殖、生长等，所述核糖核酸适配体将为***提供新的策略。尽管本发明人提供了较为优选的修饰方式，但是应理解，其它本领域中已应用的修饰核酸以提高其半衰期或稳定性的修饰方式也可被应用于本发明中。

本发明也涉及含有核糖核酸适配体的共聚物。通常，所述的共聚物包括所述的核糖核酸适配体以及与该核糖核酸适配体连接、偶联或聚合的抗肿瘤药物。本发明人发现，一些抗肿瘤药物与核糖核酸适配体形成共聚物后，所述的核糖核酸适配体具有很好的靶向特性，从而使得抗肿瘤药物能达到肿瘤部位，与所述的核糖核酸适配体共同发挥抑制肿瘤作用。

所述的抗肿瘤药物通常是对于肿瘤有抑制作用的药物，且该抗肿瘤药物能够与核酸发生较为稳定的连接(含偶联)。所述治疗药物本身可不具有靶向人肿瘤的靶向性，但是其通过与本发明修饰后的核糖核酸适配体连接、偶联或聚合，可以良好地达到肿瘤部位。尽管没有一一列举，但是一些可以预期到能够与本发明的核糖核酸适配体相连接、偶联或聚合的抗肿瘤药物均可应用于本发明中。

在一具体实施例中，采用了MMAE或DM1与所述的核糖核酸适配体进行偶联形成核酸偶联药物。该核酸偶联药物中，所述核酸适配体与MMAE或DM1的摩尔比例如可以是1:(2～20)。

因此，本发明人首次揭示了所述修饰后的核糖核酸适配体与药物分子形成共聚物，用于治疗人肿瘤的策略。所述共聚物，其能在体内外高效地抑制人肿瘤的增殖。所述共聚物比单独的核酸适配体和单独的药物对肿瘤增殖的抑制活性都强。

在一具体实施方式中，本发明提供上文所述修饰后的核酸适配体、共聚物、或药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤的药盒。

所述的药物组合物；或

所述的修饰后的核酸适配体；或

所述的共聚物。

为了便于临床医师以及用药对象的应用，所述的药盒中还可包括使用说明书或药品说明书。

本发明还涉及应用于抑制肿瘤的药盒，为了便于临床医师以及用药对象的应用，所述的药盒中还可包括使用说明书或药品说明书。

根据本发明，只要使用所述修饰基团修饰核酸适配体即可提高所述核酸适配体的核酸酶稳定性、靶向性、亲和性等，而对于修饰的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物的位置以及个数并没有特别的限制。根据本发明一种优选的实施方式，用修饰基团修饰至少1个核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。根据本发明一种优选的实施方式，用所述修饰基团修饰全部如核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。

根据本发明一种具体的实施方式，可以用所述修饰基团修饰1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个如式II所示的核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。

如上仅是列举了所述修饰基团修饰核酸适配体的个数，取代的个数可以根据需要进行调整。在本发明一个优选实施方式中，用所述修饰基团仅修饰一个核酸适配体中相应的碱基或者碱基与脱氧核糖或核糖形成的偶合物。在本发明一个优选实施方式中，用所述修饰基团修饰5’或3’碱基。

本发明的其中一种有益效果在于：本发明的PTK7核酸适配体具有：(1)能选择性的结合PTK7阳性的肿瘤细胞，而与PTK7阴性的细胞结合较弱；(2)优选地可以直接携带细胞毒性药物例如MMAE，选择性的结合并杀伤PTK7阳性的肿瘤细胞。

本发明所述修饰后的核酸适配体没有毒性，具有优良的生物相容性；所述核酸适配体分子量小，具有较好的细胞渗透性，易于吸收；所述核酸适配体的特殊空间构象使其具有较好的结构稳定性，不易被体内的生物酶降解。这些特性使得核酸适配体在生物医学检测、肿瘤标志物发现、肿瘤临床治疗中都会有重要的应用前景。

在一具体实施方式中，本发明提供的修饰基团是通过在核苷酸序列的5’端连接上所述修饰基团，经修饰后的核酸适配体可以直接携带细胞毒性药物(如MMAQ)，选择性的杀伤PTK7阳性的肿瘤细胞。

在本发明其中实施方案中，以经典化疗药物例如MMAE、DM1偶联核酸适配体，并确证其确有较好的细胞毒性作用，而且由于核酸适配体可以选择性的结合PTK7阳性的肿瘤细胞，而与PTK7阴性的细胞结合较弱，因此本发明的又一方面，提供的适配体作为PTK7阳性的肿瘤化疗靶向药物载体的应用，将化疗药物结合于核酸适配体上，进行肿瘤放化疗时，可以选择性地杀伤PTK7阳性的肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒性。

根据一个实施方式，本发明核酸适配体、共聚物或药物组合物可以作为联合治疗的一部分施用。因此本发明范围内的实施方式包括共施用除了作为活性成分的本发明核酸适配体、共聚物或药物组合物之外，包含额外的治疗剂和/或活性成分的组合物和药物。这种多药物疗法(通常称为联合治疗)可用于治疗和/或预防任何PTK7受体相关的疾病或病症，尤其是上述定义的那些。

因此，本发明的治疗方法和药物组合物可以以单一疗法的形式使用本发明核酸适配体、共聚物或药物组合物，但是所述方法和组合物也可以综合疗法的形式使用，其中将一种或多种核酸适配体、共聚物或药物组合物与一种或多种其他的治疗剂组合而共施用。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1：核酸适配体偶联药物MMAE的合成：

本实施例所采用的巯基修饰后的核酸适配体结构如下式II所示(修饰后的核酸适配体的3’端末端由反向T碱基(inverted dT)合成)：

式II

R1为H或者PO3^–-CnH2n+1，n为0-24；优选地，n为10-20；进一步优选地，n为12-18。

R2为PO3^-、羧基、马来酰胺或叠氮基团。

x为1-24；优选地，x为1-8或4-24；

y为1-6；优选地，y为2-3；进一步优选地，y为1。

Aptamer为巯基修饰的核苷酸分子(修饰后的核酸适配体的3’端末端由反向T碱基(inverted dT)合成)。

其中，当R为H，x为6，y为2时，Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(其中，巯基修饰在核酸适配体的3’或5’端位置)，得到的修饰后的核酸适配体标记为2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR4。

其中，当R为PO₃ ^–-C_nH_2n+1，n为18，x为6，y为2，Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(其中，巯基修饰在核酸适配体的3’或5’端位置)，得到的修饰后的核酸适配体标记为C18-2spacer18-SGC8-inverted-dT，并记作SGCR5。

核酸适配体通过vc偶联MMAE实验操作流程示意如下：

得到的核酸适配体偶联药物的结构如下：

将120mg修饰后DNA(SGCR4或SGCR5)溶于24.50mL纯化水中，加入24.50mL磷酸盐缓冲液，涡旋振荡器混匀后加入溶解好的vc-MMAE(8eq，96mg，50.18mL DMSO)，室温下反应过夜(16h)，反应完后用3M NaCl(10mL)和无水乙醇(500mL)沉淀，留沉淀，加水溶解并过膜后进行HPLC纯化后得到vc-MMAE的偶联药物(SGCR4-vc-MMAE(YH2502)或SGCR5-vc-MMAE(YH2504))，纯化收率约为4 6％。

其中，YH2502:所述核酸适配体SGCR4与药物MMAE通过vc连接时，相对应的核酸适配体偶联药物标记为2spacer18-SGC8-inverted-dT-vc-MMAE，记作：SGCR4-vc-MMAE(YH2502)。

YH2504:所述核酸适配体SGCR5与药物MMAE通过vc连接时，相对应的核酸适配体偶联药物标记为C18-2spacer18-SGC8-inverted-dT-vc-MMAEC18-2spacer18-SGC8-inverted-dT-vc-MMAE，并记作SGCR5-vc-MMAE(YH2504)。

实施例2：核酸适配体偶联药物DM1的合成：

10.42mg DNA(SGCR3:2spacer18-SGC8-inverted-dT)溶解在7.721mL水中，然后加入6.176mL PB缓冲液(pH＝8)，然后加入事先溶解好的药物DM1-SMCC(24.83mg，30eq，18.53mL DMSO)，37℃反应16小时。平行投8批共84.37mg DNA原料，然后合并，直接进样纯化，纯化体系是(50mM TEAA in water,CH3CN)。馏分冻干之后，用脱盐柱(葡萄糖凝胶G-25)脱盐，重复脱盐3次得到偶联药物DM1-SGCR4 90mg，纯度99.5％。

实施例3：核酸适配体修饰前后对细胞亲和性比较。

HCT116细胞培养24小时后，用无酶细胞消化液或0.04％的EDTA消化液将细胞消化下来，收集离心(每分钟转速1300rpm，5min)。然后，250nM荧光标记的样品Random、SGC8、SGCR4和SGCR5分别与2.5×10⁵个细胞在结合缓冲液(BB)中孵育。孵育条件为4℃，时间为45分钟；孵育完毕，用洗涤缓冲液WB洗涤细胞三次，在流式细胞仪上检测，Flowjo软件分析实验数据。

洗涤缓冲液(WB)和结合缓冲液(BB)配方如下：WB配方：DPBS加入5mM MgCl₂，4.5mg/mL葡萄糖(在4℃可保存2个月)；BB配方：洗涤缓冲液中加入0.1mg/mL tRNA和1mg/mL牛血清白蛋白(在4℃可保存1个月)。

HCT116为结肠癌细胞；Random为随机酸适序列；SGC8为化学修饰前的核酸序列。SGCR4和SGCR5为两种修饰后的核酸适配体。结果如图1流式细胞数据所示，SGCR4和SGCR5的荧光峰向右偏移更多，表明，与细胞结合的量增多，亲和力更高，而对照Random和SGC8的荧光相对减弱，这表明，修饰后核酸适配体对靶细胞HCT116的亲和力增强。

实施例4：核酸适配体修饰前后小鼠活体成像。

将0.1mL(10×10⁶cells)NCI-H446细胞皮下接种于6－8周龄BALB/c雌性小鼠的右后背。肿瘤生长约10-15天，平均体积达到300-500mm³，开始给药，采用V＝(a*b²)/2公式计算肿瘤体积，其中V为肿瘤体积，a为肿瘤长度、b为肿瘤宽度。两个组，分别为Cy5修饰的SGC8和SGCR4。分别溶于DPBS，10uM，100ul/只，尾静脉注射。注射后，在4个时间点2.0，3.0，4.0，5.0小时，用小动物活体成像仪(Lumina XR)成像，观察不同时间点小鼠各个器官和肿瘤的Cy5荧光，波长为：Ex：620±5nm；em：670±5nm。在最后时间点(5.0小时)取小鼠进行组织解剖，并取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾进行成像。

结果如图2所示，相比修饰前核酸适配体处理的小鼠，修饰后核酸适配体处理的小鼠，肿瘤部位能观察到非常明显的Cy5荧光，荧光在其他器官中聚集减少。注射后第3，4，5个小时这三个时间点观察，得到修饰前核酸适配体处理的小鼠肿瘤部位的荧光代谢消失，而修饰后核酸适配体处理的小鼠的肿瘤部位仍能观察到强的荧光。这表明，修饰后的核酸适配体肿瘤靶向性更强，在瘤内滞留时间更长。也就是说，该修饰提高了核酸适配体代谢半衰期，使得荧光能长时间聚集在肿瘤内。

实施例5：核酸适配体偶联药物的细胞毒性实验。

在6种细胞系(NCI-H446，HCT116，MDA-MB-231，OVCAR3，PANC-1)中进行细胞毒性实验。

将细胞接种于96孔板中(5×10⁴个/mL)，培养16小时后，去除培养基，分别将实施例1制备的核酸偶联药物分子(YH2502和YH2504)用培养基配制成不同的浓度，药物的终浓度范围为1uM到0.15nM，以2倍稀释梯度，加入细胞孵育48小时后，去除培养基，加入CCK-8试剂，孵育1h，在酶标仪上检测(450nm处吸光度)，用Graphpad prism 7处理数据，拟合IC50曲线。当细胞活性抑制浓度为50％时，药物使用的浓度越低则表示毒性越大。结果如图3所示，核酸偶联药物对NCI-H446和OVCAR3的毒性最大，IC50值最小。

实施例6：核酸偶联药物对非小细胞肺癌NCI-H446的体内抗癌效果评价。

将0.1mL(10×10⁶cells)NCI-H446细胞皮下接种于6－8周龄BALB/c雌性小鼠的右后背。肿瘤生长约10-15天，平均体积达到130mm³，即约6*6*6mm时，开始给药，采用V＝(a*b²)/2公式计算肿瘤体积，其中V为肿瘤体积，a为肿瘤长度、b为肿瘤宽度。将动物分成3个组，每组8只，分别为vc-MMAE，YH2502和YH2504，其中YH2502和YH2504分别代表两种核酸偶联药物(YH2502:SGCR4-vc-MMAE；YH2504:SGCR5-vc-MMAE)。给药剂量(vc-MMAE为0.266mg/kg，YH2502和YH2504：3mg/kg)，200ul/只，进行尾静脉注射，每两天注射一次。监测小鼠体重和肿瘤体积，两周之后，结束治疗。结果如图4和5所示。治疗后小鼠肿瘤体积的变化(图4)，YH2502(SGCR4-vc-MMAE)和YH2504(SGCR5-vc-MMAE)药物处理组的肿瘤体积减小，比vc-MMAE处理的小鼠肿瘤体积明显减小。治疗后小鼠肿瘤体重的变化(图5)不明显。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种靶向PTK7的核酸适配体修饰结构及其偶联药物、制备方法和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacaggttct ggggggtggg tggggaacct gtt 33

Claims

1.一种对核酸适配体进行修饰的方法，其特征在于，所述方法包括对核酸适配体采用如下式I基团进行修饰，获得修饰后的核酸适配体：

其中，R1为H或者PO3^–-C_nH_2n+1，n为0-24；

R2为PO3^-、羧基、马来酰胺或叠氮基团；

x为1-24；y为1-6。

2.一种修饰后的核酸适配体，其特征在于，其结构如式II：

其中，R1为H或者PO3^–-C_nH_2n+1，n为0-24；

R2为PO3^-、羧基、马来酰氨或叠氮基团；

x为1-24；y为1-6；Aptamer为核酸适配体。

3.如权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，

当R2为PO3^-时，x为1-8，y为1-6时，R2通过O与Aptamer连接；

当R2为羧基，马来酰胺或叠氮基团时，分别通过Aptamer上的氨基，巯基，炔基或DBCO进行连接，x为4-24，y为1；

所述核酸适配体选自核苷酸分子或核苷酸类似物；

其中，所述核苷酸分子选自双链核苷酸分子，单链核苷酸分子；所述单链核苷酸分子选自cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反义RNA、核酶、非编码RNA、反义寡核苷酸；

所述核苷酸类似物选自可以和核苷酸分子或核酸类结构分子结合后起调控功能的核酸类似物，核苷酸分子或核酸类结构分子的部分改造的肽核酸、纳米核酸、锁核酸、核酸蛋白，或核苷酸分子或核酸类结构分子被取代获得的硫代核苷酸、2′-甲氧基核苷酸、2′-氟代核苷酸、磷酸化的核苷酸、甲基化的核苷酸、氨基化的核苷酸、巯基化的核苷酸、生物素化的核苷酸、荧光标记的核苷酸、酶标记的核苷酸、纳米发光材料标记的核苷酸、叶酸标记的核苷酸、同位素化的核苷酸、PEG修饰的核苷酸、经PEG-脂质体混合物包埋的核酸适配体；或核苷酸分子与其他功能核苷酸，功能多肽，功能蛋白，抗体其一或组合以化学偶联或组装形式结合形成的核酸衍生物。

4.如权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列选自以下任意一种：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

SGC8：5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’(SEQ IDNO.1)；

PD-L1：5'-TAC AGG TTC TGG GGG GTG GGT GGG GAA CCT GTT-3’(SEQ ID NO.2)；

(2)与(1)中所述核苷酸序列的同一性在90％以上，且具有相同/相似特异性结合人肿瘤细胞功能的核苷酸序列；

(5)与(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(6)(1)-(4)任一限定的所述核苷酸序列转录的RNA序列；

(8)(1)-(4)任一限定的核苷酸序列与其他功能核苷酸，功能多肽，功能蛋白，抗体以化学偶联或组装形式结合形成的核酸衍生物的序列。

5.如权利要求2所述的核酸适配体的应用，其特征在于，选自以下用途中的一个或多个：

用于作为药物载体中的用途；

用于药物设计与开发中的用途；

用于研究肿瘤细胞表面蛋白中的用途；

用于药物分离与纯化中的用途；

用于制备共聚物、生物制品中的用途。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸适配体用于制备靶向PTK7的药物或用于治疗具有PTK7表达的肿瘤的药物中的用途。

7.一种共聚物，其特征在于，所述共聚物包含如权利要求2所述的核酸适配体和药物分子，所述核酸适配体和药物分子通过偶联、聚合、附着的方式中的一种或几种进行连接。

8.如权利要求7所述的共聚物，当所述核酸适配体和药物分子通过偶联方式连接时，所述共聚物为核酸偶联药物；其中，所述核酸偶联药物是靶向于PTK7的核酸偶联药物SGCR-YH，其特征在于，所述核酸偶联药物由修饰后的核酸适配体片段、药物片段和连接子组成，其具有如下式III所示的结构：

式中R-Aptamer为如权利要求2所述的修饰后的核酸适配体，各基团定义同权利要求2所述；

R3为药物片段；linker为连接子。

9.如权利要求7所述的共聚物，其特征在于，所述药物为细胞毒性药物，选自核苷类似物和碱基类似物、代谢类药物、高活小分子、生物碱、中药提取物、小分子抑制剂、植物碱类、抗肿瘤小分子靶向药物、核酸药物、蛋白药物中的一种或几种。

10.如权利要求7所述的共聚物，其特征在于，所述药物为MMAE、MMAF、PBD二聚体、DM1或DM4中的一种或几种。

11.如权利要求7所述的共聚物在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途，其特征在于，所述的肿瘤为具有PTK7表达的肿瘤。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述具有PTK7表达的肿瘤选自乳腺癌，卵巢癌，胃癌，肠癌，非小细胞肺癌肝癌，胰腺癌，三阴乳腺癌，食管癌，鳞状上皮细胞癌，头颈癌或***癌中的一种或几种。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求2所述的核酸适配体或如权利要求7所述的共聚物，以及药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂中的一种或几种。