CN115697298A - 脂质纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂质纳米颗粒(LNP)领域;更具体地,包含可电离的脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和一种或多种核酸。本发明的LNP的特征在于包含低于约1摩尔%的C18‑PEG2000脂质。本发明提供了LNP用于核酸分子,特别是mRNA的免疫原性递送的用途;从而使它们非常适合用于疫苗,例如用于治疗癌症或感染性疾病。最后,提供了制备这样的LNP的方法。
Description
发明领域
本发明涉及脂质纳米颗粒(LNP)领域;更具体地包含可电离的脂质、磷脂、甾醇、PEG脂质和一种或多种核酸。本发明的LNP的特征在于,其包含小于约1摩尔%的PEG脂质(如二C18-PEG2000脂质)。本发明提供了LNP用于核酸分子,特别是mRNA的免疫原性递送的用途;从而使它们非常适合用于疫苗,例如用于治疗癌症或传染性疾病。最后,提供了用于制备这样的LNP的方法。
发明背景
生物活性物质的靶向递送领域的主要挑战之一通常是它们的不稳定性和低细胞穿透潜力。对于核酸分子,特别是(m)RNA分子的递送,情况尤其如此。因此,适当的包装对于充分的保护和递送是至关重要的。因此,持续需要用于包装生物活性物质如核酸的方法和组合物。
在这方面,基于脂质的纳米颗粒组合物例如脂质复合物(lipoplex)和脂质体已经用作生物活性物质的包装载体,以允许运输到细胞和/或细胞内区室中。这些基于脂质的纳米颗粒组合物通常包含不同脂质的混合物,所述脂质例如阳离子脂质、可电离的脂质、磷脂、结构脂质(例如甾醇或胆固醇)、PEG(聚乙二醇)脂质、…(如Reichmuth等人,2016中综述的)。
已经开发了由4种脂质(阳离子或可电离的脂质、磷脂、甾醇和聚乙二醇化脂质)的混合物组成的基于脂质的纳米颗粒,用于在全身施用后将siRNA和mRNA非免疫原性递送到肝脏。虽然许多这样的脂质组合物是本领域已知的,但是用于体内mRNA递送的那些通常包含至少1.5摩尔%水平的PEG脂质,并且经常含有基于二C14的PEG脂质(DMG-PEG脂质)。
然而,我们目前惊奇地发现,以低量(即小于约1摩尔%)存在于LNP中的PEG脂质产生了非常适于在全身注射LNP后免疫原性递送mRNA的纳米颗粒。此外,对于更长链的PEG脂质如二C18-PEG脂质,这些作用甚至更显著。
发明内容
在第一方面,本发明提供了包含一种或多种脂质纳米颗粒的mRNA疫苗,所述脂质纳米颗粒包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
在另一方面,本发明提供了用于mRNA疫苗接种的脂质纳米颗粒(LNP),所述LNP包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
在另一方面,本发明提供了脂质纳米颗粒(LNP),其包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种核酸分子;
其特征在于,所述PEG脂质是二C18-PEG2000脂质;并且所述LNP含有少于约1摩尔%的所述PEG脂质。
在本发明的一个具体实施方案中,所述二C18-PEG2000脂质选自:基于二硬脂酰基的PEG2000脂质,如DSG-PEG2000脂质或DSPE-PEG2000脂质;或基于二油酰基(dioleolyl)的PEG2000脂质,如DOG-PEG2000脂质或DOPE-PEG2000脂质。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述LNP含有约0.5摩尔%的所述PEG脂质。
在本发明的另一个具体实施方案中,所述可电离的脂质选自:
-1,1‘-((2-(4-(2-((2-(二(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)二(十二烷-2-醇)(C12-200);
-4-二甲基氨基丁酸二亚油基甲酯(DLin-MC3-DMA);或
-式(I)的化合物:
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
在优选的实施方案中,所述可电离的脂质是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基且X为
在本发明的另一个实施方案中,所述磷脂选自:1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)及其混合物。
在本发明的另一个实施方案中,所述甾醇选自胆固醇、麦角固醇、菜油甾醇、氧甾醇、樟芝甾醇(antrosterol)、链甾醇、尼卡甾醇(nicasterol)、谷甾醇和豆甾醇;优选胆固醇。
在另一个具体实施方案中,所述LNP含有30-70摩尔%的所述可电离的脂质;优选45-65摩尔%。
在本发明的又一个实施方案中,所述LNP含有约或少于45摩尔%的所述甾醇。
在另外的实施方案中,所述LNP包含5-25摩尔%的磷脂;优选4-15摩尔%。
在本发明的一个具体实施方案中,所述LNP包含:
-约45-65摩尔%的所述可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的另一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的另一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约50摩尔%的所述可电离的脂质;
-约6摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的另一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约50摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的另一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约60摩尔%的所述可电离的脂质;
-约12摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的另一个实施方案中,所述一种或多种核酸分子选自mRNA和DNA,优选mRNA。
在一个更具体的实施方案中,所述一种或多种mRNA分子选自编码免疫调节多肽的mRNA和/或编码抗原的mRNA。所述编码免疫调节的mRNA可以例如选自编码CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子。
在另一方面,本发明提供了包含一种或多种如本文定义的脂质纳米颗粒和可接受的药用载体的药物组合物或疫苗。
本发明还提供了如本文所定义的脂质纳米颗粒、药物组合物或疫苗,其用于人类或兽医学;特别是用于治疗癌症或感染性疾病。
附图说明
现在具体参考附图,要强调的是,所示的细节仅是示例性的,并且仅是为了说明性地讨论本发明的不同实施方案。提出它们是为了提供被认为是对本发明的原理和概念方面最有用和最容易描述本发明的原理和概念方面的内容。在这方面,没有试图以比基本理解本发明所必需的更多的细节示出本发明的结构细节。附图说明使如何在实践中体现本发明的几种形式对于本领域技术人员是显而易见的。
图1:在用在LNP组合物中与不同百分比的DMG-PEG2000和DSG-PEG2000配制的mRNALNP第一次次静脉内免疫后,测量E7特异性CD8 T细胞应答的强度。双因素ANOVA与Tukey多重比较检验ns,不显著;***p<0.001。
图2:在用与恒定百分比的DMG-PEG2000、DPG-PEG2000或DSG-PEG2000 LNP配制的mRNA LNP第二次静脉内免疫后,测量E7特异性CD8 T细胞应答的强度。
图3:在用mRNA LNP或合成长肽第四次静脉内免疫后,测量E7特异性CD8 T细胞应答的强度。单因素ANOVA与Tukey多重比较检验。ns,**p<0.01,****p<0.0001。
图4:针对最大T细胞应答的DOE驱动的LNP组合物的优化。A.在用DOE文库的E7mRNA LNP免疫三次(每次间隔一周)后,血液中的E7特异性T细胞。B.描绘E7特异性CD8 T细胞应答随DSG-PEG2000%变化的图表。在第3次免疫后,在PEG-脂质%和E7特异性CD8 T细胞应答的强度之间观察到高度显著的负相关。C.显示了用预测的最佳(LNP36)和非最佳DSG-PEG2000 LNP(LNP37)平均值±SD三次免疫(每次间隔一周)后血液中的E7特异性T细胞。统计学通过单因素ANOVA与Sidak多重比较检验评估。***p<0.001
图5:优化的mRNA LNP疫苗诱导定性的T细胞应答和强的抗肿瘤功效。A.血液中E7特异性CD8+ T细胞的动力学。B.血清中IFN-γ随重复免疫而增加。C.三次免疫后脾中CD8+E7特异性T细胞产生IFN-γ和TNF-α。D.在LNP36免疫的小鼠中的平均TC-1肿瘤生长。E.LNP36免疫的小鼠的存活。F.LNP36免疫两次后的TC-1肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。G.TIL的E7-特异性。A、F、G显示了平均值±SD。B.箱线图,D.显示了平均值±SEM。F、G.统计学通过单因素ANOVA与Tukey多重比较检验评估。E.统计学通过Mantel-Cox对数秩检验评估。**p<0.01,***p<0.001,ns=不显著
图6:LNP被多种(先天性)免疫细胞摄取并激活。A.肾、肺、心脏、肝和脾中的荧光素酶活性占总荧光素酶活性的百分比。B.通过LNP注射的小鼠相对于TBS缓冲液注射的小鼠的Cy5 MFI差异测量的多种细胞类型中LNP的摄取。C.肾、肺、心脏、肝和脾中的荧光素酶活性占总荧光素酶活性的百分比。与非最佳LNP37相比,最佳LNP36在脾中显示出增加的荧光素酶活性。D.与非最佳LNP37相比,最佳LNP36的细胞摄取更高。E.在脾中积累了大量的E7mRNA。F.观察到血清中IFN-a和IP-10细胞因子的瞬时增加(LNP施用后6小时与24小时相比)。G.cDC1和cDC2上的CD86表达被非最佳LNP37弱上调,而被最佳LNP36强上调。A、B、C、D、E、F显示平均值±SD。
发明详述
如上文已经详细描述的,本发明提供了包含一种或多种脂质纳米颗粒的mRNA疫苗,所述脂质纳米颗粒包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
在一个具体实施方案中,本发明提供了包含一种或多种脂质纳米颗粒的mRNA疫苗,所述脂质纳米颗粒包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
本发明还提供了用于mRNA疫苗接种的脂质纳米颗粒(LNP),所述LNP包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
在一个具体实施方案中,本发明提供了用于mRNA疫苗接种的脂质纳米颗粒(LNP),所述LNP包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
因此,本发明提供了包含PEG脂质的LNP,其以相对低的量(例如低于约1摩尔%;特别是约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间)存在,我们惊奇地发现这非常适用于核酸,特别是mRNA的免疫原性递送。特别地,发现这种作用对于包含长链PEG脂质例如C18-PEG脂质,甚至更特别地C18-PEG2000脂质的LNP甚至更显著。“核酸分子的免疫原性递送”是指将核酸分子递送到细胞,由此与细胞接触,所述核酸分子在细胞内的内化和/或表达导致免疫应答的诱导。
因此,在另一方面,本发明提供了脂质纳米颗粒(LNP),其包含:
-可电离的脂质;
-磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种核酸分子;特别是mRNA分子;
其特征在于,所述PEG脂质是C18-PEG2000脂质;并且所述LNP含有少于约1摩尔%的所述PEG脂质。
在一个具体实施方案中,本发明提供了脂质纳米颗粒(LNP),其包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;以及
-一种或多种核酸分子;
其特征在于,所述PEG脂质是C18-PEG2000脂质;并且所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
脂质纳米颗粒(LNP)通常被认为是由不同脂质的组合组成的纳米级颗粒。虽然这样的LNP中可以包括许多不同类型的脂质,但是本发明的LNP通常由可电离的脂质、磷脂、甾醇和PEG脂质的组合组成。
在本申请的上下文中,提供了关于本文公开的脂质纳米颗粒的具体实施方案,在这样的实施方案中提供的限制同样适用于作为要求保护的mRNA疫苗的一部分或意图用于mRNA疫苗接种的脂质纳米颗粒。
如本文所用,术语“纳米颗粒”是指具有使颗粒适于特别是核酸的全身施用,特别是静脉内施用的直径的任何颗粒,通常具有小于1000纳米(nm),优选小于500nm,甚至更优选小于200nm,例如50至200nm;优选80至160nm的直径。
在本发明的上下文中,术语“PEG脂质”或供选择地“PEG化脂质”是指用PEG(聚乙二醇)基团修饰的任何合适的脂质。在本发明的上下文中特别合适的PEG脂质的特征在于二C18-PEG脂质。在本发明的上下文中使用术语C18-PEG脂质时,其是指二C18-PEG脂质,即具有2个C18脂质尾部的脂质。然而,也可以适合地使用短链PEG脂质,例如dC14-PiEG脂质(例如DMG-PEG,更特别地DMG-PEG2000;或DMPE-PEG,更特别地DMPE-PEG2000)或二C16-PEG脂质。二C18-PEG脂质包含聚乙二醇部分,其限定了脂质的分子量,以及包含18个C原子的脂肪酸尾部。在一个具体实施方案中,所述二C18-PEG2000脂质选自:基于二硬脂酰基的PEG2000脂质,例如DSG-PEG2000脂质(2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)或DSPE-PEG2000脂质(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]);或基于二油酰基的PEG2000脂质,如DOG-PEG2000脂质(1,2-二油酰基-rac-甘油)或DOPE-PEG2000脂质(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000])。
在本发明的上下文中,在化合物或脂质的上下文中的术语“可电离的”(或供选择地为阳离子的)意指所述化合物或脂质中存在任何不带电荷的基团,其能够通过产生离子(通常为H+离子)而解离并因此本身带正电。供选择地,所述化合物或脂质中的任何不带电荷的基团可产生电子并因此带负电。
在本发明的上下文中,可以适当地使用任何类型的可电离的脂质。具体地,合适的可电离的脂质是可电离的氨基脂质,其包含通过S-S键连接的两个相同或不同的尾部,所述尾部各自包含可电离的胺,例如由以下所示的:
在一个具体的实施方案中,所述可电离的脂质是式(I)的化合物:
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
这样的可电离的脂质可以具体地由下式中的任一个表示:
更具体地,所述可电离的脂质是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基且X是
如表示为
其它合适的可电离的脂质可以选自1,1‘-((2-(4-(2-((2-(二(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)二(十二烷-2-醇)(C12-200);和4-二甲基氨基丁酸二亚油基甲酯(DLin-MC3-DMA)。
因此,在一个具体实施方案中,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-磷脂;
-甾醇;
-以小于约1摩尔%存在的二C18-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明的上下文中,术语“磷脂”是指由两个疏水性脂肪酸“尾部”和由磷酸基团构成的亲水性“头部”组成的脂质分子。这两种组分最常通过甘油分子结合在一起,因此,在本发明的磷脂中,优选是甘油-磷脂。此外,磷酸基团经常被简单的有机分子例如胆碱(即产生磷酸胆碱)或乙醇胺(即产生磷酸乙醇胺)修饰。
在本发明的上下文中,合适的磷脂可以选自:1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC),1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC),1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC),1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC),1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC),1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC),1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC),1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC),1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC),1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16溶血PC),1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,1,2-二(二十二碳己酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱,1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE),1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,1,2-二(二十二碳己酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG),鞘磷脂,及其混合物。
在一个更具体的实施方案中,所述磷脂选自:1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)及其混合物。
因此,在一个具体实施方案中,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-甾醇;
-以小于约1摩尔%存在的二C18-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明的上下文中,术语“甾醇”(也称为类固醇)是类固醇的一个亚类,其天然存在于植物、动物和真菌中,或者可以由一些细菌产生。在本发明的上下文中,可以使用任何合适的甾醇,例如选自:胆固醇、麦角固醇、菜油甾醇、氧甾醇、樟芝甾醇、链甾醇、尼卡甾醇、谷甾醇和豆甾醇;优选胆固醇。
因此,在一个具体实施方案中,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-胆固醇;
-以小于约1摩尔%存在的二C18-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明的一个非常具体的实施方案中,所述脂质纳米颗粒包含:
-式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-胆固醇;
-以小于约1摩尔%存在的DSG-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明的另一个非常具体的实施方案中,所述脂质纳米颗粒包含:
-式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-胆固醇;
-以小于约1摩尔%存在的DSPE-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明的一个具体实施方案中,所述LNP包含可电离的脂质与磷脂之比为约8:1,供选择地约6:1、约4:1或约2:1。
在另一个具体实施方案中,所述LNP包含约30-70摩尔%和介于30-70摩尔%之间的所述可电离的脂质;优选约45至65摩尔%和介于45至65摩尔%之间;例如约65摩尔%、约或高于45摩尔%、约或高于50摩尔%、约或高于55摩尔%、约或高于60摩尔%。
在进一步的实施方案中,所述LNP包含4-25摩尔%的磷脂;优选4-15摩尔%;例如约4摩尔%、约5摩尔%、约6摩尔%、约7摩尔%、约8摩尔%、约9摩尔%、约10摩尔%、约11摩尔%、约12摩尔%、约13摩尔%、约14摩尔%或约15摩尔%;优选约6摩尔%至9摩尔%和介于6摩尔%至9摩尔%之间。
因此,在本发明的一个具体实施方案中,适用以下一种或多种:
-所述LNP包含约45摩尔%至65摩尔%和介于45摩尔%至65摩尔%之间的所述可电离的脂质;
-所述LNP包含约4摩尔%至15摩尔%和介于4摩尔%至15摩尔%之间的所述磷脂;
-所述LNP包含约0.5摩尔%至0.9摩尔%和介于0.5摩尔%至0.9摩尔%之间的所述PEG脂质;
余量为所述甾醇。
因此,在本发明的一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约45-65摩尔%的式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO选自:肉豆蔻酰基、α-D-生育酚琥珀酰基、亚油酰基和油酰基;且
X选自:
特别是式(I)的脂质,其中RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,且X是
-约4-15摩尔%的选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-胆固醇至余量;
-约0.5-0.9摩尔%的DSG-PEG2000脂质或DSPE-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在使用摩尔%的本发明的上下文中,其意指相对于空纳米颗粒的指定组分的摩尔%,即在没有核酸的情况下的指定组分的摩尔%。这意味着组分的摩尔%是相对于存在于所述LNP中的可电离的脂质、磷脂、甾醇和PEG脂质的总量计算的。
在另一个具体实施方案中,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-60摩尔%以上的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
更特别地,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
更特别地,本发明提供了脂质纳米颗粒,其包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
在本发明的一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约64.4摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约27.1摩尔%的所述甾醇;以及
-约0.5摩尔%的所述PEG脂质。
因此,在本发明的一个非常具体的实施方案中,所述LNP包含:
-约64.4摩尔%的式(I)的可电离的脂质;
其中:
RCOO为α-D-生育酚琥珀酰基,X为
-约8摩尔%的选自DOPC和DOPE或其混合物的磷脂;
-约27.1摩尔%的胆固醇;
-约0.5摩尔%的DSG-PEG2000脂质或DSPE-PEG2000脂质;以及
-一种或多种核酸分子。
在本发明上下文中的其它特别合适的LNP的组成如表1所示。
表1:合适的LNP的组成
其它特别合适的LNP的特征在于可电离的脂质/磷脂/甾醇/C18-PEG2000脂质的比例为:
-64.4/8/27.1/0.5
-58/14.5/27/0.5
-48/25.5/27/0.5
-53/17.67/28.58/0.75
本发明人已经发现本发明的LNP特别适用于核酸的免疫原性递送。因此,本发明提供了包含一种或多种核酸分子的LNP,所述核酸分子例如DNA或RNA,更具体地是mRNA。
所述LNP中的核酸的量通常由N/P比表示,即,可电离的脂质中的氮原子与核酸中的磷酸基团之比。在本发明的上下文中,LNP的N/P比为约4:1至16:1和介于4:1至16:1之间。
在本发明的上下文中,“核酸”是脱氧核糖核酸(DNA)或优选为核糖核酸(RNA),更优选为mRNA。根据本发明,核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。根据本发明的核酸可以是单链或双链且线性或共价封闭以形成环的分子形式。核酸可以用于例如以RNA的形式引入(即转染)细胞,该RNA可以通过从DNA模板体外转录来制备。此外,可以在应用之前通过稳定序列、加帽和/或聚腺苷酸化来修饰RNA。
在本发明的上下文中,术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA,单链RNA,分离的RNA,例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA,合成的RNA,重组产生的RNA,以及修饰的RNA,其与天然存在的RNA的区别在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变。这样的改变可包括将非核苷酸物质添加到例如RNA的末端或内部,例如RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸,例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物。核酸可以包含在载体中。如本文所用,术语“载体”包括技术人员已知的任何载体,包括质粒载体,粘粒载体,噬菌体载体例如λ噬菌体,病毒载体例如腺病毒或杆状病毒载体,或人工染色体载体例如细菌人工染色体(BAC),酵母人工染色体,或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明,术语“RNA”包括并优选地涉及“mRNA”,其意指“信使RNA”并且涉及可以使用DNA作为模板产生并编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5'非翻译区(5-UTR)、蛋白质或肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。mRNA在细胞中和在体外具有有限的半衰期。优选地,使用DNA模板通过体外转录产生mRNA。在本发明的一个实施方案中,通过体外转录或化学合成获得RNA。体外转录方法是技术人员已知的。例如,有许多可商购获得的体外转录试剂盒。
在本发明的一个具体实施方案中,所述mRNA分子是编码免疫调节蛋白的mRNA分子。
在本发明的上下文中,术语“编码免疫调节蛋白的mRNA分子”是指编码改变抗原呈递细胞(更特别地树突状细胞)的功能性的蛋白的mRNA分子。这样的分子可以选自包含以下的列表:CD40L,CD70,caTLR4,IL-12p70,EL-选择蛋白,CCR7和/或4-1BBL,ICOSL,OX40L,IL-21;尤其是CD40L、CD70和caTLR4中的一种或多种。本发明的方法中使用的免疫刺激因子的优选组合是CD40L和caTLR4(即“DiMix”)。在另一个优选的实施方案中,使用CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激分子的组合,其在本文中也称为“TriMix”。
在另一个具体的实施方案中,所述mRNA分子是编码抗原和/或疾病特异性蛋白的mRNA分子。
根据本发明,术语“抗原”包括任何分子,优选肽或蛋白质,其包含将引发免疫应答和/或免疫应答所针对的至少一个表位;因此,术语抗原也包括来自抗原的最小表位。本文定义的“最小表位”是指能够引发免疫应答的最小结构。优选地,在本发明的上下文中,抗原是任选地在加工后诱导免疫应答的分子,该免疫应答优选对抗原或表达该抗原的细胞是特异性的。特别地,“抗原”涉及这样的分子,其任选地在加工后由MHC分子呈递并与T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。
在一个具体的实施方案中,抗原是靶标特异性抗原,其可以是肿瘤抗原,或细菌、病毒或真菌抗原。所述靶标特异性抗原可源自以下任一种:从(一种或多种)靶细胞分离的总mRNA,一种或多种特异性靶mRNA分子,(一种或多种)靶细胞的蛋白裂解物,来自(一种或多种)靶细胞的特异性蛋白,或合成的靶标特异性肽或蛋白质以及编码靶标特异性抗原或其衍生肽的合成的mRNA或DNA。
为了避免任何误解,本发明的LNP可以包含单个mRNA分子,或者它们可以包含多种mRNA分子,例如编码免疫调节蛋白的一种或多种mRNA分子和/或编码抗原和/或疾病特异性蛋白质的一种或多种mRNA分子的组合。
在非常具体的实施方案中,所述编码免疫调节分子的mRNA分子可以与编码抗原特异性蛋白和/或疾病特异性蛋白的一种或多种mRNA分子组合。例如,本发明的LNP可以包含编码免疫刺激分子CD40L、CD70和/或caTLR4的mRNA分子(例如Dimix或Trimix);与编码抗原特异性蛋白和/或疾病特异性蛋白的一种或多种mRNA分子组合。因此,在非常具体的实施方案中,本发明的LNP包含编码CD40L、CD70和/或caTLR4的mRNA分子;与编码抗原特异性蛋白和/或疾病特异性蛋白的一种或多种mRNA分子组合。
在另一方面,本发明提供了包含一种或多种如本文定义的LNP的药物组合物。这样的药物组合物特别适合作为疫苗。因此,本发明还提供了包含一种或多种根据本发明的LNP的疫苗。
在本发明的上下文中,本文所用的术语“疫苗”是指旨在提供针对疾病的适应性免疫(抗体和/或T细胞应答)的任何制剂。为此,本文所指的疫苗包含编码抗原的至少一种mRNA分子,其中所述抗原引发适应性免疫应答。该抗原可以以微生物的弱化或杀死的形式、蛋白质或肽或编码核酸的抗原的形式存在。在本发明的上下文中,抗原是指被宿主的免疫***识别为异源的蛋白质或肽,从而刺激针对其的抗体的产生,目的是对抗此类抗原。疫苗可以是预防性的(例如:预防或减轻任何天然或“野生”病原体的未来感染的影响)或治疗性的(例如,积极治疗或减轻正在发生的疾病的症状)。疫苗的施用称为疫苗接种。
本发明的疫苗可用于诱导免疫应答,特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫应答,例如针对癌症的免疫应答。因此,疫苗可以用于预防性和/或治疗性治疗涉及疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的疾病,例如癌症。优选地,所述免疫应答是T细胞应答。在一个实施方案中,疾病相关抗原是肿瘤抗原。由本文所述的纳米颗粒中包含的RNA编码的抗原优选为疾病相关抗原或引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫应答。
本发明的LNP和疫苗特别地意图用于静脉内施用,即将液体物质直接输注到静脉中。静脉内途径是在整个体内(即全身性)递送液体和药物的最快方法。因此,本发明提供了静脉内疫苗,以及所公开的疫苗和LNP用于静脉内施用的用途。因此,本发明的疫苗和LNP可以静脉内施用。本发明还提供了根据本发明的疫苗和LNP的用途;其中疫苗是静脉内施用的。
本发明还提供了用于人类或兽医学的根据本发明的LNP、药物组合物和疫苗。还考虑根据本发明的LNP、药物组合物和疫苗用于人类或兽医学的用途。最后,本发明提供了一种用于通过向有需要的受试者施用根据本发明的LNP、药物组合物和疫苗来预防和治疗人类和兽类疾病的方法。
本发明进一步提供了根据本发明的LNP、药物组合物或疫苗用于所述一种或多种核酸分子的免疫原性递送的用途。因此,本发明的LNP、药物组合物和疫苗在治疗若干人类和兽类疾病中非常有用。因此,本发明提供了用于治疗癌症或传染性疾病的本发明的LNP、药物组合物和疫苗。
本发明的脂质纳米颗粒可以根据如在实施例部分中指定的方案制备。更通常地,LNP可使用包括以下步骤的方法制备:
-制备第一醇组合物,所述第一醇组合物包含所述可电离的脂质、所述磷脂、所述甾醇、所述PEG脂质和合适的醇溶剂;
-制备包含所述一种或多种核酸和水性溶剂的第二水性组合物;
-在微流体混合装置中混合所述第一组合物和所述第二组合物。
更详细地,将脂质组分以合适的浓度组合在醇溶媒例如乙醇中。另外,添加包含核酸的水性组合物,然后将其装载在微流体混合装置中。
微流体混合的目的是在微型装置中实现多种样品(即脂质相和核酸相)的彻底和快速混合。通常通过增强不同物质流之间的扩散作用来实现这种样品混合。另外,可以使用几种微流体混合装置,例如在Lee等人,2011中综述的。根据本发明的特别合适的微流体混合装置是来自Precision Nanosystems的NanoAssemblr。
其它适于制备本发明的LNP的技术包括将各组分分散在合适的分散介质,例如水性溶剂和醇溶剂中,并应用一种或多种下列方法:乙醇稀释法、简单水合法、超声处理、加热、涡旋、***注入法、弗氏压碎器法(French press method)、胆酸法、Ca2+融合法、冻融法、反相蒸发法、T型结混合、微流体水力聚焦、交错人字形混合等。
实施例
实施例1和2的材料和方法
小鼠
雌性C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories(法国),并饲养在具有标准垫料和笼富集(cage enrichment)的单独通风的笼中。根据动物实验的机构(布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel))和欧盟指南对动物进行饲养和处理。小鼠可随意获取食物和水。当小鼠6至10周龄时开始实验。每2天监测小鼠的体重。
在用ADPGK合成长肽(SLP)疫苗接种的情况下,以相同的时间间隔向小鼠腹膜内注射50μg ADPGK SLP(GIPVHLELASMTNMELMSSIVHQQVFPT(SEQ ID NO:3),Genscript)、50μg抗-CD40 Mab(克隆FJK45,BioXCell)和100μg pIC HMW(InvivoGen)在200μl PBS中的组合。
mRNA合成和纯化
根据WO2015071295所述的方案,通过eTheRNA通过体外转录(IVT)由eTheRNA质粒pEtherna制备加帽的、非核苷修饰的E7和ADPGK mRNA。编码HPV16-E7或ADPGK蛋白的序列在信号序列和人DC-LAMP的跨膜和胞质区之间被框内克隆。将该嵌合基因克隆到pEtherna质粒中,该质粒在5'端富含翻译增强子,在3'端富含RNA稳定序列。IVT后,通过纤维素纯化除去dsRNA。纤维素粉末购自Sigma,在含16%乙醇的1xSTE(氯化钠-Tris-EDTA)缓冲液中洗涤。将IVT mRNA(在含16%乙醇的1xSTE缓冲液中)加入到洗涤的纤维素沉淀中,并在室温下振摇20分钟。然后使该溶液通过真空过滤器(Corning)。洗脱液含有ssRNA级分并用于所有实验。通过毛细管凝胶电泳(Agilent,比利时)监测mRNA质量。
基于mRNA脂质的纳米颗粒的生成
使用NanoAssemblr Benchtop(Precision Nanosystems),通过以9mL/min的速度,以2:1的体积比微流体混合乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4)中的mRNA溶液和脂质溶液来制备基于脂质的纳米颗粒。脂质溶液含有Coatsome-EC(NOF公司)、DOPE(Avanti)、胆固醇(Sigma)和下列PEG脂质之一的混合物:DMG-PEG2000(C14脂质)(Sunbright GM-020,NOF公司)、DPG-PEG2000(C16脂质)(Sunbright GP-020,NOF公司)、DSG-PEG2000(C18脂质)(Sunbright GS-020,NOF公司)。将4种脂质以不同的摩尔比混合。使用slide-a-lyzer透析盒(20K MWCO,3mL,ThermoFisher)用TBS透析LNP(TBS体积是LNP体积的10000倍)。用Zetasizer Nano(Malvern)测量大小、多分散性和ζ电势。mRNA包封百分比通过ribogreen试验(ThermoFisher)测量。
流式细胞术
在免疫后约6天从处理的小鼠和对照小鼠中收集血液。根据生产商的说明书(MBLInternational)裂解红细胞,并用APC标记的E7(RAHYNIVTF)-四聚体(SEQ ID NO:1)或ADPGK(ASMTNMELM)-四聚体(SEQ ID NO:2)对剩余的白细胞染色。洗去过量的四聚体。此后,将表面分子的抗体混合物(列于表2)加入到细胞中,并在4℃下孵育30分钟,在LSR Fortessa或Attune细胞仪上获得数据,并用Flow Jo软件分析。
表2:用于E7-和Adpgk-特异性T细胞的数目/百分比的流式细胞术分析的抗体列表
抗体 | 荧光染料 | 克隆 | 公司 |
活力染料 | Zombie Aqua | n.a. | BioLegend |
CD3 | PerCPeF710 | 17A2 | eBioscience(Thermo Fisher) |
CD8 | V450 | 53-6.7 | BD Horizon |
结果
C18-PEG2000和低PEG百分比的选择
实施例1-E7抗原
小鼠接受单次(图1)或两次(图2)包装在LNP(50/10/(40-x)/x可电离的脂质/DOPE/胆固醇/PEG-脂质)中的10μg E7 mRNA的静脉内施用。免疫后6天测定血液中E7特异性CD8+ T细胞的百分比。图1显示与具有中等(1.5%)或高(4.5%)PEG百分比的LNP相比,具有低PEG百分比(0.5%)的LNP诱导更强的抗原特异性免疫应答。图1和2均表明DSG-PEG2000(C18)在引发免疫应答方面优于较短碳链的PEG脂质如DMG-PEG2000(C14)和DPG-PEG2000(C16)。
实施例2-ADPGK抗原
小鼠接受包装在低百分比PEG LNP中的10μg ADPGK mRNA(50/10/39.5/0.5可电离的脂质/DOPE/胆固醇/PEG-脂质)或50μg ADPGK合成长肽(SLP)的四次静脉内施用。第四次免疫后6天测定血液中ADPGK特异性CD8+ T细胞的百分比。DSG-PEG2000(C18)LNP在引发抗原特异性免疫应答方面优于DMG-PEG2000(C14)LNP(图3)。两种LNP都比SLP更具免疫原性。
实施例3-6的材料和方法
动物
所有小鼠实验都是在UMC Utrecht的Utrecht动物福利机构(Utrecht AnimalWelfare Body)或Ghent大学的动物伦理委员会批准下进行的。动物护理根据已建立的指导原则。所有小鼠都可以不受限制地获得水和标准实验动物食物。雌性C57Bl/6J小鼠获自Charles River Laboratories,Inc.(德国/法国)。从Jackson Laboratory(USA)获得μMT小鼠。根据当地的规定,在Chares River Laborotories(法国)进行非人灵长类动物的非GLP研究。
mRNA合成和纯化
密码子优化的E7、TriMix和荧光素酶mRNA通过eTheRNA通过体外转录(IVT)由eTheRNA质粒制备。没有使用核苷酸修饰。DoE中使用的E7 mRNA是ARCA加帽的。所有后面的实验都是使用CleanCapped mRNA进行的。IVT后,通过纤维素纯化除去dsRNA。通过毛细管凝胶电泳(Agilent,比利时)监测mRNA质量。
LNP的制备和表征
对于生物分布和细胞摄取研究,将1:1比例的编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA(eTheRNA免疫疗法NV)和Cy5标记的Fluc mRNA(TriLink Biotechnologies)的混合物装载到LNP中。为了进行DoE免疫原性研究,将E7 mRNA装载到LNP中。所有其他研究均使用E7、CD40L、CD70和TLR4 mRNA的3:1:1:1比例的混合物进行。将mRNA稀释在100mM乙酸钠缓冲液(pH 4)中,将脂质溶解并稀释在乙醇中。使用NanoAssemblr Benchtop微流体混合***(Precision Nanosystems)混合mRNA和脂质溶液,然后用Tris缓冲盐水(TBS,20mMTris,0.9%NaCl,pH 7.4)透析过夜。使用Amicon超离心过滤器(10kD)浓缩LNP。用Zetasizer Nano(Malvern)测量大小、多分散指数和ζ电势。mRNA包封效率通过ribogreen试验(ThermoFisher)测定。所有LNP的组成总结于实施例3的表3中。
生物分布和细胞摄取
小鼠通过尾静脉注射10μg在所选LNP制剂中的mRNA。4小时后,用250μL戊巴比妥(6mg/mL)麻醉小鼠。将血液样品收集在含有凝胶凝血因子(Sarstedt)的试管中。随后,打开胸腔,切开门静脉,并通过右心室向小鼠灌注7mL PBS。取出器官并在液氮中快速冷冻。对于肝和脾组织,将器官的一部分保存在冰冷的PBS中用于流式细胞术分析。
细胞摄取
将肝和脾组织置于具有RPMI 1640培养基的培养皿中,所述RPMI 1640培养基分别含有1mg/mL胶原酶A(Roche)或20μg/mL释放酶TM(Roche),以及10μg/mL等级II的DNA酶I(Roche)。使用手术刀片将组织切碎并在37℃下孵育30分钟。随后,使组织悬液通过100μm尼龙细胞过滤器。将肝悬液在70×g下离心3分钟以除去实质细胞。将上清液和脾悬液以500×g离心7分钟以沉淀细胞。将红细胞在ACK缓冲液(Gibco)中裂解5分钟,用PBS灭活,随后通过100μm细胞过滤器。用含有1%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640洗涤细胞,与台盼蓝混合,并使用Luna-II自动细胞计数器(Logos Biosystems)计数。将3×105个(肝)或6×105个(脾)活细胞接种在96孔板中,以500×g沉淀5分钟,并重悬于含50%Brilliant染色缓冲液(BDBiosciences)和2μg/mL TruStain FcX(BioLegend)的2%BSA的PBS溶液(2%PBSA)中。细胞在冰上孵育10分钟,并与含有适用抗体混合物(总共三种)的2%PBSA以1:1一式两份地混合。细胞在振荡器上于室温下孵育15分钟,用2%PBSA洗涤两次,并重悬于含有0.25μg/mL7-AAD活力染料(Biolegend)的2%PBSA中。样品在4-激光BD LSRFortessa流式细胞仪上获得。使用FlowJo软件进行分析。
全身分布
将约50-100mg的每种组织切开,称重并放入2mL微型管中,所述微型管具有一层约5mm的1.4mm陶瓷珠(Qiagen)。对于每毫克组织,加入3μL冷细胞培养物裂解试剂(Promega),并在4℃下用Mini-BeadBeater-8(BioSpec)全速匀浆组织60s。匀浆保存在-80℃下,解冻,在4℃下于10.000×g离心10分钟以除去珠和碎片,上清液再次保存在-80℃下。将十微升每种裂解物一式两份地等分于白色96孔板中。使用配备有进样器的SpectraMax iD3读板器,将50μL荧光素酶分析试剂(Promega)分散在每个孔中,同时混合,随后延迟2秒,并记录荧光素酶发射10秒。针对从注射TBS的小鼠的器官裂解物获得的背景信号将荧光素酶活性进行归一化。
T细胞应答
以每周的间隔用10μg在选择的LNP中的mRNA经尾静脉对小鼠进行静脉内免疫。在免疫后5至7天收集血液用于流式细胞术染色。在红细胞裂解后,将细胞与FcR阻断剂和活力染料一起孵育。孵育和洗涤后,加入APC标记的E7(RAHYNIVTF)-四聚体,并在RT下孵育30分钟。洗去过量的四聚体,将表面分子CD3、CD8的抗体混合物加入细胞中,在4℃下孵育30分钟,在3-激光AtuneNxt流式细胞仪或4-激光BD LSRFortessa流式细胞仪上采集样本。
在第三次免疫后7天,测定脾中细胞内细胞因子的产生。通过压碎脾、裂解红细胞并在40μM细胞滤器上过滤样品来制备脾细胞的单细胞悬液。将200,000个细胞/孔/样品一式两份铺板于96孔板中。加入4μg E7肽(Genscript)用于刺激,然后在37℃下孵育细胞。在肽刺激1小时后加入GolgiPlug(BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences))。将细胞再孵育4小时。此后,用FcR阻断剂和活力染料孵育细胞。孵育和洗涤后,加入APC标记的E7(RAHYNIVTF)-四聚体,并在RT下孵育30分钟。洗去过量的右旋糖酐,将表面分子CD3和CD8的抗体混合物加入细胞中,并在4℃下孵育30分钟,另外的步骤根据BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)的制造商说明书进行。透化后,将细胞进行IFN-γ和TNF-α染色。在4-激光BD LSRFortessa流式细胞仪上采集样本。使用FlowJo软件进行分析。
免疫细胞激活
小鼠通过尾静脉静脉内注射5μg在所选LNP中的mRNA。4小时后收获脾用于流式细胞术染色。制备脾细胞的单细胞悬液,并与消化缓冲液(含有DNA酶-1和胶原酶-III的DMEM)一起孵育20分钟,同时定期摇动。此后,将样品与Fc阻断剂和活力染料一起孵育。在孵育和洗涤后,用细胞谱系标志物和激活标志物对细胞染色。在3-激光AtuneNxt流式细胞仪上采集样本。使用FlowJo软件进行分析。
TC-1肿瘤实验
TC-1细胞获自莱顿大学医学中心(Leiden University Medical Center)。将50μLPBS中的50万个TC-1细胞皮下注射到小鼠的右胁腹。使用卡尺进行肿瘤测量。肿瘤体积计算为(最小直径2×最大直径)/2。将抗PD-1和同种型对照抗体在PBS中新鲜稀释至200μL/小鼠的200μg浓度,并腹膜内注射。小鼠接受抗PD-1抗体(单一疗法或与mRNA LNP免疫联合)或同种型对照(与LNP免疫联合)。从第一次mRNA LNP免疫后3天开始,到最后一次LNP注射后2周结束,每3至4天注射抗体。为了分析肿瘤浸润淋巴细胞,在第二次mRNA LNP免疫后3天分离肿瘤,并置于充满MACS组织贮存缓冲液(Miltenyi Biotec)的24孔板中。将肿瘤切碎并在消化缓冲液中在常规振摇下孵育1小时。此后,裂解红细胞,并将所有样品在70μM细胞滤器上过滤。在进行染色之前,通过ficoll-paque密度梯度纯化富集淋巴细胞。首先,将细胞与FcR阻断剂和活力染料一起孵育。孵育和洗涤后,加入APC标记的E7(RAHYNIVTF)-四聚体,并在RT下孵育30分钟。洗去过量的四聚体,将表面分子CD45和CD8的抗体混合物加入细胞中,并在4℃下孵育30分钟。在3-激光AtuneNxt流式细胞仪上采集样本。使用FlowJo软件进行分析。
炎性细胞因子
将血液样品收集在含有凝胶凝血因子(Sarstedt)的管中。将凝结的血液样品以10,000g离心5分钟以获得血清。将血清样品储存在-80℃下直至分析。ProcalaPlex多重分析(ThermoFisher)用于确定炎性细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IP-10的浓度。血清样品在分析缓冲液中稀释3倍,并与荧光标记的珠一起孵育120分钟。根据方案进行另外的步骤。在MagPix Intstrutment(Luminex)上采集样本。使用ProcartapPlex分析软件分析数据。
实施例3-为获得最大T细胞应答的LNP组合物的DOE驱动的优化
通过将市售的可电离的脂质Coatsome SS-EC与胆固醇、DOPE和聚乙二醇化的脂质组合,产生LNP文库。DOPE已经是几种被批准的脂质体产品和研究中的mRNA疫苗的一部分。对于本实验,研究了包含DSG-PEG2000脂质的不同LNP组合物。据描述,PEG-脂质的差异行为对静脉内施用的siRNA LNP的药代动力学和药效学具有强烈影响。
设计第一LNP文库以说明脂质摩尔比和PEG-脂质化学是否确实影响由静脉内mRNA-LNP免疫接种引发的T细胞应答,并因此代表可被优化以提高疫苗效力的变量。SS-EC、DOPE和PEG-脂质的摩尔百分比被认为是独立的变量,而胆固醇被认为是填充脂质,以将摩尔百分比补足至100%。通过使用DOE-方法,产生了涉及11个LNP的实验设计(参见表3中的组成)。
表3:DoE实验中DSG-PEG2000 LNP的组成
11种脂质比例均匀分布在实验区域中(数据未显示)。为了进行免疫原性筛选,三次静脉内免疫后血液中E7特异性CD8 T细胞的百分比被认为是要最大化的应答变量。为此,所有LNP包装了编码人***瘤病毒16(HPV16)癌蛋白E7的mRNA作为抗原。结果证实了我们的假设,即CD8 T细胞应答的强度强烈依赖于LNP组成。几种mRNA-LNP疫苗产生超过50%的E7特异性CD8 T细胞应答,而其它mRNA-LNP疫苗几乎不诱导任何应答(图4a)。PEG-脂质化学和PEG-脂质的摩尔%被确定为与E7特异性CD8 T细胞应答的强度相关的关键参数。需要低摩尔百分比的PEG-脂质以获得最大的T细胞应答(图4b)。对于基于DSG-PEG2000的LNP,可电离的脂质的百分比也对免疫原性具有显著的影响。
将贝叶斯回归模型应用于数据以产生可以预测特定LNP组合物的免疫原性的应答表面模型(数据未显示)。每种PEG-脂质化学的应答表面模型的质量由决定系数R2反映,其表明模型能够基于输入变量(SS-EC、DOPE和PEG-脂质%)解释T细胞应答的变异性。对于DSG-PEG2000 LNP,获得0.74的平均R2值。为了验证模型的预测值,评价2种新的LNP组合物(表4)。
表4:DoE实验中DSG-PEG2000 LNP的组成
用LNP36(DSG-PEG2000)免疫的小鼠引发>30%的E7特异性CD8 T细胞的可能性超过90%(最佳LNP),而LNP37(DSG-PEG2000)预计产生差的T细胞应答(非最佳LNP)(图4c)。实验数据在很大程度上与预测匹配,因此成功地验证了该模型。用预测的最佳LNP免疫的所有小鼠确实产生了高于30%的E7特异性CD8 T细胞应答,而用LNP37免疫的小鼠均未引发高于该阈值的T细胞应答(图4c)。
实施例4-最佳mRNA LNP疫苗诱导高强度T细胞应答
癌症免疫疗法的成功受到多种因素的影响,包括T细胞表型、功能性和肿瘤浸润。我们首先评估了由最佳LNP引起的T细胞应答的质量和增强能力。为此,小鼠在第0、7和14天接受三次初免,随后在第50天进行最终免疫。E7 mRNA补充有TriMix,TriMix是一种3种免疫刺激性mRNA的混合物(Bonehill等人,2008),这增加了T细胞应答的强度。
在用E7-TriMix免疫3次后,超过70%的E7特异性T细胞存在于血液中(图5a)。第三次免疫后五周,E7特异性CD8 T细胞的百分比保持高度升高。在施用最终的加强免疫后,观察到E7特异性效应T细胞的快速扩增,因此证明疫苗是可加强的(图5a)。每次免疫都测量到血清中较高的IFN-γ浓度(图5b),反映了E7特异性T细胞数量的增加。
为了评价T细胞功能,我们在用LNP36免疫三次后进行了细胞内细胞因子染色。同时产生一种以上细胞因子的多功能性CD8 T细胞与对传染性疾病和肿瘤的更好控制相关,并且占E7特异性CD8 T细胞的约30%(图5c)。
实施例5-最佳mRNA LNP疫苗诱导肿瘤消退
在通过用HPV16 E6/E7抗原逆转录病毒转导产生的同基因小鼠肿瘤模型TC-1中评价治疗性抗肿瘤功效。当肿瘤达到平均直径为55mm3时,开始用由LNP36递送的5μg E7-TriMix处理。此外,用抗PD-1(或同种型对照抗体)处理小鼠。PD-1在激活的T细胞上表达,并且在与PD-L1相互作用时抑制T细胞功能并诱导耐受。PD-1检查点阻断维持T细胞反应性,并被批准用于转移性或不可切除的复发性HNSCC患者的一线治疗。LNP36疫苗接种导致TC-1肿瘤的明显消退(图5d)和显著延长的存活时间(图5e),然而肿瘤在停止治疗后复发。抗PD1单一疗法对具有TC-1的小鼠没有提供任何治疗益处。LNP36免疫联合抗PD-1确实改善了肿瘤生长控制。
最后,我们评估了疫苗引发的T细胞到达肿瘤床的能力。用相应的mRNA-LNP疫苗进行两次疫苗接种导致CD8+肿瘤浸润性T细胞强烈浸润到肿瘤中(图5f),其中超过70%对E7具有特异性(图5g)。在疫苗处理中加入抗PD-1没有显著改变进入肿瘤的E7特异性CD8 T细胞的百分比。
实施例6-最佳LNP增加脾中的摄取并激活免疫细胞
为了说明在器官和细胞类型水平上,在诱发的T细胞应答的强度和mRNA摄取和表达的生物分布之间是否存在相关性,我们将Cy5标记的萤火虫荧光素酶mRNA包封在先前筛选过免疫原性的DSG-PEG2000 LNP中。在LNP注射后四小时,在分离的肝、脾、肺、心脏和肾中测量荧光素酶活性。如所预期的,LNP组合物对mRNA表达的强度和器官特异性具有强烈的影响。肝是主要的靶器官,其次是脾,但是LNP之间的肝与脾的比例差别很大(图6a)。第三次免疫后E7特异性CD8 T细胞应答的强度与脾表达正相关(数据未显示)。
我们接着评估免疫原性是否与早期mRNA摄取和脾中特定免疫细胞类型的激活有关。LNP主要在巨噬细胞和单核细胞中积累(图6b)。在T细胞应答和脾巨噬细胞、单核细胞、浆细胞样DC(pDC)和B细胞的LNP摄取之间存在强的总体相关性(数据未显示)。
为了进一步验证mRNA摄取和表达在脾中的重要性,我们比较了最佳的、高免疫原性LNP(LNP36)和非最佳的、低免疫原性LNP(LNP37)的生物分布和细胞摄取图谱。相对于非最佳LNP,LNP36显著增加了脾中mRNA的表达(图6c)和脾单核细胞、巨噬细胞和DC的摄取(图6d)。
与用1.5%DSGPEG2000配制的LNP37相比,最佳mRNA LNP组合物LNP36触发血液中更高水平的炎性细胞因子,以及在脾DC亚群上升高的CD86表达(图6g),表明先天激活增加(图6f)。
最近,在非人灵长类(NHP)中进行了初步研究,以评价最佳LNP(LNP36)的翻译值。在NHP中,脾显示在每克组织中E7 mRNA的最高积累,随后是肝和骨髓。(图6e)。
结论
LNP组合物是在全身施用mRNA疫苗后引起的T细胞应答的关键决定因素。与含有DPG-PEG2000和DMG-PEG2000的LNP相比,具有DSG-PEG2000作为LNP稳定化PEG-脂质的LNP引发增加的T细胞应答。此外,将DSG-PEG2000的摩尔百分比降低至0.5-0.9%大大增加了T细胞应答。通过这种优化的LNP组合物递送的mRNA疫苗诱导高强度/高质量的T细胞应答,该应答可通过重复施用而加强,并在鼠同基因肿瘤模型中赋予抗肿瘤功效。在机制上,最佳LNP组合物的特征在于脾中mRNA表达增加,包括多种抗原呈递细胞类型的mRNA摄取增加。最佳的LNP制剂引发脾树突细胞的增加的激活,并导致IFN-α和IP-10在血液中的释放增加。
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1 5 10 15
Met Ser Ser Ile Val His Gln Gln Val Phe Pro Thr
20 25
Claims (15)
1.一种mRNA疫苗,所述mRNA疫苗包含一种或多种脂质纳米颗粒,所述脂质纳米颗粒包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;和
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
2.一种用于mRNA疫苗接种的脂质纳米颗粒(LNP),所述LNP包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;和
-一种或多种mRNA分子;
其特征在于,所述LNP包含小于约1摩尔%的所述PEG脂质;优选约0.5-0.9摩尔%和介于0.5-0.9摩尔%之间的所述PEG脂质。
3.一种脂质纳米颗粒(LNP),其包含:
-约45-65摩尔%的可电离的脂质;
-约4-15摩尔%的磷脂;
-甾醇;
-PEG脂质;和
-一种或多种核酸分子;
其特征在于,所述PEG脂质是二C18-PEG2000脂质;并且所述LNP含有少于约1摩尔%的所述PEG脂质,优选约0.5-09摩尔%和介于0.5-09摩尔%之间的所述PEG脂质。
4.如权利要求3所定义的脂质纳米颗粒;其中所述C18-PEG2000脂质选自:基于二硬脂酰基的PEG2000脂质,例如DSG-PEG2000脂质或DSPE-PEG2000脂质;或基于二油酰基的PEG2000脂质,例如DOG-PEG2000脂质或DOPE-PEG2000脂质。
6.如权利要求3至5中任一项所定义的脂质纳米颗粒;其中所述磷脂选自:DOPE、DOPC及其混合物。
7.如权利要求3至6中任一项所定义的脂质纳米颗粒;其中所述甾醇选自胆固醇、麦角固醇、菜油甾醇、氧甾醇、樟芝甾醇、链甾醇、尼卡甾醇、谷甾醇和豆甾醇;优选胆固醇。
8.一种脂质纳米颗粒,其包含:
-60摩尔%以上的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
9.一种脂质纳米颗粒,其包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5-0.9摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
10.一种脂质纳米颗粒,其包含:
-约64摩尔%的所述可电离的脂质;
-约8摩尔%的所述磷脂;
-约0.5摩尔%的所述PEG脂质;以及
余量为所述甾醇。
11.如权利要求3至10中任一项所定义的脂质纳米颗粒;其中所述一种或多种核酸分子选自mRNA和DNA,优选mRNA。
12.如权利要求3至11中任一项所定义的脂质纳米颗粒;其中所述一种或多种mRNA分子选自编码免疫调节多肽的mRNA和/或编码抗原的mRNA。
13.如权利要求12所述的脂质纳米颗粒;其中所述编码免疫调节的mRNA选自编码CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子。
14.一种药物组合物或疫苗,其包含一种或多种如权利要求3至13中任一项所定义的脂质纳米颗粒和可接受的药用载体。
15.如权利要求3至13中任一项所定义的脂质纳米颗粒或如权利要求14所定义的药物组合物或疫苗,其用于人类或兽医学;例如用于治疗癌症或传染性疾病。
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Cited By (3)
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