CN115656392B - 尿液代谢物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尿液代谢物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用，属于生物技术领域。本发明采用超高通量液相色谱－质谱联用技术，收集子宫内膜癌保留生育功能治疗患者的尿液样本，进行代谢组学分析，发现孕激素耐药患者与孕激素敏感患者在代谢水平上的差异，通过分析差异代谢物及代谢通路筛选出尿代谢标志物藤黄酮B、吲哚、丝氨酸‑羟基脯氨酸、乙酰‑左旋肉碱或其组合，使用该代谢标志物能够准确的鉴别出孕激素耐药的子宫内膜癌患者，为保留生育功能治疗患者治疗方案的选择提供了新的指导依据，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及尿液代谢物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用，更具体的为尿液代谢物作为诊断标志物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗中孕激素耐药患者的产品中的应用。
背景技术
子宫内膜癌（Endometrial Cancer，EC）是女性常见的妇科恶性肿瘤之一，全球估计每年有大约382,069个新发病例。近年来，随着发病人群的增加及肥胖女性的增多，EC的发病呈年轻化的趋势，约有25%的患者诊断时尚未绝经，5%的患者诊断时年龄小于40岁，并且现代女性生育年龄逐渐推后，这其中70-88%患者尚未生育。年轻EC患者病变多处于早期，预后较好，雌孕激素受体阳性，对激素治疗敏感，对于这一部分患者采取保留生育功能的治疗国内外已有多项临床研究。目前最常用的保守治疗方案为口服高效孕激素治疗，取得了一定治疗效果。然而，在孕激素治疗的患者中，仍有20-40%的患者出现孕激素耐药的情况，导致治疗失败。因此，如果能及时筛选出孕激素耐药的患者，对此类患者采取非孕激素治疗方案，可以提高治疗效率，改善患者预后。但目前尚无孕激素耐药患者筛选的有效指标，区别困难。
代谢组学具有对机体生理病理变化反应灵敏，采样过程微创或无创，无需获得目标器官组织等优点，在临床应用方面有很大潜力。既往研究发现，代谢组学研究可以在EC的诊断及分型中发挥一定作用，不同期别或者不同病理类型的患者体内代谢物浓度有所不同，提示某些代谢物可以对疾病的严重程度进行区分。有深肌层浸润患者体内某些代谢物如肌苷、黄嘌呤和次黄嘌呤浓度显著升高，而羟鞘磷脂、磷脂酰胆碱和内源性***等代谢物与肌层浸润深度有关，可以作为EC的分期工具。与淋巴脉管间隙浸润相关的代谢物生物标记物包括十六己二烯肉碱、二酰基残基和C38:1的磷脂酰胆碱、二酰基残基和C34:4的磷脂酰胆碱和酰基烷基残基和C38:3，此外血液中3-羟基丁酸盐也显示了与分期的相关性。但目前对于EC保留生育功能治疗的患者，尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供尿液代谢物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用，本发明解决了孕激素耐药患者鉴别困难，目前尚无有效标志物的问题，可以提高子宫内膜癌患者治疗效率，改善患者预后。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供尿液代谢物作为诊断标志物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用。
本发明还提供检测尿液代谢物含量水平的试剂在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药的患者的产品中的应用。
优选的是，采用超高通量液相色谱－质谱联用鉴定法检测尿液代谢物含量水平。
优选的是，所述尿代谢产物包括如下任一项：
（1）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰-左旋肉碱中的任一种；
（2）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰-左旋肉碱的组合。
优选的是，所述产品包括试剂盒和芯片。
本发明还提供一种鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品，所述产品包括检测尿液代谢物含量水平的试剂，所述尿液代谢物包括藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰-左旋肉碱。
优选的是，所述产品包括试剂盒和芯片。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过采用超高通量液相色谱－质谱联用技术，收集子宫内膜癌保留生育功能治疗患者的尿液样本，进行代谢组学分析，筛选出组合代谢标志物：藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰-左旋肉碱，可以将孕激素敏感与孕激素耐药子宫内膜癌患者进行区分，其AUC值可达0.986，有较好的敏感度和特异度，能够及时筛选出孕激素耐药的患者，对此类患者采取非孕激素治疗方案，可以提高治疗效率，改善患者预后。可见，本发明为保留生育功能治疗子宫内膜癌患者治疗方案的选择提供了新的突破口，具有较好的临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为孕激素敏感与孕激素耐药子宫内膜癌的尿液代谢谱分类图；A：PCA分类图，B：OPLS-DA分类图；
图2为本发明四种尿液代谢物联合鉴别孕激素耐药子宫内膜癌的ROC曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、样品收集
1）选取20例孕激素耐药的子宫内膜癌患者的尿液和22例年龄、性别匹配的孕激素敏感子宫内膜癌患者的尿液，来自北京协和医院。
2）尿液收集：收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。
2、尿液样品代谢物提取
取200μL尿液上清，加200μL乙腈，涡旋，4℃静置30min, 14000g离心10min，取上清，离心浓缩，用200μL 2%乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10μL进样。
3、液相分析
使用 Waters ACQUITY H-Class 型号超高效液相色谱***进行液相分析，条件如下：
色谱柱：Waters HSS T3 C18（3.0mm×100mm，1.8μm）；柱温为40℃；流动相A为0.2‰甲酸水，流动相B为0.2‰甲酸乙腈溶液，洗脱模式为梯度洗脱，洗脱时间为15分钟，流速为0.5 mL/min，具体进样体积为10μL。具体信息如下表1所示。
表1洗脱条件
4、质谱鉴定
使用Triple TOF 5600质谱仪（Thermofisher Scientific公司）对洗脱的尿液代谢物进行分析，数据模式为DDA模式。参数如下：
一级全扫描范围为50-1200m/z，累积时间为0.25s，二级累积时间为0.1s，GS1为55，GS2为55，Curtain Gas为35，温度设定为550，Ionspray Voltage Floating为4500。
采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI （Version 2.0，NonlinearDynamics，UK）对UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据进行处理。该软件可自动完成峰对齐、峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-Psoftware 14.0（Umetrics AB，Umea, Sweden）进行PCA及OPLS-DA分析，可视化组间变化趋势。选取非参检验
p值小于0.05，fold-change大于1.5，VIP＞1的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为孕激素耐药子宫内膜癌的潜在标志物。对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD（High collision dissociation）碎裂方式，根据具体代谢物选择204060eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB（HUMAN METABOLOME DATABASE）数据库，确定差异代谢物结构。
5、筛选结果
非监督PCA图显示两组之间呈现出一定的区分度（如图1中A所示）；进一步采用监督OPLS-DA构建模型，两组区分度更加明显（如图1中B所示）。筛选出尿液差异代谢物28个。
将尿液代谢物中筛选得到的差异代谢物进行靶向二极分析，根据
p值小于0.05，fold-change大于1.5，VIP＞1，确定出4个AUC值最高的代谢物结构，即藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸、乙酰-左旋肉碱。并且采用逻辑回归算方法分析得到，结果如表2和表3所示，将藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸、乙酰-左旋肉碱联合用于区分孕激素耐药的子宫内膜癌，可达到较好的预测效果，ROC曲线的AUC值为0.986（如图2所示），10倍交叉验证AUC为0.929，灵敏度及特异性见表2。
表2 四种代谢物组合鉴别孕激素耐药子宫内膜癌的灵敏度和特异性
表3 四种代谢物单独鉴别孕激素耐药子宫内膜癌的结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.尿液代谢物作为诊断标志物在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用，其特征在于，所述尿液代谢产物包括如下任一项：
（1）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰左旋肉碱中的任一种；
（2）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰左旋肉碱的组合。
2.检测尿液代谢物含量水平的试剂在制备鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品中的应用，其特征在于，所述尿液代谢产物包括如下任一项：
（1）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰左旋肉碱中的任一种；
（2）藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰左旋肉碱的组合。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用超高通量液相色谱－质谱联用鉴定法检测尿液代谢物含量水平。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒和芯片。
5.一种鉴别子宫内膜癌保留生育功能治疗孕激素耐药患者的产品，其特征在于，所述产品包括检测尿液代谢物含量水平的试剂，所述尿液代谢物包括藤黄酮B、吲哚、丝氨酸-羟基脯氨酸和乙酰左旋肉碱。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒和芯片。
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