CN115724959B - 靶向甲型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种靶向甲(A)型流感病毒核蛋白的抗体及其应用。抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示。利用该抗体开发了侧向流免疫层析检测试剂。该抗体灵敏度高，特异性好，在免疫诊断领域具有广泛的应用前景。

Description

靶向甲型流感病毒核蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地说，涉及一种靶向甲(A)型流感病毒核蛋白的抗体及其应用。

背景技术

正黏病毒科(Orthomyxoviridae)一共有7个病毒属成员，其中有4个是流感病毒属(Influenza A/B/C/D virus；分别对应甲、乙、丙、丁型流感病毒)。流感病毒样本一般呈椭圆状或球状(直径约100nm)。流感病毒在某些情况下呈长丝状(长轴约20μm)，从临床上分离得到的病毒样本常呈长丝状。

其中，流感病毒根据宿主、分离的地点、分离株的编号、分离的年份以及流感病毒表面的两种糖蛋白--血凝素(H或HA，haemagglutinin)和神经氨酸酶(N或NA，neuraminidase)的抗原性不同，来进行命名。

流感病毒可引起世界范围内的大流行。野生鸟类被认为是流感病毒的天然宿主，因为野生鸟类季节性的迁移使得流感病毒具有传播并引起季节性流感的能力。目前发现了18种不同的血凝素亚型(HA)和11种不同的神经氨酸酶(N或者NA)亚型，其中，H1-H16和N1-N9亚型可从野生鸟类体内分离获得，被认为是典型流感病毒。甲(A)型流感病毒在4个流感病毒属中的宿主范围最为广泛，宿主不但包括野生鸟类或其近亲家禽，还包括家畜(如H5N1和H7N9可人畜共患感染)、人类(如H1N1和H3N2)以及其他野生动物例如蝙蝠(如H17N10和H18N11)，进一步扩大了其潜在的同种系或跨种系的传播范围。

流感病毒是一种基因组包含分节段(节段1～节段8)的单链负义病毒核糖核酸(viral ribonucleic acid,vRNA)的有包膜病毒。病毒基因组编码的主要蛋白质为：聚合酶蛋白亚基(RNA polymerase subunit 1,2,A，A-X and 1-F2；PB1,PB2,PA,PA-X和PB1-F2)，核蛋白(nucleoprotein，NP)，2种表面糖蛋白(血凝素HA和神经氨酸酶NA)，2种基质蛋白(matrix proteins，M1和M2；其中M2也是一种跨膜的离子通道蛋白)，非结构蛋白(non-structural protein 1，NS1)与核输出蛋白(nuclear export protein，NEP)。

流感病毒的生命周期分为以下几个步骤：病毒吸附并进入宿主细胞、病毒脱衣壳、病毒核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein，vRNP)入核、病毒基因组在核内转录与复制、病毒核糖核蛋白(vRNP)出核、病毒组装和病毒出芽释放。

流感病毒的包膜是子代病毒出芽时从宿主细胞膜获得的双层脂膜，其包膜下有一层最丰富的病毒基质蛋白(M1)环绕着病毒基因组：每一种病毒核糖核酸(vRNA)以病毒核糖核蛋白(vRNP)的形式存在，并可以表达一种或多种病毒蛋白；每一种病毒核糖核蛋白(vRNP)由三部分组成，分别为寡聚体核蛋白(nucleoprotein,NP)和病毒核糖核酸(vRNA)和异源三聚体病毒RNA聚合酶(RNA polymerase)。其中，核衣壳蛋白(Nucleocapsids，N蛋白)由寡聚体核蛋白即寡聚体NP蛋白，和病毒核糖核酸(vRNA)构成的复合物。

另外，病毒包膜上嵌有三种病毒蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和跨膜通道蛋白(M2)。其中，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是两种主要的病毒抗原：血凝素(HA)负责结合宿主细胞上的唾液酸受体；神经氨酸酶(NA)负责将出芽的子代病毒颗粒释放到宿主细胞外；离子通道蛋白(M2)负责病毒进入宿主细胞时的酸化，并对子代病毒的出芽释放有重要作用。

甲(A)型流感病毒的核蛋白(nucleoprotein，NP)是主要的内部结构蛋白，由病毒基因组节段5编码而成。核蛋白(NP)基因长度一般约1565bp左右，表达的蛋白产物分子量约为53-56KD。

核蛋白(NP)呈新月形，共包含498个氨基酸，由头部、中间结构域和28个氨基酸的长尾环组成，富含精氨酸、甘氨酸、丝氨酸和少量的半胱氨酸残基，并且在中性pH环境下具有净正电荷。核蛋白是一种单体多肽，存在磷酸化和非磷酸化这两种形式，通过宿主细胞磷酸激酶和磷酸酶使核蛋白磷酸化和去磷酸化调节其构象变化，并进而影响核蛋白寡聚化，以及和其他大分子的相互作用。

核蛋白可以与多种其他大分子相互作用，比如可以和病毒RNA及异源三聚体病毒RNA聚合酶(包含亚基PB1、PB2和PA)构成病毒核糖核蛋白(vRNP)。常见的病毒核糖核蛋白的最小功能单元，包括结合了病毒RNA的病毒RNA聚合酶复合物和9个以杆状结构排列的核蛋白单体。

病毒核糖核蛋白太大

无法通过宿主细胞细胞核的/>

核孔扩散。宿主细胞的细胞核输入蛋白α(importin-α)通过其核定位序列与流感病毒的核蛋白结合。在病毒复制周期中，病毒核糖核蛋白通过主动转运进出宿主细胞的细胞核。

因此在病毒在宿主细胞中的增殖过程中，核蛋白在宿主细胞内是否发生磷酸化，以及相应的构象变化是影响流感病毒宿主反应谱的关键性因素。

对不同宿主分离的流感病毒病毒株进行***发育分析，发现核蛋白基因翻译出的氨基酸序列保守性较好。对甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒核蛋白的氨基酸序列进行比对发现，三种病毒的核蛋白的氨基酸序列之间存在显著的相似性，其中甲(A)和乙(B)流感病毒的核蛋白各自的保守度最高。核蛋白至少有3个独立的抗原表位，其中有一个表位的氨基酸序列在多种流感病毒株中呈现高度的保守性。

流感病毒的核蛋白在自然条件下能够诱导宿主产生非中和性抗体，针对核蛋白高度保守的抗原表位的单克隆抗体可抑制病毒RNA在宿主细胞核中的转录。同时，机体产生细胞毒淋巴细胞反应，通过识别感染细胞表面由主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)分子提呈的病毒抗原(如核蛋白)，进而发挥细胞介导的杀伤作用，从而清除宿主细胞感染的流感病毒。

相较于病毒包膜表面的其他蛋白，比如血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，核蛋白的氨基酸序列相对来说更保守，免疫原性稳定且不受抗原漂移(antigenic drift)的影响，是分别鉴别甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒的主要特异性靶标，选其作为诊断的靶向抗原具有很强的区分度。

流感病毒的核蛋白通常是被感染的宿主细胞中表达最丰富的病毒蛋白，功能包括但不限于病毒RNA的转录、复制、包装以及核转运。核蛋白的多功能作用，加上其序列高度的保守性，使其成为理想的分子靶标。

综上，靶向流感病毒核蛋白(NP)抗原及其复合物核衣壳蛋白(N蛋白)抗原的单克隆抗体的研制，对诊断不同流感病毒亚型，以及发现针对流感病毒的特定亚型的疗效强的抗体药物具有重要意义。

胶体金是最早应用于免疫层析检测试剂盒的标记材料之一。吸收波长在可见光区，易于裸眼直接观测，且随着胶体金颗粒大小与形态的变化颜色呈红、蓝或紫色等。胶体金原料通常采用简单可靠的柠檬酸三钠还原氯金酸制备获得。该方法制备的胶体金表面携带相当数量的负电荷，使其性质在干燥状态下甚至溶液中都非常稳定。此外，大量的负电荷表面聚集使胶体金能够通过静电吸附的简单方式与在特定pH等条件下带正电荷的核苷酸、多肽或蛋白质等生物大分子进行温和的偶联结合，而这种偶联结合能最大限度的保留生物大分子的活性。以上优势使得胶体金成为了目前市面上大多数的商品化的免疫层析试纸条中的标记材料。

尽管胶体金在免疫层析方法中得到了广泛应用，但也存在较多的缺陷，如易受基质干扰而导致检测结果准确性较差，检测灵敏度不理想等。针对这些缺陷，对传统胶体金进行了改造，如制备几何结构呈刺突状的胶体金颗粒，或将羧基末端的聚乙二醇(PEG)分子修饰于胶体金表面，并通过共价方式结合标记抗体，提高了胶体金试纸条的检测灵敏度或抗干扰能力。这些对传统胶体金的改造，进一步拓展了胶体金在侧向流免疫层析试纸条中的应用。

侧向流免疫层析快速诊断试剂盒是一种基于试纸的、适用于即时检测的结果报告方法。其核心元件即为侧向流免疫层析试纸条(图1，a和b)，一般为窄条形，通常宽度在4-6毫米，而长度不会超过6-7厘米。一个标准的侧向流免疫层析试纸应该包括四个主要部分，分别是：

样品垫区的主要材料由纤维素制成，使用时将样品垫区充分浸没到待测物中；

结合垫区的主要材料由玻璃纤维制成，结合垫区一般含有胶体金(偶联)抗原或胶体金(偶联)抗体；

检测区的主要材料由硝酸纤维素膜(NC膜)制成，在检测区主要有检测线和质控线，检测线和质控线分别包含相应的抗体；

吸水垫区的主要材料由纤维素制成。

当侧向层析试纸***待测溶液时，溶液会从样品垫区流入结合垫区。当溶液中含有被检测物质时，被检测物质将会和结合垫区的胶体金(偶联)抗原或胶体金(偶联)抗体相结合。通过溶液再次水化的胶体金(偶联)抗体或胶体金(偶联)抗原或与待测样品所形成的复合物，将会在毛细作用力的作用下依次经过检测区(NC膜)和吸水垫区。此时，侧向层析试纸将会有两种结果显示模型，分别是标准模型(图1a)和竞争模型(图1b)。

图1a当侧向流免疫层析试纸采用的是标准模型(检测流感病毒的核蛋白抗原)时，检测线(包含靶向流感病毒的核蛋白抗原的特异性抗体)只能捕获被待测抗原和胶体金(偶联)一抗的复合物：如果溶液中存在待测抗原，此时检测线便能捕获到待测抗原和胶体金(偶联)一抗所形成的复合物，而由于胶体金(偶联)一抗本身始终会被质控线(包含相应的二抗)捕获，因此此时检测线和质控线均出现颜色变化，结果判定为阳性反应。如果溶液中不存在待测抗原，则只有质控线(包含相应的二抗)能够捕获胶体金(偶联)一抗并发生颜色变化，此时质控线显色而检测线不显色，结果判定为阴性反应。

图1b当侧向层析试纸采取的是竞争模型(检测靶向流感病毒的核蛋白[NP]抗原的IgM/IgG抗体)时，待测抗体与结合垫区包被的胶体金(偶联)核蛋白抗原发生结合，并且待测抗体和胶体金(偶联)核蛋白抗原各自都可以被检测线(包含抗IgG/IgM的抗体)所捕获：当待测抗体存在时，其能够被检测线所捕获而胶体金(偶联)抗原将无法被检测线捕获(因为待测抗体的竞争性封闭)，进而无法发生颜色变化，但质控线(包含核蛋白抗原配对抗体)依然能够捕获胶体金(偶联)抗原，此时检测线不显色而质控线显色，结果判定为阳性反应；如果溶液中不存在待测抗体，则检测线和质控线均能捕获胶体金(偶联)抗原，此时检测线和质控线均会发生颜色变化，结果判定为阴性反应。

然而，侧向流免疫层析快速诊断试剂盒也有一些不足：首先该检测手段只能提供定性结果，对于需要根据精细的定量结果对感染情况进行诊断的致病原(特定的细菌、支原体、病毒等)来说适用性不强；其次，该检测手段要求测试样品必须处于液体状态，且需要有一定的粘度，以流过多孔的硝酸纤维素膜。

尽管如此，侧向流免疫层析快速诊断试剂盒仍然是一项具有重要应用价值的检测技术，能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准。该侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的这些优势，尤其是对于缺乏专业设备和未受过良好训练的技术人员的单位或地区具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向甲(A)型流感病毒核蛋白的抗体及其应用，特别是在侧向流免疫层析诊断试剂盒中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向甲(A)型流感病毒核蛋白的抗体(单抗B5A3)，所述抗体的轻链高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别为ETSENIYSNLA、VATRLVD和QHFWLTPWT，所述抗体的重链高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别为NYLMN、WINTNTGHPTYAEDFKG和VGKTYSMGNSMDY。

所述抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示。

本发明还提供编码所述抗体的核酸。编码所述抗体轻链、重链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8、9所示。

第二方面，本发明提供所述抗体在制备甲(A)型流感病毒(核蛋白)检测试剂或试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供由所述抗体制备的甲(A)型流感病毒(核蛋白)检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述抗体在制备甲(A)型流感病毒胶体金免疫层析检测试纸条或试剂盒中的应用。

第五方面，本发明提供所述抗体在制备甲(A)型流感病毒侧向流免疫层析诊断试剂盒中的应用。

第六方面，本发明提供一种甲(A)型流感病毒胶体金免疫层析检测试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸水垫和底板，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上。

其中，所述胶体金结合垫上包被有胶体金标记的靶向甲(A)型流感病毒核蛋白抗体II；所述检测线包被有所述抗体，所述质控线包被有羊抗鼠多抗。

所述靶向甲(A)型流感病毒核蛋白抗体II(单抗G2A8)的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。

优选地，所述胶体金结合垫上包被的抗体的浓度为10-15μg/mL。

优选地，所述检测线上包被的抗体的浓度为1.5-2mg/mL。

优选地，所述样品垫、所述吸水垫的材质为纤维素，所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供一种靶向识别甲(A)型流感病毒核蛋白(FluA N)的抗体，并将其用于甲(A)型流感病毒的基于胶体金的侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的检测。抗体具有高特异性和高亲和力特性，以各氨基酸序列中的一个或多个为核心，将其应用于甲(A)型流感病毒治疗靶点设计，可以设计出针对甲(A)型流感病毒的治疗制剂，所述治疗靶点设计包括但不限于治疗性抗体的靶点设计。

(二)抗体不仅可以有效用于甲(A)型流感病毒的定量和/或定性检测，还可用于ELISA检测、免疫化学发光法检测和免疫荧光法检测等多种检测方法，应用范围广、适用性强。

另一方面，相应的抗原氨基酸序列为进行相应调整或修饰后的氨基酸序列，修饰材料包括纳米材料、荧光材料、酶类、生物素和蛋白质中的一种或几种。有利于将调整或修饰的氨基酸序列应用于甲(A)型流感病毒的检测、甲(A)型流感病毒疫苗的免疫抗原设计和甲(A)型流感病毒疫苗评价等。

(三)本发明基于胶体金的侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的优势在于检测限较低，灵敏度较高；并且选用的抗体是特异性靶向具有高度保守氨基酸序列的抗原表位，不受病毒突变株常见的抗原蛋白突变的影响，降低检测成本，缩短检测时间，提高检测效率。侧向流免疫层析快速诊断试剂盒是一项具有重要应用价值的检测技术，能够实现快速诊断所要求的灵敏、稳定、经济、用户友好和无需设备等通用标准。该侧向流免疫层析快速诊断试剂盒的这些优势，尤其是对于缺乏专业设备和缺乏受过良好训练的技术人员的单位或地区具有重要意义。

附图说明

图1为侧向流免疫层析试纸条的检测原理示意图。其中，a：标准模型；b：竞争模型。

图2为本发明实施例中甲(A)型流感病毒重组蛋白(抗原)的蛋白电泳结果。

图3为本发明较佳实施例中利用所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂检测灭活流感病毒培养物(不同稀释度)的结果。

图4为本发明较佳实施例中使用甲(A)型流感病毒核蛋白溶液标准物质对基于本发明抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂进行检测(不同稀释度)的结果。

图5为本发明较佳实施例中使用本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂检测正常人的鼻拭子样本的结果。

图6为本发明抗体在梯度浓度下分别与重组甲(A)型流感病毒核蛋白抗原结合曲线图。其中，0.5μg为每孔包被抗原50ng(100μL每孔)的结合曲线，1μg为包被每孔抗原100ng(100μL每孔)的结合曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1产单克隆抗体的杂交瘤制备

1、甲(A)型流感病毒核蛋白抗原的设计

根据GenBank上的甲(A)型流感病毒核蛋白基因(SEQ ID NO:5；优化后的基因序列如SEQ ID NO:6所示)翻译得到的氨基酸序列进行分析，选择甲(A)型流感病毒(A/Beijing/337/1989(H3N2))的核蛋白氨基酸序列进行序列比对，发现作为该段序列与其他甲型流感病毒核蛋白的同源性很高。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选甲(A)型流感病毒(A/Beijing/337/1989(H3N2))的核蛋白CDS区全长498个氨基酸作为后续重组蛋白，即抗原的序列(SEQ ID NO:7)。

甲(A)型流感病毒核蛋白抗原表位和/或功能定位的相关信息见表1：

表1

2、重组甲(A)型流感病毒核蛋白的制备

经过基因合成以及分子克隆设计，最终在E.coli***中进行表达，得到重组甲(A)型流感病毒核蛋白，该蛋白即抗原。相应表达蛋白重组蛋白经过SDS-PAGE鉴定(图2)。

3、免疫小鼠

将1mg/mL重组甲(A)型流感病毒核蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠接种重组甲(A)型流感病毒核蛋白(抗原)100μg。三周后将1mg/mL抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，以此作为加强免疫。间隔三周、六周以及九周后按照前述加强免疫的流程再次免疫，总共进行4次加强免疫。

4、免疫血清效价测定

第四次加强免疫后10天小鼠尾静脉采血，采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成抗原重组甲(A)型流感病毒核蛋白溶解于10mL 0.05M pH9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μL/孔，4℃过夜。使用PBST(0.02M PBS含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBST(0.02M PBS含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，准备待用。鼠免疫血清用含1％BSA的10mM PBS进行10²～10⁶倍稀释，加入96孔板，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育1h，后采用PBST(0.02MPBS含有0.05％v/vTween-20)洗板三次后，加入1:10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育30min，同上洗板。随后每孔加入TMB显色100μL/孔，于37℃下室温避光10min，后按照50μL/孔的量加入2M H₂SO₄终止反应。测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定免疫血清效价(表2)。

表2

稀释倍数	免疫小鼠1	免疫小鼠2	免疫小鼠3	免疫小鼠4
					10000	3.25	3.15	3.19	3.33
50000	2.34	2.28	2.33	2.38
					100000	1.43	1.37	1.47	1.46
500000	0.79	0.75	0.82	0.81
					1000000	0.14	0.11	0.15	0.18

5、杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁵的小鼠，融合前3天，取合成的抗原甲(A)型流感病毒核蛋白与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。饲喂层细胞制备流程：Balb/c(4周左右)小鼠眼眶静脉放血处死，75％乙醇浸泡3分钟，腹侧面向上；打开胸腔分离出胸腺，使用细胞筛研磨，使用预热好的基础培养基冲悬细胞。腹腔巨噬细胞的制备：融合当天，选择健康小鼠1只(1个脾脏取一只)，摘其眼球放血，待血滴不出为止。颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5分钟，移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口(注意不可损伤腹膜、以免腹腔液外流)，经钝性剥离使腹膜充分暴露，并用酒精擦拭消毒。用一次性无菌注射器吸取基础培养液5～10mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部1～2分钟，促使巨噬细胞游出。再用注射器吸出腹腔内的培养液转移至15mL离心管中。将腹腔巨噬细胞与胸腺细胞混匀后，1200r/min离心10分钟，弃上清。使用预热好含20％FBS1×HAT培养基(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))重悬，于37℃备用。

细胞融合当日上午，脾细胞的制备流程：取已经加强免疫后3～4天的小鼠，摘除眼球采血，并收集分离血清作为抗检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟消毒，并立即放超净台内。于解剖台板上固定小鼠，无菌开腹，后掀开右侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪，用无菌手术剪剪开腹膜，镊子取出脾脏，生理盐水冲洗脾脏后，使用剪刀将脾脏剪碎，放置在一次性细胞筛内，用注射器内芯轻轻挤压脾脏，并用生理盐水反复冲洗细胞筛，至细胞筛中只剩***，后再次使用一次性细胞筛过滤细胞悬液。收获脾细胞悬液，1200r/min离心10分钟，用30-40mL的重悬离心洗涤1次(尽量去除红细胞团)。将脾细胞重悬加入含10％ FBS的基础培养液后，放入T75细胞瓶于37℃、5％CO₂培养箱中培养2-3小时，使细胞悬液中的巨噬细胞贴壁。

融合细胞当日下午，骨髓瘤细胞的制备流程：将3瓶T75骨髓瘤细胞，弃上清，使用50mL预热的生理盐水吹下，与脾细胞共同离心，1200r/min离心10分钟。将脾细胞与3瓶T75骨髓瘤细胞充分混匀，弃上清，使用40ml预热的生理盐水重悬，1200r/min离心10分钟。

细胞融合过程：弃上清液，将上清液尽量弃尽，用滴管吸净残留液体，以免影响细胞融合剂的浓度，尽量去除红细胞。用手指轻轻弹击离心管底混匀使沉淀细胞松散均匀成糊状。在室温下融合：细胞融合剂、及含有饲喂层的培养基在准备脾脏细胞的时候需放入培养箱保温。用巴氏吸管吸取分装好的1mL细胞融合剂溶液(尽量接近细胞处离心管壁一圈旋加入)。60s-90s内轻轻混匀。计时完成后一次性加入30mL预热37℃基础培养基，使细胞融合剂稀释而失去促融作用，37℃静置5min。800r/min离心6分钟，弃去上清液。加入预热好的20％ FBS 1×HAT培养基轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀(充分混匀，减少细胞团)，动作轻柔。此次试验按照制备10块96孔细胞培养板，每孔200μL，需要200mL 20％ FBS 1×HAT培养基。

37℃、5％CO₂孵箱培养，细胞融合后7天显微镜观察，计数96孔细胞培养板中出现明显细胞克隆的培养孔，计算融合率，融合率＝(融合的细胞数/总细胞数)×100％。

6、筛选分泌抗甲(A)型流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率。对于最终得到的20株效价格较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测，同时采用0.02MPBS进行稀释检测，测得结果如表3所示：

表3

从表3可以看出，通过比较杂交瘤细胞株培养上清进行的ELISA方法的检测数据，可以从中进一步挑选出稳定分泌抗甲(A)型流感病毒核蛋白单克隆抗体且抗体效价较高细胞株，标记为B5A3。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

7、腹水的制备和纯化

将杂交瘤细胞株B5A3以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

实施例2单克隆抗体的特性鉴定

1、抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞B5A3制备的腹水经纯化后获得抗甲(A)型流感病毒核蛋白的单克隆抗体，使用Thermofisher公司生产的Nanodrop核酸蛋白测定仪测定，其浓度为>1mg/ml。

2、抗体亚型鉴定：采用Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，B5A3分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。

3、纯化抗体的效价鉴定：50μg合成甲(A)型流感病毒核蛋白溶于10mL pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μL/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％v/vTween-20)洗板三次，每孔加入100μL纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％v/v Tween-20)洗板三次，每孔加入100μL，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。

4、抗体结合力测试：

用1×CB将甲(A)型流感病毒核蛋白分别稀释到0.5μg/mL、1μg/mL，以100μL/孔的量加入酶标板孔中，并做复孔，置于4℃过夜或37℃吸附2小时。将包被好的微孔板甩干，按照洗板机设定的操作程序(AFP程序)清洗一遍，按200μL/孔的量加入封闭液，置于37℃温箱中2h，之后置于4℃过夜。临用前，将封闭好的微孔板从4℃取出，甩干，加入清洗液(1×PBS-T)使酶标版湿润；将本发明所述单克隆抗体用1×PBS预稀释至30μg/mL，并记录预稀释的倍数m，在稀释10倍即3μg/mL作为(S1)最高浓度然后再以1:3梯度稀释(在96深孔板中稀释)，一共8个稀释梯度(S1-S8)。

将100μL稀释好的抗体，加入在吸水纸上拍干净的96孔微孔板，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，1-4列每孔加入100μL的1×PBS；5列与6列每孔，加入200μL尿素处理液，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，每孔加入100μL预先用二抗稀释液稀释10000倍的GAM-HRP酶标二抗，37℃孵育30min；孵育后将酶标板甩干，在吸水纸上拍干，用洗板机清洗酶标板3次，取TMB显色液，每孔加入100μL显色液，37℃孵育5-10min；显色后每孔加入50μL终止液。在酶标仪上设置进行450nm/630nm读值。

分别在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被的条件下，测试了ELISA抗原抗体结合力实验，通过测试吸光值OD得到数据(图6)，并拟合得到对应的多项式曲线，相应的结合随着抗体稀释倍比的变化可以看到明显的梯度性，同时，在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被的条件下两条曲线反映出的亲和性结合，体现了结合的特异性，并且反映抗体结合力所对应浓度分别达到2.18E-10mol/L(0.5μg/mL抗原包被条件下，最高的OD读的50％，即抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，抗体对应的浓度值K_0.5)和2.41E-10mol/L(1μg/mL抗原包被条件下，最高OD读值的50％，即抗原-抗体复合物的浓度占总浓度的一半时，抗体对应的浓度值K₁)。

结合力计算：分别计算在0.5μg/mL和1μg/mL抗原包被条件下，尿素处理前后S1-S8抗体浓度的复孔平均值OD读值。将读值代入结合力计算公式：

5、特异性检测：类似于ELISA抗体效价检测，使用正交设计流感病毒重组的核蛋白抗体作检测，表明本发明所述抗体特异性良好(表4A～表4J)。

表4A

表4B

表4C

表4D

表4E

表4F

表4G

表4H

表4I

表4J

从表4A～表4J可以看出，通过比较抗体配对实验对应的实验数据，表明除了和包被抗体一样的酶标抗体对应的检测孔会被屏蔽掉之外，其他酶标抗体均能在包被抗体存在的情况下依然能结合甲(A)型流感病毒核蛋白抗原，其结合效应随着加入抗原的浓度增加而发生读值增加，因此体现了B5A3抗体结合的特异性。且与G2A8抗体搭配形成免疫夹心反应时会表现出对于甲型流感病毒抗原灵敏度表现最优。

6、单抗测序

取纯化后的杂交瘤细胞B5A3制备的甲(A)型流感病毒N蛋白的单克隆抗体约28mg(批号V20210426；3.52mg/mL)。对轻链可变区与重链可变区的测序可知，抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示。上述流感病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区序列为CDR-L1(ETSENIYSNLA)、CDR-L2(VATRLVD)和CDR-L3(QHFWLTPWT)，重链可变区序列为CDR-H1(NYLMN)、CDR-H2(WINTNTGHPTYAEDFKG)和CDR-H3(VGKTYSMGNSMDY)。具有相应可变区序列的抗体亲和力高，特异性好；因此相应的抗体可变区域可以用于重组抗体、单链抗体、双特异性抗体的开发，用于诊断用途或者治疗用途的相关产品开发。

实施例3利用流感病毒核蛋白单克隆抗体开发侧向流免疫层析检测试剂

本发明所述抗体可用于酶联免疫、化学发光、侧向流免疫层析及免疫荧光检测等免疫诊断试剂开发。

1、胶体金的制备：

采用还原法制备，制金条件为2％氯金酸5mL+10mL 1％柠檬酸三钠。

2、胶体金标记小鼠抗甲(A)型流感病毒核蛋白单抗

物理吸附法，通过调节pH值使胶体金与抗体(靶向甲(A)型流感病毒核蛋白抗体G2A8，轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示)结合起来。

具体标记条件为：pH7.5的条件下，每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液10μL，小鼠抗甲(A)型流感病毒核蛋白单抗标记浓度为10μg/mL。

3、检测线及质控线

检测线：取适当浓度(1.5mg/mL)的小鼠抗甲(A)型流感病毒核蛋白单克隆抗体B5A3包被在硝酸纤维素膜上制备检测线。37℃干燥。喷点量为0.1μL/mm。

质控线：取0.5mg/mL山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，在纤维膜上制备质控线，37℃干燥。喷点量为0.1μL/mm。

4、检验方法

将检测卡(检测条)、样本稀释液和样本恢复至18～30℃。检测卡或检测条检测方法如下：

a.从铝箔袋中取出检测卡或检测条，做好样本标记，放在水平工作台面上平置；

b.取20μL鼻咽或口咽拭子样本提取液直接加入到加样孔中(检测卡)或指示箭头下端的加样处(检测条)；

c.再加入100μL(2～3滴)样本稀释液；

d.15～20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。

5、检验结果的解释

a.检测线阳性：检测线和质控线显色。提示样本检出甲(A)型流感病毒的核蛋白抗原，可能处于早期感染或现症感染，需结合临床症状进行最终的确认。

b.阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。表示样本未检出甲(A)型流感病毒的核蛋白抗原。

c.无效：检测窗无红色质控线出现。

实施例4流感病毒抗原侧向流免疫层析试剂性能测试

1、灵敏度测试

a.灭活流感病毒培养物测试

使用本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂检测灭活流感病毒培养物，最低可测试到低至10TCID₅₀/mL的病毒培养物。

TCID₅₀/mL即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。注意：这里的病毒量不是具体的浓度，而是将原始样品稀释的倍数。例如，1mL培养液，稀释1000倍后恰好导致50％的细胞感染，则TCID₅₀为1000/mL。表示每mL样品中含有的病毒导致50％细胞感染需要稀释的倍数。

因此，TCID₅₀数值越大，灭活上清的原液病毒拷贝数越多，需要稀释倍数越大(达到感染50％细胞的效果)，然后用相应的灭活上清的原液分别检测试剂盒试纸，相应的梯度结果如图3所示。10TCID₅₀/mL代表原液病毒拷贝数最少的样本。即，最低可测试到低至100TCID₅₀/mL的病毒培养物。

b.纯化后的甲(A)型流感病毒核蛋白测试

采用杭州华葵金配生物科技有限公司生产的甲(A)型流感病毒核蛋白溶液标准物质对本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂进行检测。如图4所示，可检出最低达500pg/mL甲(A)型流感病毒的标准重组核蛋白。

2、特异性测试(临床样本测试)

使用本发明所述抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂检测20例正常人的鼻拭子样本，检测结果如图5所示。由图5可以看出，检测结果清晰可见，背景干净，表明该产品特异性良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.靶向甲型流感病毒核蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别为ETSENIYSNLA、VATRLVD和QHFWLTPWT，所述抗体的重链高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别为NYLMN、WINTNTGHPTYAEDFKG和VGKTYSMGNSMDY。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2所示。

3.权利要求1或2所述抗体在制备甲型流感病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

4.由权利要求1或2所述抗体制备的甲型流感病毒检测试剂或试剂盒。

5.权利要求1或2所述抗体在制备甲型流感病毒胶体金免疫层析检测试纸条或试剂盒中的应用。

6.权利要求1或2所述抗体在制备甲型流感病毒侧向流免疫层析诊断试剂盒中的应用。

7.甲型流感病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上；

其中，所述胶体金结合垫上包被有胶体金标记的靶向甲型流感病毒核蛋白的抗体II；所述检测线包被有权利要求1或2所述抗体，所述质控线包被有羊抗鼠多抗；

其中，所述靶向甲型流感病毒核蛋白抗体II的轻链、重链的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3、4所示。

8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述胶体金结合垫上包被的抗体II的浓度为10-15μg/mL；

所述检测线上包被的抗体的浓度为1.5-2mg/mL。

9.根据权利要求7或8所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫、所述吸水垫的材质为纤维素，所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维。

10.编码权利要求1或2所述抗体的核酸。

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