CN111748483A

CN111748483A - 一株石油烃降解芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111748483A
Application number: CN201910247320.XA
Authority: CN
Inventors: 史荣久; 孙惠春; 张颖; 韩斯琴
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN111748483B

Abstract

本发明属于环境微生物学、生物修复技术领域，具体涉及一株石油烃降解芽孢杆菌PL‑10及其应用。菌株为芽孢杆菌属Bacillus的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL‑10),其已于2019年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17302。本发明所述的具有石油烃类降解兼产生物表面活性剂的菌株PL‑10用途为以微生物强化的方式降解含油污泥中的石油烃类，用于油田含油污泥的处理；使用本发明菌株PL‑10，同时辅以营养液，可以有效去除含油污泥中的石油烃类污染物，具有高效、成本低、环境友好等优点。

Description

一株石油烃降解芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物学、生物修复技术领域，具体涉及一株石油烃降解芽孢杆菌PL-10及其应用。

背景技术

石油是人类社会工业发展所倚重的能源与化工原料。自20世纪以来，全球对石油的需求量与日俱增。在油田勘探、油田开发及原油炼制、原油输运等工业过程中会产生大量由原油、水、泥砂等物质混合而成的含油污泥(简称“油泥”)。据不完全统计，我国各大油田所产生的各类含油污泥的总量已经超过了1000万吨/年。如果这些油泥未能得到及时、有效地处理，则油泥总量会逐年累积，不仅会造成资源浪费，而且油泥中含有的多种石油烃(例如多环芳烃)等化合物会对土壤、水体、大气质量产生危害，进而对生态环境质量和安全产生严重威胁。

油泥的有效处理受到世界各国政府和油田企业的普遍重视，但其处理处理难度较大。我国早在1998年就将油泥列入危险废物名列中(废物类别HW08)，《中华人民共和国清洁生产促进法》要求，必须对含油污泥进行无害化处理。我国石油企业确定了含油污泥“减量化”、“无害化”和“资源化”处理的策略和原则。基于该策略和原则，大多数油田采用包括焚烧法、溶剂萃取法、热解法、热洗法等多种物理、化学方法处理含油污泥，取得了较好效果。尽管如此，这些物理化学方法大多存在成本高，或工艺复杂，或处理不彻底易造成二次污染等问题。

利用微生物降解石油烃的能力处理油泥是物理化学方法的重要补充，甚至替代技术。生物法处理油泥主要利用石油烃降解菌以石油烃为碳源进行生长代谢，使石油烃类化合物最终完全矿化，并转变为无害的无机物质(CO₂和H₂O)。相对而言，生物法处理油泥的成本低，处理彻底，且环境友好，因而受到越来越多的重视。近年来，围绕高效石油烃降解菌的筛选、油泥处理工艺的优化等内容，国内外的多个研发机构和企业单位开展了积极探索。例如：

CN104031870A公开了一种微生物复合菌剂及由其制备的土壤联合修复剂及二者的应用。该微生物复合菌剂中包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、鲁菲不动杆菌、绿脓假单胞菌、无色杆菌、门多萨假单胞菌、热带假丝酵母菌和白色类诺卡氏菌，体积比为1.5：1.5：1.5：1.5：1：1：1：1，而土壤联合修复剂由上述微生物复合菌剂和纯度不低于85wt％的鼠李糖脂生物表面活性剂以体积比4-8：1复合组成。该土壤联合修复剂在修复石油污染土壤、降解土壤中TPH污染物、正构烷烃、藿烷、芳香烃的应用中有着良好的效果。

CN105753283A公开了一种利用生物表面活性剂及微生物菌剂处理含油泥砂的方法。其中生物表面活性剂和微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：将扩培好的生物表面活性剂产生菌及微生物菌剂种子液按照体积比2％-8％的接种量转接至灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含油必要的碳源、氮源、无机盐及微量元素，并调节发酵培养基的pH值，进行通气、搅拌发酵，得到生物表面活性剂或微生物菌剂。此发明可以很好地乳化含油泥砂的残留原油，同时具有较好的降低含油泥沙含油率的效果。

CN106734181A公开了一种石油污染土壤的微生物修复方法。此方法利用铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和无色杆菌Achromobactersp.以及生物表面活性剂粗品联合修复石油污染土壤或油泥中石油烃，受试石油污染土壤起始含油量为20000mg/kg-130000mg/kg，降解效率达到75-91％，降解效果显著。此方法具有处理费用低，处理效率高，无二次污染等优点。

CN108034626A、CN108102977A、CN108048376A、CN108048374A、CN108102979A、CN108034625A、CN108102978A、CN108048375A公开了多种具有降解油泥中石油烃能力的菌株，包括不动杆菌属Acinetobacter sp.JN1、莱茵海默氏菌属Rheinheimera sp.JN2、假单胞菌属(Pseudomonassp.JN3,JN4,JN5,JN7,JN8)、丛毛单胞菌属Comamonas sp.JN6。单独使用这些菌株，30天内含油污泥中总石油烃的降解率可达到44-94％。

应用生物法去除油泥中的石油烃类污染物，其关键之一在于获得高效、适应性强的微生物菌种资源。尽管已有不少关于石油烃降解菌菌种资源的报道，但因不同油田油泥理化性质、组分等差异明显，且不同油田所处的地理区域与气候条件的差异均可对微生物法处理油泥的工艺及处理效果产生影响。而适用于油田油泥处理的微生物菌种资源依然缺乏，且基于这些菌种生理特性的微生物处理工艺仍待优化和提升。这些不足都限制了油泥生物处理技术的发展。

发明内容

本发明的目的是针对当前油田含油污泥生物处理技术中菌种资源不足的现状，提供了提供一株石油烃降解芽孢杆菌PL-10及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株石油烃降解芽孢杆菌，菌株为芽孢杆菌属Bacillus sp.的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL-10),其已于2019年3月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17302。

所述菌株培养条件为25-45℃、pH 5.5-9.0。

一种权利要求1所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，所述菌株在降解油田含油污泥中石油烃类物质中的应用。

进一步的说，将待处理的油泥经预处理后，再将活化好的所述PL-10的种子液按1-20％接种量接种至其中，而后通过无机盐培养基调节油泥的含水量至20-40％，并调节pH值为6.0-8.5(优选pH值为7.0-8.0)，然后在温度为37-45℃下培养10-120d。

所述待处理的油泥的处理为向待处理油泥中加入草炭或木屑；其中，草炭或木屑与油泥的质量比为1:5-1:30。

再进一步的说，

(1)将油田油泥风干研磨、过筛后，拌入草炭或木屑并混合均匀；

(2)按照1-20％的接种量向(1)中所述的油泥与草炭或木屑混合物中接入OD₆₀₀＝0.8-2.0的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节油泥含水量为20-40％；

(3)将上述调节含水量的体系置于25-45℃恒温培养箱中恒温静置培养30-60天，即可实现对含油污泥中总石油烃的降解。

所述PL-10种子液活化：挑取Bacillus subtilis(PL-10)单菌落接种于含灭菌种子液培养基中，在180rpm、37℃恒温振荡培养10-72h即可。

进一步的说，

所述PL-10种子液活化为挑取Bacillus sp.PL-10单菌落于灭菌的种子液培养基的锥形瓶中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中180rpm、37℃、恒温震荡培养24h制成活化的Bacillus subtilis(PL-10)菌液。

所述的无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 1.0-20.0g、KCl 0.1-1.5g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄ 1.0-6.4g、K₂HPO₄ 1.5-10.4g、MgSO₄ 0.1-2.5g、酵母膏0.1-1.5g、微量元素液0.1-2.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.0；

所述的种子液培养基的成分为：葡萄糖2.0-20.0g、(KH₄)₂SO₄ 5-15.0g、KCl 0.5-3.0g、NaCl 0.5-2.0g、KH₂PO₄ 2.0-5.0g、K₂HPO₄ 20.-6.0g、MgSO₄ 0.1-1.5g、酵母膏0.1-2.5g、微量元素液0.1-1.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.0；

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.1-0.5g、CaCl₂ 0.1-1.2g、CuSO₄ 0.2-2.5g、MnSO₄0.1-2.0g、去离子水1000mL，微量元素液经115℃高温灭菌30min后，待用。

一种降解石油烃的方法：

(2)按照1-20％的接种量向(1)中所述的油泥与草炭或木屑混合物中接入OD₆₀₀＝0.8-2.0的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节液体含量为20-40％；

本发明的有益效果：

本发明菌株从新疆某油田含油污泥中筛选出一株石油烃降解兼产表面活性剂的芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL-10)，并获得了应用该菌株去除油泥中总石油烃的工艺参数，为进一步采用微生物法处理油田油泥奠定了菌种资源及工艺技术支撑；具体为：

1、本发明所述石油烃降解菌菌株PL-10筛选自油田的油泥堆放池，采用该菌株进行油泥中石油烃污染物降解时，菌株能够很好适应油泥环境并在其中定殖，有助于微生物在真实油泥环境条件下发挥石油烃降解活性；

2、本发明所述的石油烃降解菌PL-10属于芽孢杆菌属，具有较强的环境适应性，且在生长过程中能够产生物表面活性剂，这对石油烃的降解起到促进作用。

3.本发明菌株对油泥中总石油烃污染物的最适降解条件为接种量1-20％、25-45℃、pH 6-8、油泥含水量为20-40％。使用菌株PL-10，同时辅以营养液，可以有效去除含油污泥中的石油烃类污染物，具有高效、成本低、环境友好等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的Bacillus subtilis(PL-10)的菌落形态图。

图2为本发明实施例1提供的Bacillus subtilis(PL-10)环境扫面电镜下菌体形态。

图3为本发明实施例2提供的接种Bacillus subtilis(PL-10)对油泥中石油烃类去除率结果图。

图4为本发明实施例2提供的Bacillus subtilis(PL-10)在不同草炭添加量下对油泥中石油烃类的去除率结果图。

图5为本发明实施例2提供的Bacillus subtilis(PL-10)在不同油泥含水量下对油泥中石油烃类的去除率结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明内容不仅局限于以下实施例。

本发明菌株分离筛选自新疆某油田含油污泥池，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌，其对油泥中总石油烃类化合物具有明显降解去除作用。通过配施营养剂及使用油泥调理剂，菌株PL-10可以实现油泥中石油烃的快速降解，40天内含油量去除40％以上。为油泥处理提供了新的菌种资源及微生物处理途径。

本发明所述的具有石油烃类降解兼产生物表面活性剂的菌株PL-10用途为以微生物强化的方式降解含油污泥中的石油烃类，用于油田含油污泥的处理。取对数生长期PL-10菌液接种至预先添加适量松散剂的含油污泥中，同时配施营养液，在30-60天内对油泥中总石油烃(TPH)的降解率大于40％。该菌株对油泥中总石油烃污染物的最适降解条件为接种量1-20％、25-45℃、pH 6-8、油泥含水量为20-40％。使用菌株PL-10，同时辅以营养液，可以有效去除含油污泥中的石油烃类污染物，具有高效、成本低、环境友好等优点。

材料准备

1、油泥：

从新疆油田某油泥池取适量油泥样品，经过风干、磨碎、过2mm筛后用作菌株筛选。

2、草炭或木屑：

购于市场，去除砂砾、木块等杂物。

3、培养基：

种子液培养基的成分为：葡萄糖10g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl 1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl 1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.29g、CaCl₂ 0.24g、CuSO₄ 0.25、MnSO₄ 0.17、去离子水1000mL。

筛选培养基：种子液培养基组分中的葡萄糖替换为1g/L的原油。

4、实验仪器

恒温培养箱

恒温震荡培养箱

电热恒温鼓风干燥箱

超净工作台

立式压力蒸汽灭菌器

凝胶成像***

微型紫外分光光度计

PCR仪

电泳仪

涡旋振荡器

(二)菌株PL-10活化与接种

取PL-10保藏菌种，接种至装有100mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、180rpm的恒温摇床上培养24h。

48h后取PL-10菌液，按照1-20％接种比例接种至待处理的油泥样品中。

下面为具体实施例部分。

实施例1

石油烃降解菌PL-10的筛选方法：

取含油污泥10g，放入预装有100mL种子液培养基的250mL锥形瓶中，然后在37℃、180rpm的恒温摇床上震荡培养48h；

48h后，取静置后的上层菌液并经10倍梯度稀释后涂布于筛选培养基平板中。筛选培养基中原油的含量为1.0g/L；

所述种子液培养基的成分为：葡萄糖10g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl1.1g、NaCl 1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7.0。

筛选培养基：将种子液培养基组分中的葡萄糖替换为原油，用量为1.0g/L；另补加琼脂粉，用量为1.5％。

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.29g、CaCl₂ 0.24g、CuSO₄ 0.25g、MnSO₄ 0.17g、去离子水1000mL。

待筛选培养基上菌落生长后，用无菌接种环挑取噬油斑直径大于1cm的菌落，采用平板划线分离法接种于种子液固体培养基上，并置于37℃恒温培养箱中培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，重复上述划线分离过程直至菌落形态单一，将其获得的菌落接种于斜面培养基上并在4℃条件下暂时保存，而后将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，菌株保藏号为CGMCC No.17302。

上述噬油斑直径大于1cm的菌株编号为PL-10，其菌落为乳白色，菌落不透明，菌落边缘不规则且表面有褶皱，PL-10菌株的菌落形态如图1所示。PL-10菌体呈短杆状，细胞形态见图2所示。菌株PL-10的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的数列信息进行同源性分析，判断该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。PL-10菌株的16S rRNA基因序列为：

经DNA测序，PL-10菌株16S rRNA基因序列为：

GTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTA

实施例2

新疆某油田区块油泥总石油烃的去除试验

取适量新疆某油田油泥，油泥初始含油量为6.28％，经风干、研磨、过2mm筛后与一定量的草炭混合。油泥与草炭的质量比设3个梯度，分别为1:5、1:10和1:20。

取-80℃甘油管保藏的PL-10菌株在超净工作台中划线接种到预先灭菌的固体平板培养基中，培养基为种子液培养基，成分为：葡萄糖10g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、琼脂粉15g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。挑取平板上菌落后转接至适当体积的液体种子液培养基中，并在180rpm、37℃活化24h。

称取上述油泥草炭混合样品200g于塑料烧杯中，按照5％的接种比例向其中接入活化后OD₆₀₀＝1.5的Bacillus subtilis(PL-10)菌液。在草炭使用量10％、含水量30％的处理组中，另设不接种PL-10菌液的处理。用无机盐培养基调节混合样的含水量，设4个梯度，分别为20％、25％、30％、35％。用透气封口膜封口后，将塑料烧杯置于37℃恒温培养箱中恒温静置培养。每10d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中总石油烃含量。

由测定结果可见，使用菌株PL-10的处理，油泥中总石油烃的去除效果明显好于不接菌的处理(见附图3)；菌株PL-10在草炭添加量10％(见附图4)、含水量30％(见附图5)的条件下对油泥中的石油烃类具有最佳降解效果，40天内对油泥总石油烃(TPH)降解率为42.9％。

实施例3

西北某油田区块油泥总石油烃的去除试验

取适量西部某油田油泥，经风干、研磨、过2mm筛后与一定量的草炭混合，油泥与草炭的质量比为1：10，油泥含油量为5.62％。

取-70℃甘油管保藏的PL-10菌株在超净工作台中划线接种到预先灭菌的固体平板培养基中，培养基为种子液培养基，成分为：葡萄糖10g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、琼脂粉15g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7。挑取平板上菌落后转接至适当体积的液体种子液培养基中，并在180rpm、37℃活化24h。

称取上述油泥草炭混合土200g于塑料烧杯中，按照5％的接种比例向其中接入活化后OD₆₀₀＝1.2的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节液体含量为30％，用透气封口膜封口。将塑料烧杯放置于37℃恒温培养箱中恒温静置培养。每10d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中总石油烃含量。

由测定结果可见菌株PL-10对油泥中的石油烃类具有良好的降解效果，40天内对油泥总石油烃(TPH)降解率为62.5％。

实施例4

东北某油田区块油泥总石油烃的去除试验

取适量新疆某油田油泥，经风干、研磨、过2mm筛后与一定量的草炭混合，油泥与草炭的质量比为1：12，油泥总石油烃含量为4.85％。

取-70℃甘油管保藏的PL-10菌株在超净工作台中划线接种到预先灭菌的固体平板培养基中，培养基为种子液培养基，成分为：葡萄糖10g、(KH₄)₂SO₄ 10.0g、KCl 1.1g、NaCl1.1g、KH₂PO₄ 3.4g、K₂HPO₄ 4.4g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、琼脂粉15g、微量元素液0.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7.2。挑取平板上菌落后转接至适当体积的液体种子液培养基中，并在180rpm、37℃活化24h。

称取上述油泥草炭混合土200g于塑料烧杯中，按照10％的接种比例向其中接入活化后OD₆₀₀＝1.3的Bacillus subtilis(PL-10)菌液，并用无机盐培养基调节液体含量为32％，用透气封口膜封口。将塑料烧杯放置于37℃恒温培养箱中恒温静置培养。每10d取样采用索氏提取法-重量法测定油泥中总石油烃含量。

由测定结果可见菌株PL-10对油泥中的石油烃类具有良好的降解效果，50天内对油泥总石油烃(TPH)降解率为60.9％。

序列表

<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所

<120> 一株石油烃降解芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisPL-10)

<400> 1

gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60

gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac 120

gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct 180

cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240

ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag 300

agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360

caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag 420

gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540

tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg 600

ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660

atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct 720

tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccactc 780

tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct ccccggttga gccgggggct 840

ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg cccaataatt ccggacaacg 900

cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag 960

gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg gtacttgttc ttccctaaca acagagcttt 1020

acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg 1080

gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc 1140

cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact 1200

agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt atgtttgaac 1260

catgcggttc aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta 1320

caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc 1380

atctgtccgc tcgactgcat gta 1403

Claims

1.一株石油烃降解芽孢杆菌，其特征在于，菌株为芽孢杆菌属Bacillus的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(PL-10),其已于2019年3月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17302。

2.按权利要求1所述的石油烃降解芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株培养条件为25-45℃、pH 5.5-9.0。

3.一种权利要求1所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述菌株在降解油田含油污泥中石油烃类物质中的应用。

4.按权利要求3所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，其特征在于，将待处理的油泥经预处理后，再将活化好的所述PL-10的种子液按1-20％接种量接种至其中，而后通过无机盐培养基调节油泥的含水量至20-40％，并调节pH值为6.0-8.5，然后在温度为37-45℃下培养10-120d。

5.按权利要求4所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述PL-10种子液活化：挑取Bacillus subtilis(PL-10)单菌落接种于含灭菌种子液培养基中，在180rpm、37℃恒温振荡培养10-72h即可。

6.按权利要求4所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述待处理的油泥的处理为向待处理油泥中加入草炭或木屑；其中，草炭或木屑与油泥的质量比为1:5-1:30。

7.按权利要求4所述的石油烃降解芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的无机盐培养基成分为：(KH₄)₂SO₄ 1.0-20.0g、KCl 0.1-1.5g、NaCl 0.5-5.0g、KH₂PO₄ 1.0-6.4g、K₂HPO₄1.5-10.4g、MgSO₄ 0.1-2.5g、酵母膏0.1-1.5g、微量元素液0.1-2.5mL、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5-8.0；

微量元素液成分为：ZnSO₄ 0.1-0.5g、CaCl₂ 0.1-1.2g、CuSO₄ 0.2-2.5g、MnSO₄ 0.1-2.0g、去离子水1000mL，微量元素液经115℃高温灭菌30min后，待用。