CN115025025B - 一种芍药花发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种芍药花发酵产物的制备方法，包括以下步骤：提供源自药用芍药且没食子酸含量≥9000ppm的芍药花，经烘干、粉碎后与水混合，调节pH为4.5‑5.0，灭菌后作为发酵培养基；提供酿酒酵母菌菌种CICC 1400进行活化和驯化培养；将发酵菌液接种至发酵培养基，于32℃发酵24h后降至25℃再发酵48‑60h，制得发酵液；离心，上清液依次经微滤和超滤处理，获得的滤液即芍药花发酵产物。本发明通过控制芍药花的来源及品质，同时采用酿酒酵母菌菌种CICC 1400制备发酵菌液，并严格限定发酵时间及温度，以保证发酵效果，从而制得具有多种功效、且质量稳定的芍药花发酵产物，实现药用芍药花的资源化利用。

Description

一种芍药花发酵产物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及日用化妆品技术领域，具体涉及一种芍药花发酵产物及其制备方法和应用。
背景技术
由于经济生活水平的提高和消费理念的改变，化妆品消费者和商家都越来越热衷健康、绿色、纯天然的原料成分。利用微生物发酵技术加工植物原料，不仅能通过发酵菌的生理活动促进释放和转化活性成分，减少毒性成分，极大增强功效，而且相比传统的提取技术，发酵技术还具有节能、环保、安全等优点。发酵技术已经应用到部分中药材上，例如CN114540426A公开了一种乳酸菌发酵牡丹的根的方法，又如CN112999127A提供了龙胆等中药的发酵产品。然而，由于生长环境不同，即使同一种中药材，不同产地或批次间往往在功效或活性物含量上存在较大差异，这种差异直接或间接地影响发酵产物的品质，而以上专利都没有对中药原料或者最终产品进行质量控制。
芍药的根，即赤芍和白芍，是传统中药，目前相关种植和加工产业颇具规模。然而药用芍药的地上部分一般直接丢弃，往往造成巨大的浪费。现代研究发现芍药的花含有没食子酸等多酚类活性物，具有抗炎、抗氧化等生理作用，有着广阔的应用前景。但由于对芍药的各种研究多聚焦于根，在芍药花的加工和发酵方面可供参考的资料少，比起一般中药材，其发酵流程设计和验证更加困难。目前尚没有对芍药花进行发酵的相关报道。
本发明旨在研究一种芍药花发酵产物的制备方法，以填补现有技术的空白，并实现药用芍药花的资源化利用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种芍药花发酵产物的制备方法，能够资源化利用芍药花，获得具有多种功效、且质量稳定的芍药花发酵产物。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
提供一种芍药花发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
S10、提供源自药用芍药且没食子酸含量≥9000ppm的芍药花，经烘干、粉碎后与水混合，调节pH为4.5-5.0，灭菌后制得发酵培养基；其中，采用乳酸调节芍药花粉末与纯水的混合物的pH值，pH值优选为5.0；灭菌是指在115℃高温灭菌15min；
S20、提供酿酒酵母菌菌种CICC 1400并进行活化和驯化培养，制得发酵菌液；
S30、将发酵菌液接种至发酵培养基，于32℃发酵24h后降至25℃再发酵48-60h，制得发酵液；
S40、发酵液离心后去除菌体和药粉，上清液依次经微滤和超滤处理，获得的滤液即芍药花发酵产物。
本发明通过控制芍药花的来源，即药用芍药，并限定作为原料的芍药花中的没食子酸含量≥9000ppm，同时采用酿酒酵母菌菌种CICC 1400制备发酵菌液，接种后严格限定发酵时间及温度，尤其是温度的控制，以保证最好的发酵效果，从而实现药用芍药花的资源化利用，制得具有多种功效、且质量稳定的芍药花发酵产物。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，步骤S10中，粉碎后的芍药花粉末与水按1:15的比例混合。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，步骤S20中，将酿酒酵母菌菌种CICC 1400接种到YPD培养基中，于32℃震荡培养36h进行活化；
其中，YPD培养基由1%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖组成。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，步骤S20中，将活化后的菌液接种到驯化培养基中，于32℃震荡培养36h，制得发酵菌液；
其中，驯化培养基由0.25%酵母膏、0.25%蛋白胨、0.5%葡萄糖以及5%芍药花粉末组成。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，步骤S30中，发酵菌液的接种量为8%。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，芍药花粉碎后的颗粒尺寸为100目以下。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，微滤采用的滤膜孔径为0.22μm。
作为芍药花发酵产物的制备方法的一种优选方案，超滤采用的滤膜为5000KD超滤膜。
本发明的目的之二在于提供一种芍药花发酵产物，采用所述的制备方法制得，所述芍药花发酵产物中的没食子酸含量为芍药花原料中没食子酸含量的1/16~1/20。
本发明的目的之三在于提供一种采用所述的制备方法制得的芍药花发酵产物在化妆品中的应用。所述化妆品例如面膜液、膏霜、精华液、化妆水等，将本发明所述的芍药花发酵产物加入化妆品中，可以使该化妆品具备良好的抗炎、抗氧化和修护等效果。
本发明的有益效果：
1、本发明从原料的来源、品质进行控制，并采用发酵工艺，严格限定发酵温度，从而能够制备出质量稳定、高活性的芍药花发酵产物，该芍药花发酵产物具有良好的抗炎、抗氧化和修护作用，整个制备过程简单可控、容易实现；
2、本发明有效利用了芍药产业中的废弃物芍药花，制备高附加值的产品，具有很大的社会经济效益。
附图说明
图1 是本发明实施例的体外DPPH自由基清除试验结果图。
图2 是本发明实施例的巨噬细胞细胞毒性试验结果图。
图3是本发明实施例的巨噬细胞舒缓试验结果图。
图4 角质细胞活性氧（ROS）试验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本技术领域的常规方法制备得到。
以下各实施例和对照例中，没食子酸检测采用高效液相色谱法（参考文献：吴忠旺,等. 不同干燥方法对白芍中6种化学成分的影响与评价[J]. 天然产物研究与开发,2016, 28(11):7.）。
发酵培养过程在有氧条件进行（150rpm）。
实施例1
原料：芍药花来自安徽亳州种植的药用芍药，没食子酸含量为13538ppm。
本实施例中的芍药花发酵产物的制备方法如下：
S10、芍药花清洗后55℃烘箱烘干，粉碎，过100目筛。
S20、称取30g粉末与450mL纯水混合，采用乳酸调整pH为5.0，115℃灭菌15min，做为发酵培养基备用。
S30、酿酒酵母菌菌种CICC 1400（购自广东省微生物菌种保藏中心）接种到100mlYPD培养基（1%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖）32℃震荡培养36h进行活化；取2mL活化的菌液接种到100mL驯化培养基中（0.25%酵母膏、0.25%蛋白胨、0.5%葡萄糖，5%芍药花粉末），32℃震荡培养36h，作为发酵菌液。
S40、接种36mL菌液至发酵培养基，32℃发酵24h后降至25℃再发酵48h。
S50、取发酵液5000g离心10min，上清液依次过0.22μm滤膜微滤，5000KD超滤膜超滤，滤液即为芍药花发酵产物。
芍药花发酵产物中检出没食子酸含量为721ppm。
实施例2
原料：芍药花来自浙江余姚种植的药用芍药，没食子酸含量为9840ppm。
本实施例中的芍药花发酵产物的制备方法与实施例1相同。
芍药花发酵产物检出没食子酸含量为583ppm。
实施例3
原料：芍药花来自湖南衡阳种植的药用芍药，没食子酸含量为9112ppm。
本实施例中的芍药花发酵产物的制备方法与实施例1相同。
芍药花发酵产物中检出没食子酸含量为559ppm。
对照例1
原料来源与实施例1相同。
本对照例中的芍药花水提取物的制备方法如下：
1）芍药花清洗后55℃烘箱烘干，粉碎，过100目筛。
2）称取30g粉末按1:15的比例，加入纯水作为提取剂
3）80℃加热1.5h；
4）提取液5000g离心10min，上清液过滤，
5）50℃减压浓缩至体积减少约1/2
6）浓缩液0.22μm微滤，得芍药花水提取物。
芍药花水提取物中的没食子酸含量为602ppm。
对照例2
原料：为观赏芍药的芍药花，购自广州岭南花卉市场，没食子酸含量为2085mg/kg。
本对照例中的芍药花发酵产物的制备方法与实施例1相同。
芍药花发酵产物中检测出没食子酸含量为112ppm。
对照例3
原料来源与实施例1相同。
本对照例中芍药花发酵产物的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S40进行恒温发酵，即32℃发酵72h。
芍药花发酵产物检测出没食子酸含量为427ppm。
对照例4
原料来源与实施例1相同。
本对照例中芍药花发酵产物的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S40进行恒温发酵，即25℃发酵72h。
芍药花发酵产物检测出没食子酸含量为381ppm。
对照例5
原料来源与实施例1相同。
本对照例中芍药花发酵产物的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S30中使用的菌株改为酿酒酵母ATCC 26603（购自广东省微生物菌种保藏中心）。
芍药花发酵产物检测出没食子酸含量为305ppm。
对照例6
原料来源与实施例1相同。
本对照例中芍药花发酵产物的制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤S30中使用的菌株为糖化酵母ACCC 20204（购自广东省微生物菌种保藏中心）。
芍药花发酵产物检测出没食子酸含量为189ppm。
应用例-面膜液
提供一种添加了芍药花发酵产物的化妆品（面膜液），表1为该面膜液的配方。
表1. 面膜液配方
Figure 472485DEST_PATH_IMAGE001
根据以上配方制备面膜液：
1、准确称取A相原料，搅拌分散均匀；
2、加入B相，搅拌均匀；
3、依次加入C相，边加热边搅拌均匀。
体外自由基清除试验
试验方法参照T/SHRH 006-2018，结果见图1。
如图1所示，实施例的10%稀释液的自由基清除率都在50%左右，明显高于各个对照例，表明芍药花发酵产物具有很强的抗氧化作用，且实施例间的差别小，产品质量稳定；对照例1的没食子酸含量高于实施例2和3，但抗氧化作用远不如实施例2和3，说明发酵过程产生或者保留了更多更丰富的抗氧化物质。
细胞毒性试验
试验方法简述：巨噬细胞Raw 264.7接种于96孔板，培养24h。吸弃各孔内培养液，加入不同浓度样品。暴露24h，用PBS清洗细胞，加入10%CCK-8孵育1h，检测OD450值。空白孔只含有培养基无细胞，对照组培养细胞但不添加任何样品，检测空白孔和对照组的OD450值。按照式（1）计算出相对细胞活性，结果见图2。
Figure 389625DEST_PATH_IMAGE002
（1）
如图2所示，3个实施例在1%和5%、10%浓度下，细胞活性都超过了90%，说明安全性较高。而用水提取制备的对照例1都在5%和10%的浓度下出现了明显的细胞毒性；此外，对照例4和6在10%浓度下也有一定细胞毒性，说明改变发酵条件和发酵菌种对发酵过程的代谢活动影响较大。
细胞舒缓试验
试验方法参照T/SHRH033-2020，结果见图3。
如图3所示，与阴性对照相比，5%的芍药花发酵产物极显著地降低了炎症因子TNF-α的分泌，效果优于对照例，说明芍药花发酵产物具有良好的舒缓效果。
细胞抗氧化试验
试验方法参照T/SHRH032-2020，结果见图4。
如图4，用紫外线处理角质细胞，引起细胞活性氧（ROS）增加（荧光强度越大代表ROS含量越高），实施例均显著降低了ROS含量，表明芍药花发酵产物能够减少因紫外线导致细胞产生的ROS，起到保护作用。
消费者使用测试
通过乳酸刺痛法筛选敏感肌人群，共招募到14名女性志愿者，年龄在25-43岁之间。把应用例制得的面膜液交给志愿者使用，要求每天使用一次，连续使用3周后进行回访，有13名志愿者表示皮肤状况明显改善，面部皮肤出现发红或刺痛的频率降低。
综上所述，本发明的提供的发酵方法，能够制备出质量稳定、高活性的芍药花发酵产物，具有良好的抗炎、抗氧化和修护作用，整个过程简单可控，容易实现；专利有效利用了芍药花产业中的废弃物，制备高附加值的产品，具有很大的社会经济效益。
以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、提供源自药用芍药且没食子酸含量≥9000ppm的芍药花，经烘干、粉碎后与水混合，调节pH为4.5-5.0，灭菌后制得发酵培养基；
S20、提供酿酒酵母菌菌种CICC 1400并进行活化和驯化培养，制得发酵菌液；
S30、将发酵菌液接种至发酵培养基，于32℃发酵24h后降至25℃再发酵48-60h，制得发酵液；
S40、发酵液离心后去除菌体和药粉，上清液依次经微滤和超滤处理，获得的滤液即芍药花发酵产物。
2.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤S10中，粉碎后的芍药花粉末与水按1:15的比例混合。
3.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤S20中，将酿酒酵母菌菌种CICC 1400接种到YPD培养基中，于32℃震荡培养36h进行活化。
4.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤S20中，将活化后的菌液接种到驯化培养基中，于32℃震荡培养36h，制得发酵菌液；
其中，驯化培养基含0.25%酵母膏、0.25%蛋白胨、0.5%葡萄糖以及5%芍药花粉末。
5.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤S30中，发酵菌液的接种量为8%。
6.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，芍药花粉碎后的颗粒尺寸为100目以下。
7.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，微滤采用的滤膜孔径为0.22μm。
8.根据权利要求1所述的芍药花发酵产物的制备方法，其特征在于，超滤采用的滤膜为5000KD超滤膜。
9.一种芍药花发酵产物，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的制备方法制得，所述芍药花发酵产物中的没食子酸含量为芍药花原料中没食子酸含量的1/16~1/20。
10.一种采用权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的芍药花发酵产物在化妆品中的应用。
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