CN115725432A

CN115725432A - 一种可降解原油重组分产表面活性剂的不动杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115725432A
Application number: CN202111011749.2A
Authority: CN
Inventors: 许颖; 宋文枫; 周明辉; 田茂章; 吕伟峰; 魏小芳; 王璐; 黄佳; 邹新源; 吕建荣; 张德富
Original assignee: Petrochina Co Ltd
Current assignee: Petrochina Co Ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN115725432B

Abstract

本发明提供了一种可降解原油重组分产表面活性剂的不动杆菌及其应用。本发明首先提供了一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)，其保藏编号为CGMCC No.17233。本发明的不动杆菌CGMCC No.17233能够降解原油重质组分，产生生物表面活性剂，具有较高的洗油效率，可应用于微生物吞吐/微生物驱油提高原油采收率、微生物清防蜡、发酵生产生物表活剂/乳化剂和原油环境污染修复等。

Description

一种可降解原油重组分产表面活性剂的不动杆菌及其应用

技术领域

本发明是关于一种可降解原油重组分产表面活性剂的不动杆菌(Acinetobactersp.)及其应用，具体是指一种分离自油藏环境中的、与溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus)近似的新的不动杆菌株系及其相关应用。

背景技术

石油是目前最重要的能源物质，支撑全球能量消耗的30％以上，并可能持续增长。石油由古代生物遗骸封存于地层中、经历复杂的变化形成。石油开采过程分为多个阶段，在最初阶段，原油依靠原始的地层压力从油藏流向地面，称为一次采油。随着原始地层能量的消耗，需要人为向油藏中注水，补充地层能量，以维持原油采出，称为二次采油。经过一次和二次采油，仍有大量原油滞留于地下，据估计采收率仅为30～50％，亟需新型的接替技术。微生物采油技术(Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR)，包括微生物吞吐和微生物驱油技术，是一种新型的三次采油技术。利用微生物直接作用或其代谢产物改善原油物性，达到提高采收率的目的，具有低成本、无污染的优势。在微生物采油技术中，选用的采油菌种对于应用效果具有关键作用。针对我国大多数油田为陆相沉积生油、石蜡等重质组分含量较高影响开采的问题，具有重质组分降解能力的菌株具有广阔的应用前景。

微生物能生成多种多样的两亲性分子辅助细胞摄取疏水烃类营养物质，或实现可控的吸附/解吸附过程。这些两亲分子具有良好的界面活性，同时具有环保无污染的优势，在提高原油采收率和原油环境污染修复中具有重要的应用价值。这类界面活性物质大致可分为低分子量和高分子量两类。分子量较低的一类，具有表面活性剂作用，称为生物表面活性剂，可有效降低原油表面张力和油-水界面张力，从而有效降低毛细管力、驱动孔隙中的剩余油。这类分子还能吸附于固体介质颗粒表面，有效剥离油膜、提高流动性。生物表活剂一般在较低浓度下即可有效降低界面张力，并且具有较强的稳定性，具有很广的pH适应范围和温度、盐度适应范围。微生物生成的另一类分子量较高的两亲化合物，称为生物乳化剂，降低界面张力的作用不明显，一般也不会吸附于岩石表面，但具有较强的乳化作用，能有效稳定油水乳液，以水包油的状态为主，可降低原油黏度、提高原油流动性，促进剩余油采出。表面活性物质也可提高疏水原油在水中的溶解度，有利于微生物对原油组分的降解，促进被原油污染土壤的微生物修复。

因此此类采油菌株在提高原油采收率和原油环境污染修复中具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一个新的采油功能菌株，用于提高原油采收率或原油环境污染修复。

根据本发明的具体实施方案，本发明提供了一株不动杆菌(Acinetobacter sp.)，本发明中亦命名为X006，其是从吉林油田油井采出液中分离得到的油藏内源微生物，该菌株已进行保藏，保藏日期：2019年01月25日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏编号：CGMCC No.17233；分类命名：溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)。需要说明的是：经鉴定，本发明的菌株X006(即保藏编号CGMCC No.17233的菌株)是一个新的不动杆菌株系，由于现有技术的不动杆菌菌株中与本发明的X006的16S序列最接近的为溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)，相似性为99％，保藏证明中将其建议的分类命名暂时写为溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus)。严谨地说，本发明的菌株X006为不动杆菌(Acinetobacter sp.)属。经查，未见分离自油藏环境中的Acinetobacter haemolyticus近似种的现有技术报道。

本发明提供的不动杆菌X006菌株具有较强的重质组分降解能力。X006在涂布原油的固体培养基表面生长，可形成大面积的降解斑。X006菌株与原油共培养，可显著降低重质组分特别是C₁₃～C₃₁的含量。X006菌株还具有很强的产高效表面活性物质/乳化剂的能力，具有较高的洗油效率，可用于微生物吞吐/微生物驱油提高原油采收率、采油井口清防蜡、治理原油环境污染等应用。

从而，本发明还提供了一种不动杆菌制剂，该不动杆菌制剂中含有保藏编号为CGMCC NO.17233的不动杆菌，其为固态或液态菌制剂。

本发明中，X006菌株的保存、复苏、种子液的制备、菌制剂的制备参照不动杆菌领域的常规操作。

本发明还提供了一种生物驱油/洗油剂，其是本发明的所述不动杆菌或所述的不动杆菌制剂发酵产生的。该生物驱油/洗油剂既可以用于驱油，也可以用于洗油。在一些具体实施方案中，所述生物驱油/洗油剂为所述不动杆菌或所述的不动杆菌制剂在LB培养液中培养1～7天的发酵产物或发酵上清液。本发明的X006菌株的适宜发酵温度可为25～40℃，最适温度为30℃。更具体地，X006菌株种子液在培养液中的接种量可为0.5％-3％，发酵培养时间优选为32小时-96小时。经检测，本发明的X006发酵产物中含有强活性的表面活性物质(包括但不限于糖脂类、脂肽类以及复杂混合物类生物表面活性剂)/乳化剂(包括但不限于脂多糖类、脂蛋白类、两亲性多糖以及复杂混合物类生物乳化剂)。

本发明还提供了一种制备生物表面活性剂或生物乳化剂的方法，该方法包括：将所述不动杆菌或所述的不动杆菌制剂在培养基中发酵培养，产生生物表面活性剂或生物乳化剂。优选地，所述培养基为LB培养液。在以本发明的X006制备生物表面活性剂或生物乳化剂时，X006菌株种子液在培养液中的接种量可为0.5％-3％，发酵培养1～7天优选32小时-96小时。发酵产物可根据需要离心去除菌体，得到发酵上清液备用。

本发明还提供了所述的不动杆菌、所述的不动杆菌制剂或所述的生物驱油/洗油剂在降解原油重质组分和/或修复原油重质组分污染环境中的应用。

本发明还提供了所述的不动杆菌、所述的不动杆菌制剂或所述的生物驱油/洗油剂在降低原油黏度和/或降低原油的油水界面张力中的应用。

本发明还提供了所述的不动杆菌、所述的不动杆菌制剂或所述的生物驱油/洗油剂在微生物吞吐和/或微生物驱油提高原油采收率中的应用。

本发明还提供了所述的不动杆菌、所述的不动杆菌制剂或所述的生物驱油/洗油剂在微生物清防蜡中的应用。

综上所述，本发明提供的不动杆菌株系X006具有很强的重质组分降解能力和产高效表面活性物质的能力。一方面，不动杆菌X006能有效降低原油中的重质组分含量、增加轻质组分含量，从而降低原油黏度、提高原油的流动能力，促进剩余油采出；另一方面，不动杆菌X006代谢产生的高效表面活性物质能有效降低油水界面张力，发挥剥离油膜、稳定油水混合状态的作用，促进剩余油采出。这两方面的综合作用优势说明不动杆菌X006在提高原油采收率领域具有巨大的应用潜力。同时，不动杆菌X006有效降解石蜡的能力使其在采油井口清防蜡方面具有巨大的应用潜力。有效降解原油组分，同时产表面活性物质提高原油溶解度从而加速原油降解，两方面作用表明不动杆菌X006在治理原油环境污染领域具有巨大的应用潜力。不动杆菌X006产高效表面活性物质的能力表征其在工业发酵生产生物表面活性剂/生物乳化剂领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不动杆菌X006在涂布原油的固体培养基表面生长7天后形成的降解斑

图2为不动杆菌X006处理后原油中各个碳数组分的含量变化

图3为2μL不动杆菌X006发酵液形成的排油圈

用于专利程序的微生物保藏：

本发明的不动杆菌X006：

保藏日期：2019年01月25日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；

保藏编号：CGMCC No.17233；

分类命名：溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。各实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领域的常规条件操作。X006菌株的保存、复苏、种子液的制备参照不动杆菌的常规操作。

实施例1、不动杆菌X006的分离筛选与分子鉴定

1.富集培养和分离纯化

取吉林油田典型高凝油区块井口产出液，按5％接种量转接入无机盐培养基，培养基配方为：K₂HPO₄ 10g/L,NaH₂PO₄ 5g/L,(NH₄)₂SO₄ 2g/L,MgSO₄ 0.2g/L,CaCl₂3mg/L,FeSO₄2mg/L，添加固体石蜡片作为唯一碳源。在30℃条件下，150r/min振荡培养3～4天。培养物做10²、10³和10⁴倍梯度稀释后均匀涂布在预先涂布原油的固体培养基表面，在30℃条件下，静置培养3天。挑选出降解斑较大的单菌落，采用平板划线的方法分离出纯化菌株。本发明中分离得到一株纯化菌株X006。

图1为不动杆菌X006在涂布原油的固体培养基表面生长7天后形成的降解斑。可以看出本发明的不动杆菌X006具有优异的降解原油的能力。

2.分子鉴定

以纯化菌株的基因组DNA为模板，采用通用引物27F和1492R进行PCR扩增取得16SrDNA序列片段。采用20μL体系，反应参数为：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃60s，30个循环；72℃10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测验证。验证后进行纯化。经过纯化的PCR扩增产物用于sanger测序。

X006的16S rDNA序列如下SEQ ID No.1所示：

SEQ ID No.1：

AGACTACCTACTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGGCTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGRAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTACCTCAGCGTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATACTCTAGCTGACCAGTATCGAATGCAATTCCTAAGTTAAGCTCAGGGATTTCACATCCGACTTAATCAGCCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTCGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAGAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCAAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTCCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGGAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAGG

将测序数据与公开数据库中的基因组序列比对，确定X006为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，是一个新的不动杆菌株系，公开数据库中与本发明的X006的16S序列最接近的为溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)，相似性为99％。

本发明的不动杆菌X006已进行保藏，保藏日期：2019年01月25日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏编号：CGMCC No.17233；分类命名：溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)。

实施例2、不动杆菌X006降解原油重质组分

本发明提供的不动杆菌X006菌株具有较强的重质组分降解能力。在涂布原油的固体培养基表面生长7天后，可形成大面积的降解斑(图1)。

将X006接种于LB液体培养基(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物)中，30℃条件下，150r/min振荡培养48h，得到不动杆菌X006培养物。100mL无机盐培养基(K₂HPO₄10g/L,NaH₂PO₄ 5g/L,(NH₄)₂SO₄ 2g/L,MgSO₄ 0.2g/L,CaCl₂ 3mg/L,FeSO₄ 2mg/L)中添加灭菌原油4mL，转接入不动杆菌X006培养物1mL，于30℃条件下静置培养。14d后用气相色谱分析，分析结果参见图2。当以姥鲛烷(Pr)作为内参时，结果显示出原油重质组分C₁₃～C₃₁均有降解，即包括十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十二烷、二十三烷、二十四烷、二十五烷、二十六烷、二十七烷、二十八烷、二十九烷、三十烷、三十一烷。C₁₃～C₃₁降低幅度为2.8％～11.7％，降解峰集中在C₂₁～C₂₅，其中以对C₂₃的降低能力最强。以植烷(Ph)作为内参的情况与Pr一致。X006的降解谱与其他已公开的不动杆菌菌株相比更宽，能降解的碳数高至C₃₁。

实施例3、不动杆菌X006降低原油黏度测试

本实施例中，用不动杆菌X006处理高凝原油，检测此纯化菌株对原油黏度的降低程度。具体做法如下：先将X006接种于LB液体培养基(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物)中，30℃条件下，150r/min振荡培养48h，得到不动杆菌X006培养物。100mL无机盐培养基(K₂HPO₄ 10g/L,NaH₂PO₄ 5g/L,(NH₄)₂SO₄ 2g/L,MgSO₄0.2g/L,CaCl₂ 3mg/L,FeSO₄ 2mg/L)中添加灭菌高凝原油4mL，转接入不动杆菌X006培养物1mL，于30℃条件下静置培养。14d后，使用Thermofisher MarsⅡ流变仪测定原油黏度。结果显示，原油黏度由未处理时的3341mPa·s降低至2661mPa·s，降低了20％。

实施例4、不动杆菌X006降低油水界面张力测试

本实施例中，检测不动杆菌X006菌株及其代谢产物对油水界面张力的影响。具体做法如下：先将X006接种于LB液体培养基中，30℃条件下，150r/min振荡培养32h，得到不动杆菌X006培养物。100mL无机盐培养基(K₂HPO₄ 10g/L,NaH₂PO₄ 5g/L,(NH₄)₂SO₄ 2g/L,MgSO₄0.2g/L,CaCl₂ 3mg/L,FeSO₄ 2mg/L)中添加灭菌高凝原油4mL，转接入不动杆菌X006培养物1mL，于30℃条件下静置培养。14d后，采用悬滴法测定油水界面张力。执行行业标准SY/T5370-1999。采用TX500C界面张力仪。在实验温度30℃条件下，未经处理原油的油水界面张力高，超出了测定范围。X006处理后，油水界面张力降低至3.4mN/m，为低界面张力水平。

实施例5、不动杆菌X006产生生物表面活性剂

将X006种子液按照1％接种量接种于LB液体培养基中(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物)，30℃条件下，150r/min振荡培养48h。培养液去除菌体，具体做法是12000rpm离心20分钟，取上清液。上清液用6mol/L盐酸调节pH至2.0，加入等体积乙酸乙酯萃取2次。有机相加无水硫酸钠干燥处理，蒸馏去除有机溶剂后得到表面活性剂产物。将表面活性剂产物用DMSO助溶后制成100mg/L水溶液。采用Biolin光学接触角张力测量仪测定表面张力，表面张力值低至28.9mM/m。普遍低于已公开的其他不动杆菌菌株。

将X006种子液按照1％接种量接种于LB液体培养基中(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物)，30℃条件下，150r/min振荡培养72h，培养液12000rpm离心20分钟去除菌体，用最直观的排油圈法检测发酵液中的表面活性物质。表面活性物质与疏水石蜡油作用形成排油圈，排油圈直径越大说明表面活性越强。取2μL发酵液滴于苏丹红染色的石蜡油中央，可迅速形成直径5cm的排油圈(图3)，显示X006具有很强的产表面活性物质的能力。

实施例6、不动杆菌X006的洗油效率

将X006种子液按照1％接种量接种于LB液体培养基中(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物)，30℃条件下，150r/min振荡培养32h。检测培养液的洗油效率。采用粒径0.35-0.55mm石英砂制备油砂，方法是石英砂水洗干净并烘干，按照油与砂1:5混合，烘箱60℃老化24小时。50mL培养液与15g油砂混合，震荡混匀，置于60℃烘箱中，24小时后取出。倾倒尽上层液体后，用蒸馏水反复冲洗至水相无色。油砂烘干后称量剩余质量，计算出洗油效率为61.2％。

序列表

<110> 中国石油天然气股份有限公司

<120> 一种可降解原油重组分产表面活性剂的不动杆菌及其应用

<130> GAI21CN1813

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 不动杆菌（Acinetobacter sp.）

<400> 1

agactaccta cttctggtgc aacaaactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60

cgggaacgta ttcaccgcgg cattctgatc cgcgattact agcgattccg acttcatgga 120

gtcgagttgc agactccaat ccggactacg atcggctttt tgagattagc atcctatcgc 180

taggtagcaa ccctttgtac cgaccattgt agcacgtgtg tagccctggt cgtaagggcc 240

atgatgactt gacgtcgtcc ccgccttcct ccagtttgtc actggcagta tccttaaagt 300

tcccggctta acccgctggc aaataaggaa aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtatgtaag ttcccgaagg 420

caccaatcca tctctgraaa gttcttacta tgtcaagacc aggtaaggtt cttcgcgttg 480

catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc atttgagttt 540

tagtcttgcg accgtactcc ccaggcggtc tacttatcgc gttagctgcg ccactaaagc 600

ctcaaaggcc ccaacggcta gtagacatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat 660

cctgtttgct ccccatgctt tcgtacctca gcgtcagtat taggccagat ggctgccttc 720

gccatcggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct acacctggaa ttctaccatc 780

ctctcccata ctctagctga ccagtatcga atgcaattcc taagttaagc tcagggattt 840

cacatccgac ttaatcagcc gcctacgcac gctttacgcc cagtaaatcc gattaacgct 900

cgcaccctct gtattaccgc ggctgctggc acagagttag ccggtgctta ttctgcgagt 960

aacgtccact atctctaggt attaactaga gtagcctcct cctcgcttaa agtgctttac 1020

aaccaaaagg ccttcttcac acacgcggca tggctggatc aggcttccgc ccattgtcca 1080

atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggcgg 1140

atcatcctct cagacccgct acagatcgtc gccttggtag gcctttaccc caccaactag 1200

ctaatccgac ttaggctcat ctattagcgc aaggtccgaa gatcccctgc tttctcccgt 1260

aggacgtatg cggtattagc attcctttcg gaatgttgtc ccccactaat aggcagattc 1320

ctaagcatta ctcacccgtc cgccgctagg 1350

Claims

1.一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)，其保藏编号为CGMCC No.17233。

2.一种不动杆菌制剂，该不动杆菌制剂中含有保藏编号为CGMCC NO.17233的不动杆菌，其为固态或液态菌制剂。

3.一种生物驱油/洗油剂，其是权利要求1所述不动杆菌或权利要求2所述的不动杆菌制剂发酵产生的。

4.根据权利要求3所述的生物驱油/洗油剂，所述生物驱油/洗油剂为权利要求1所述不动杆菌或权利要求2所述的不动杆菌制剂在LB培养液中培养1～7天的发酵产物或发酵上清液。

5.一种制备生物表面活性剂或生物乳化剂的方法，该方法包括：将权利要求1所述不动杆菌或权利要求2所述的不动杆菌制剂在培养基中发酵培养，产生生物表面活性剂或生物乳化剂；优选地，所述培养基为LB培养液，培养1～7天。

6.权利要求1所述的不动杆菌、权利要求2所述的不动杆菌制剂或权利要求3-4任一项所述的生物驱油/洗油剂在降解原油重质组分和/或修复原油重质组分污染环境中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述原油重质组分包括C₁₃～C₃₁中的一种或多种。

8.权利要求1所述的不动杆菌、权利要求2所述的不动杆菌制剂或权利要求3-4任一项所述的生物驱油/洗油剂在降低原油黏度和/或降低原油的油水界面张力中的应用。

9.权利要求1所述的不动杆菌、权利要求2所述的不动杆菌制剂或权利要求3-4任一项所述的生物驱油/洗油剂在微生物吞吐和/或微生物驱油提高原油采收率中的应用。

10.权利要求1所述的不动杆菌、权利要求2所述的不动杆菌制剂或权利要求3-4任一项所述的生物驱油/洗油剂在微生物清防蜡中的应用。