CN110632231B - 尿液中胶质母细胞瘤的代谢标志物及其在早期诊断中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及尿液中胶质母细胞瘤的代谢标志物及其在早期诊断中的用途。具体地，本发明涉及测定受试者尿液中的代谢物水平的试剂在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂盒或芯片中的用途，其中所述的尿液中的代谢物选自以下一种或多种：脱氧胆酸甘氨酸偶联物、酪胺‑氧‑硫酸盐、葡糖苷酸睾酮、鹅去氧胆酸硫酸盐、2‑羟基‑皮脂酸乙酯和甘氨鹅脱氧胆‑3‑葡糖苷酸。

Description

尿液中胶质母细胞瘤的代谢标志物及其在早期诊断中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及尿液中胶质母细胞瘤的代谢标志物及其在早期诊断中的用途。

背景技术

***2013年最新年鉴表明，我国每年有超过30万患者死于脑部肿瘤。胶质母细胞瘤作为脑部最常见的原发性恶性肿瘤，占所有原发性脑恶性肿瘤的47.6％(2018年美国脑肿瘤登记中心报告，CBTRUS)参见，Q.T.Ostrom,H.Gittleman,G.Truitt,A.Boscia,C.Kruchko,J.S.Barnholtz-Sloan,CBTRUS Statistical Report:Primary Brain andOther Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2011-2015.Neuro Oncol 20(2018)iv1-iv86，恶性程度最高(WHO分级为恶性程度最高的IV级)，治疗效果差。经过标准的手术、放疗及化疗之后，病人中位生存期仅为14.6个月，参见R.Stupp,W.P.Mason,M.J.van den Bent,M.Weller,B.Fisher,M.J.Taphoorn,K.Belanger,A.A.Brandes,C.Marosi,U.Bogdahn,J.Curschmann,R.C.Janzer,S.K.Ludwin,T.Gorlia,A.Allgeier,D.Lacombe,J.G.Cairncross,E.Eisenhauer,R.O.Mirimanoff,Radiotherapyplus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.N Engl J Med 352(2005)987-996。这不仅给患者身体造成巨大痛苦，而且给患者及其家属带来心理上的沉重负担。此外，胶质母细胞瘤本身对脑功能造成的损害以及手术治疗所导致的致残率也很高。因此该疾病给国家医疗资源以及社会保障体系带来很大的负担。

早期发现并及时手术治疗能延长恶性胶质瘤病人生存预后，甚至能治愈部分病人，故胶质瘤早期诊断具有至关重要的作用。然而，胶质瘤起病隐匿，缺乏特异性早期症状，这导致发现时往往已是肿瘤病程后期，此时肿瘤较大，侵袭性强，手术治疗效果往往不佳。利用各种组学方法在体液中筛选并鉴定胶质瘤早期诊断标志物是目前胶质瘤早诊研究常规策略，参见M.Touat,A.Duran-Pena,A.Alentorn,L.Lacroix,C.Massard,A.Idbaih,Emerging circulating biomarkers in glioblastoma:promises andchallenges.Expert Rev Mol Diagn 15(2015)1311-1323。

代谢组学方法是通过核磁共振波谱法和质谱法在一个生物样品内发现全套小分子代谢物的研究方法。本项目基于质谱技术的代谢组学方法在尿液中筛选出一组能较好区分正常人和胶质瘤病人的代谢标志物。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，提供了测定受试者尿液中的代谢物水平的试剂在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂盒或芯片中的用途，其中所述的尿液中的代谢物选自以下一种或多种：

脱氧胆酸甘氨酸偶联物，

酪胺-氧-硫酸盐，

葡糖苷酸睾酮，

鹅去氧胆酸硫酸盐，

2-羟基-皮脂酸乙酯，和

甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸。

在具体的实施方案中，所述诊断是胶质母细胞瘤的早期诊断；所述受试者是人。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者尿液中具有以下一种或多种代谢物变化，指示所述受试者患有胶质母细胞瘤：酪胺-氧-硫酸盐水平升高、鹅去氧胆酸硫酸盐水平升高、甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸水平升高、脱氧胆酸甘氨酸偶联物水平降低、葡糖苷酸睾酮水平降低、和2-羟基-皮脂酸乙酯水平降低。健康对照是指未患有胶质母细胞瘤及其他疾病的健康个体。

在具体的实施方案中，所述试剂盒用于质谱鉴定的方法中。所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式联合靶向分析下使用的。质谱全扫描模式是同时采集质量范围100m/z到1000m/z内的所有小分子一级信息，通过多元统计分析筛选差异代谢物，进一步对差异代谢物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图，最终确定差异分子。

在具体的实施方案中，所述代谢物水平是指代谢物相对于健康对照的相对含量。

在具体的实施方案中，代谢物水平是在受试者的尿液样本中测定的。

在具体的实施方案中，所述受试者是人。

本发明在另一方面提供了一种用于早期诊断胶质母细胞瘤的试剂盒或芯片，其包含以下代谢物的检测试剂：

脱氧胆酸甘氨酸偶联物，

酪胺-氧-硫酸盐，

葡糖苷酸睾酮，

鹅去氧胆酸硫酸盐，

2-羟基-皮脂酸乙酯，和

甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸。

在进一步的实施方案中，所述试剂盒或芯片进一步包含从健康对照尿液样品中确立的基准曲线。在具体的实施方案中，所述试剂盒或芯片用于质谱鉴定的方法中。

在具体的实施方案中，所述诊断选自：胶质母细胞瘤的早期诊断。在具体的实施方案中，所述质谱鉴定是在全扫描模式联合靶向鉴定模式下使用的。

本发明在另一方面提供了一种用于诊断受试者中胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括步骤：

1)获得受试者的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中提取代谢物，

3)确定受试者尿液样本中一种或多种选自以下的代谢物水平：

脱氧胆酸甘氨酸偶联物，

酪胺-氧-硫酸盐，

葡糖苷酸睾酮，

鹅去氧胆酸硫酸盐，

2-羟基-皮脂酸乙酯，和

甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸。

优选地，所述方法进一步包括将步骤3)中获得的代谢物水平与从健康对照尿液样品中确立的基准值进行比较的步骤。

在具体的实施方案中，使用质谱方法确定代谢物水平。

当采用质谱方法确定代谢物水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括代谢物提取，蛋白去除。在具体的实施方案中，用2倍体积乙腈提取尿液样本中的代谢物，同时去除蛋白。

在具体的实施方案中，所述质谱方法是一级全扫描模式联合靶向二级分析。具体地，首先通过一级全扫描检测尿液代谢组，多元统计分析筛选出潜在标志物，对潜在标志物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图确定潜在标志物。采用标志物一级谱峰面积进行定量。

具体地，检测：

脱氧胆酸甘氨酸偶联物，

酪胺-氧-硫酸盐，

葡糖苷酸睾酮，

鹅去氧胆酸硫酸盐，

2-羟基-皮脂酸乙酯，

甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸及其组合。

基于尿液上述六种代谢物的定量检测方法，可以结合标准品用其进行人群中这六种代谢物基线的建立，可以基于正常对照的含量范围，对胶质母细胞瘤患者进行早期诊断。

附图说明

图1：胶质母细胞瘤和健康对照组尿液代谢谱PCA分类图；

图2：胶质母细胞瘤和健康对照组尿液代谢谱OPLS-DA分类图；

图3：六种代谢物组合预测实验组样本的ROC曲线；

图4:六种代谢物联合区分验证组胶质母细胞瘤样本的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。然而，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测尿液中代谢物，通过多元统计分析筛选与胶质母细胞瘤相关的代谢物。标志物的鉴定是采用二级靶向分析方法，通过对二级碎片的匹配或者解析进行。

材料与试剂

1)仪器：Waters H-class液相色谱仪(waters公司)LTQ-Orbitrapvelos pro质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。

2)主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；C18反相色谱柱(3.0mm×100mm,C18,1.7μm,Waters公司)。

3)样本：25例胶质母细胞瘤患者的尿液和65例年龄、性别匹配的正常对照组的尿液，来自北京天坛医院。

1.1人尿液样品的收集

收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。

1.2代谢物提取

取200ul尿液上清，加200ul乙腈，涡旋，4度静置30min,14000g离心10min，取上清,离心浓缩，用200ul 2％乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10ul进样。

1.3液相分析

Waters H-class

色谱柱：waters BEH C18(3.0X100mm,1.7um),柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相为乙腈；分析梯度为：0-1min，2％B；1-8min,2％B-98％B；8-8.1min,98％B-100％B；8.1-12min,100％B；12-12.1min,100％-2％B；12.1-17min，2％B；流速为0.5ml/min；进样体积为10ul.

1.4质谱分析

UPLC质谱串联LTQ-Orbitrapvelos(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA,USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45 arbitraryunits and 10 arbitrary units；质谱扫描范围为100–1000m/z；spray voltages设为4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000；二级分辨率为15000.

1.5质谱数据分析

由UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0,Nonlinear Dynamics,UK)进行处理。该软件可自动完成峰对齐，峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 14.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为胶质母细胞瘤早期潜在标志物。对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD(High collision dissociation)碎裂方式，根据具体代谢物选择20,40,60eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB(HUMANMETABOLOME DATABASE)数据库，确定差异代谢物结构。

1.6尿液代谢组区分胶质母细胞瘤和健康对照组

非监督PCA得分图显示(图1)胶质母细胞瘤组和对照组呈现出一定的区分度。进一步采用监督OPLS-DA构建模型,两组区分度更加明显(图2)。筛选出差异代谢物39个。研究显示，多个代谢物联合应用可以更好的预测疾病的发生，在此，我们采用逻辑回归算方法优化模型，最后得出6个代谢物，脱氧胆酸甘氨酸偶联物，酪胺-氧-硫酸盐，葡糖苷酸睾酮，鹅去氧胆酸硫酸盐，2-羟基-皮脂酸乙酯，甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸联合应用可以达到较好的预测效果，对以上样本组预测的AUC值为0.931，十倍交叉验证的AUC值为0.870(图3)，灵敏度及特异性见表1。

表1 六种代谢物组合预测胶质母细胞瘤灵敏度和特异性

	AUC	灵敏度	特异性
				训练/发现	0.931(0.911-0.951)	0.935(0.915-0.955)	0.787(0.733-0.840)
10-倍交叉验证	0.870(0.776-0.963)	0.892(0.892-0.968)	0.800(0.643-0.957)

表2 六种代谢物单独进行胶质母细胞瘤早期诊断

注：变化倍数中负号表示在胶母组下调，正值代表上调。

我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测另外13例胶质母细胞瘤和34例正常人尿液中代谢物，提取表2中六种代谢物，采用ROC曲线评估六种代谢物对胶质母细胞瘤的预测效果。结果显示联合预测的AUC值为0.998(图4)，预测效果良好。

Claims (6)

1.测定受试者尿液中的代谢物水平的试剂在制备用于诊断胶质母细胞瘤的试剂盒或芯片中的用途，其中所述的尿液中的代谢物选自以下一种或多种：

脱氧胆酸甘氨酸偶联物，

酪胺-氧-硫酸盐，

葡糖苷酸睾酮，

鹅去氧胆酸硫酸盐，

2-羟基-皮脂酸乙酯，和

甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述诊断是胶质母细胞瘤的早期诊断。

3.根据权利要求1或2任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中相较于健康对照，受试者尿液中具有以下一种或多种代谢物变化，指示所述受试者患有胶质母细胞瘤：酪胺-氧-硫酸盐水平升高、鹅去氧胆酸硫酸盐水平升高、甘氨鹅脱氧胆-3-葡糖苷酸水平升高、脱氧胆酸甘氨酸偶联物水平降低、葡糖苷酸睾酮水平降低、和2-羟基-皮脂酸乙酯水平降低，健康对照是指未患有胶质母细胞瘤及其他疾病的健康个体。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂盒或芯片用于质谱鉴定的方法中。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述代谢物水平是指代谢物相对于健康对照的相对含量。

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