CN1156488C - 小诺霉素新衍生物、制备方法和医药用途 - Google Patents

小诺霉素新衍生物、制备方法和医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一系列新的氨基糖苷类抗生素衍生物，更具体地涉及小诺霉素C1-N-取代的新衍生物，该系列衍生物的制备方法，包含有该衍生物作有效成份的药物。本发明通过对小诺霉素的C1-NH2分别进行烷基化和酰化修饰，通过化学反应得到一系列的衍生物。所有衍生物的结构经元素分析、IR、MS和1H-NMR所确证。体外活性的测试结果显示，新衍生物的抗菌活性超过母体化合物小诺霉素。

Description

小诺霉素新衍生物、制备方法和医药用途
技术领域；
本发明涉及一种新的氨基糖苷类抗生素衍生物，更具体地涉及小诺霉素C1-N-取代的新衍生物、该系列衍生物的制备方法、包含有该衍生物作有效成份的药物。
背景技术：
自1944年发现链霉素(streptomycin)、1949年发现新霉素(neomycin)以来半个多世纪的时间，已得到了一系列在临床上有用的氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类抗生素的研究始于四十年代，历时半个多世纪，它的发展大致经历了以下阶段：链霉素-新霉素时期；卡那霉素时期；庆大霉素(妥布霉素、西索米星、小诺霉素)时期；半合成的氨基糖苷类抗生素衍生物时期(其中主要以卡那霉素和庆大霉素为母核的结构改造的衍生物)。这些衍生物的出现，克服和部分克服了临床上出现的细菌耐药性和耳、肾毒副作用。这时期，高效、低毒、对耐药菌有效的新的衍生物的出现，在临床上发挥了重要作用，同时，也为氨基糖苷类抗生素的发展开辟了一条有效的途径。
随着氨基糖苷类抗生素的广泛使用，诱导出现了一些耐药菌株，造成了它在临床上减效或无效。早在六七十年代，人们在使用庆大霉素时，就从研究其生化基础知识方面找出耐药性产生的原因是由某些钝化酶引起的，它们将三磷酸腺苷(ATP)或乙酰辅酶A中的磷酸基团、腺苷酸基团或乙酰基团转移到氨基糖苷类抗生素中某些特定位置的羟基和氨基上。进行O-磷酸化、O-腺苷化或N-乙酰化，从而使抗生素失去抗菌作用。
由于掌握了有关耐药性与钝化酶的知识，因而化学家们可以对易受攻击位置的取代基采用化学手段除去或修饰的方法，使该化合物不成为钝化酶的受体而又保持抗菌活性。
细菌耐药性的出现，不但影响了抗生素的疗效，而且也妨碍和限制了它在临床上的应用。细菌的耐药性有三种机理：(1)改变核蛋白体与药物的结合部位；(2)降低细胞膜的通透性，使药物不易进入细胞内；(3)氨基糖苷类抗生素受钝化酶的攻击而失活。其中第三种机理在临床上最为常见。根据分子遗传学对第三种机理的研究表明，细菌的耐药性是被一种称为耐药因子(简称R因子)的遗传要素所携带的，R因子具有两个特性，首先，R因子能通过细菌之间的相互接触而接合转移，并由耐药性菌株转移到敏感菌株，从而使后者获得耐药性。其次，R因子与细菌染色体基团之间没有连锁关系，而具有自主的复制功能，在细胞***时，R因子也同时进行复制使子细胞也带有R因子，由于R因子的存在，使一些细胞获得了多价的耐药性。至于氨基糖苷类抗生素的耐药生化机制，认为是带有R因子的耐药菌以存在于质体或染色体中的耐药性基团(R因子)为模板形成mRNA，再以mRNA为模板，在核糖核蛋白体上形成三种类型的钝化酶，它们分别从三磷酸腺苷(ATP)或乙酰辅酶A中将磷酸基团、腺苷酸基团或乙酰基团转移到氨基糖苷类抗生素分子中的一些重要的羟基和氨基上，引起氨基糖苷类抗生素分子的结构发生变化，阻碍了氨基糖苷类抗生素分子同细菌核糖核蛋白体之间的相互作用，从而使氨基糖苷类抗生素失去活性。
发明内容：
氨基糖苷类抗生素疗效确切，价格低廉。现在以至将来该类药物仍需在我国广泛应用，但该类药物使用后极易产生耐药菌，同时，它本身又具有耳、肾毒副作用，给临床用药带来极大的不便，为了解决这一问题，药物研究人员对此进行了许多有益的探索，寻找高效低毒、抗耐药菌的氨基糖苷类抗生素新的衍生物。
目前，氨基糖苷类抗生素的研究开发主要有以下几个方面：
1、根据耐药机制继续开展耳、肾毒性低、活性高的氨基糖苷类抗生素衍生物的研究。
2、由于细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机理主要是细菌所产生的钝化酶使氨基糖苷类抗生素的活性部位钝化而失活，据此作为新的衍生物设计的理论依据，在广泛研究细菌耐药性与氨基糖苷类抗生素的化学结构之间的关系后，理性地进行结构改造，以获得有价值的氨基糖苷类抗生素新的衍生物。
3、基于对钝化酶的结构和分子机理知识的深入研究，理性地设计低毒或无毒的氨基糖苷类抗生素钝化酶抑制剂，以克服和减少长期使用后出现的细菌耐药性问题。
采用me-too的新药研制方法，我们选取小诺霉素进行结构改造。小诺霉素(Sagamicin)的C-3′、C-4′没有羟基，可不受磷酸性转移酶(APH)和核苷转移酶(AAD)的攻击。C6′-NHCH3因甲基的存在，也可免受乙酰转移酶的作用，增加了对AAC(6′)钝化酶的绿脓杆菌的活性，C3-NH2也会由于C1-NH2化学结构修饰后的空间位阻作用而免受钝化酶的攻击，可使其对钝化酶稳定，C1-NH2的结构修饰还可改变其对细菌的活性和降低毒性。同时，C-3′位和C-4′位上由于没有羟基，耳、肾毒性也有所降低。对含有2-脱氧链霉胺的氨基糖苷类抗生素，除了在2-脱氧霉胺的C1-NH2外，其余的氨基如被酰化或烷基化，形成的衍生物将失去或降低其抗菌活性。因此对该类抗生素的化学结构修饰只在它的C1-NH2。为此，我们对小诺霉素的C1-NH2分别进行了烷基化和酰化修饰，设计了二类衍生物：C1-NH2的烷基化衍生物；C1-NH2的广义氨基酸酰化衍生物共八个目标化合物，并进行了半合成和体外活性测试及急性毒性研究，旨在发现活性好、对钝化酶稳定、耳、肾毒副作用低的新的衍生物。
本发明的目的是通过如下方法实现的：
(1)小诺霉素C1-NH2的烷基化衍生物的制备(A法)
在小诺霉素的结构中有三个伯胺基和两个仲胺基，在烷基化的过程中，胺基均可能烷基化。因此必须选择性保护不希望发生烷基化的胺基，留下C1-NH2进行烷基化。选择醋酸铜在合适的溶剂中与小诺霉素分子中的C1-NH2、C2″-OH、C3″-NHCH3和C4″-OH形成可逆络合物，再用醋酐对C3-NH2、C2′-NH2及C6′-NHCH3选择性酰化后，经732-NH4 +树脂脱去Cu2+，游离出C1-NH2，再在酸性、低温条件下与醛经DCC缩合反应生成亚胺，经NaBH3CN或NaBH4还原、碱水解，即可得到烷基化衍生物。
反应方程式如下：
R2＝CH3-(SCO-1)；CH3CH2-(SCO-2)；
小诺霉素C1-NH2烷基化衍生物制备方法如下：
(I)三乙酰小诺霉素的合成：
1L的三颈瓶中依次加入11.6g小诺霉素和125ml水，搅拌，全溶后加入17.5g醋酸铜，搅拌10分钟，再加入400ml DMF，反应维持在30℃左右，加毕DMF后，室温搅拌2小时，维持室温滴加(AcO)2O/DMF(7.65g/100ml)液于上述反应液中，加完后，室温搅拌2小时。
(II)脱Cu2+：
将上述反应液通入预处理好的树脂(732-NH4 +)，以4ml/min的流速吸附，吸附完毕后，用去离子水洗至中性，再用1N的氨水洗脱，收集洗脱液并浓缩至干，得固体14.10g。
(III)C1-NH2-烷基化小诺霉素上柱液的制备及其分离纯化：
亚胺化反应：
14.1g三乙酰小诺霉素用200ml水在搅拌条件下全部溶解后，用2N的盐酸调pH值为2.5～2.7之间，再用冰盐水冷却至-5℃～0℃，一次性加入5.6g DCC和醛的四氢呋喃溶液(制备及标定附后)，温度维持在-5℃～0℃之间，继续搅拌5分钟，过滤，得滤液。
烷基化-还原反应：
向上述滤液中迅速滴加(2.6g/20ml)NaBH3CN/H2O液，滴加过程中，用2N盐酸调pH值约为2.7，NaBH3CN/H2O滴加完毕后，反应液于-5℃～0℃之间继续反应一小时，再自然回升至室温，继续反应20小时，整个反应过程中均要用2N盐酸调pH值约为2.7。反应过程中可见有气泡产生。反应完毕后，用7N氨水调pH值到8.0左右，浓缩至干，得固体17.0g。
碱水解：
17.0g固体用400ml 1M的氢氧化钠溶解后，加入少许沸石。用硅油加热至回流时并开始计时，反应40小时，冷却，转入1000ml烧杯中，用浓盐酸缓慢中和至pH值约为9。再用2N盐酸调pH值约为7。加入2.5g活性炭，加热脱色1小时，自然冷却，过滤，水洗炭层，合并滤液。
分离纯化：
将上述滤液通入预处理好的树脂(CG～50#)以4ml/min的流速吸附，吸附完毕后，用去离子水洗涤。用0.35N氨水解吸，经TLC检测收集Rf相同的产物组分，浓缩至干。
(IV)甲醛/四氢呋喃(HCHO/THF)液的制备及标定：
a制备：
采用普通蒸馏装置，从甲醛的水溶液中蒸出甲醛(水浴温度不超过25℃)，用四氢呋喃吸收，冷却水及四氢呋喃吸收液均用冰盐水冷却，收集馏分。按四氢呋喃的增重计甲醛的量。密闭后放置冰箱备用。
b标定：
原理：
Figure C0113370100121
取50ml准确配制的1M亚硫酸钠溶液，以0.1％的百里香酚酞为指示剂，用1.1N H2SO4中和至无色(空白)，再吸取3ml HCHO/THF液加入上述液中，再用1.1N H2SO4中和至无色，连续测定三次，取其平均值。
V1＝15.5ml V2＝15.5ml V3＝15.48ml
据公式：
NHCHO/THF＝NH2SO4 VH2SO4/VHCHO/THF
NHCHO/THF＝5.68
乙醛/四氢呋喃，异丁醛/四氢呋喃，苯甲醛/四氢呋喃液的制备及标定方法同甲醛/四氢呋喃。
通过上述方法，制备了小诺霉素C1-NH2的甲基化衍生物(C1-N-甲基-小诺霉素，SCO-1)、乙基化衍生物(C1-N-乙基-小诺霉素，SCO-2)、异丁基化衍生物(C1-N-异丁基-小诺霉素，SCO-3)、苄基化衍生物(C1-N-苄基-小诺霉素，SCO-4)四种衍生物。
(2)小诺霉素C1-NH2酰化衍生物的制备(B法)
三甲基硅基具有较强的供电子性，同时它占据的空间较大，能产生一定的空间位阻。硅烷化后五个胺基酰化活性的变化，可能是由于三甲基硅基产生的空间位阻所致。小诺霉素分子中C3″-NHCH3中的甲基和邻位的两个羟基，C6′-NHCH3中的甲基的存在以及它们和C2′-NH2一样还会受到环的屏蔽效应，硅烷化后三者都受到较大的空间位阻，从下面小诺霉素的结构式可以看出，C3-NH2所受的空间位阻大于C1-NH2。
Figure C0113370100131
酰化反应按SN2机理进行，反应速度受空间位阻影响极大，所以小诺霉素硅烷化后五个胺基的活性顺序为C1-NH2＞C3-NH2＞C2″-NH2＞C6′-NHCH3＞C3′-NHCH3。同时，硅烷化小诺霉素用少量的水部份去硅烷化后，C1-NH2酰化反应活性最高。因此，小诺霉素经硅烷化保护后，在低温条件下与保护后的广义氨基酸经DCC缩合反应后，在酸性条件下去保护，肼解即得酰化衍生物。
反应方程式如下：
小诺霉素C1-NH2酰化衍生物制备方法如下：
(I)小诺霉素的硅烷化：
11.6g小诺霉素悬浮在62.5ml乙腈中，油浴加热至80℃～90℃(外温)，在搅拌下加入41.5ml六甲基二硅氮烷(HMDS)和0.25ml三甲基氯硅烷(TCMS)，回流半小时后，通N2赶除NH3，反应液变清为反应终点，反应完毕后，降温至10℃，令其静置分层，下层的硅烷物的稠浆液用于下步反应。
(II)酰化反应：
(1)将上述硅烷物加入预先冷冻至温度为5℃以下的125ml丙酮中，溶解半小时。
(2)保护后的广义氨基酸用25倍(v/w)的丙酮使之全部溶解。
(3)5.6g DCC用5倍(v/m)的丙酮溶解后，加入到(2)中，搅拌升温至40℃，恒温1小时后，冷却至10℃以下，迅速加入到冷却的硅烷物的丙酮溶液中，低温搅拌0.5小时(＜10℃)，过滤，收集滤液，经减压蒸馏蒸去部分丙酮后，加入少许水，再用6N的盐酸调pH值为2.0～2.5，室温搅拌0.5小时，静置分层，收集下层黄色的酰化物水溶液，经减压蒸馏除去少量硅醚后，再用7N氨水调pH值为7.0。
(III)去保护：
向上述酸解中和液中加入8.8ml水合肼，室温搅拌12小时，经减压蒸馏除去多余水合肼，再浓缩为原体积的1/2，再稀释至原体积，用2N盐酸调pH值为5.1左右，析出白色沉淀，室温过滤，滤液用7N氨水调pH为7.0值左右，加水稀释。
(IV)分离纯化：
将上述稀释液通入预处理好的树脂(CG-50#)，以4ml/min的流速吸附。吸附完毕后，用去离子水洗涤。用0.55N氨水解吸，经TLC检测收集Rf相同的产物组分，浓缩至干。
邻苯二甲酰胺基-α-羟基-丁酸的合成(PHBA)
将11.9g AHBA及14.8g PHA加入到45ml水中，搅匀成悬浮状，再加入1.5ml三乙胺，边搅拌边升温边减压，油浴温度达80℃。待水份基本蒸出后，继续升温至110℃，减压条件下反应2小时，停止加热。趁热加入2N的盐酸70ml，搅拌，使溶液全清，搅拌下自然降温至45℃，恒温一小时后，趁热过滤出PHBA结晶。水洗，烘干，得固体20g，收率75％(mp＝150～152℃)。
通过上述方法，制备了小诺霉素C1-NH2的(S)-γ-氨基-α-羟基丁酰基衍生物(C1-N-(S)-γ-氨基-α-羟基丁酰基小诺霉素，SCO-5)；α-氨基乙酰基衍生物(C1-N-α-氨基乙酰基小诺霉素，SCO-6)；α-氨基-β-甲基丁酰基衍生物(C1-N-α-氨基-β-甲基丁酰基小诺霉素，SCO-7)；α-氨基-β-羧基丙酰基衍生物(C1-N-α-氨基-β-羧基丙酰基小诺霉素，SCO-8)。
具体实施方式：
实施例1：SCO-1(C1-N-甲基-小诺霉素)的制备
投料：甲醛/四氢呋喃4.5ml
按上述通用操作方法A法，由14.1g三乙酰小诺霉素得到SCO-1 2.9g。[α]D t 124.2°；元素分析：C：52.83 H：9.01 N：14.67(理论值：C：52.72 H：9.20N：14.60)。IR(cm-1)3361，2936，1452，1337 MS(m/e)477 364 360 314 160143 43 28 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.25(H-1′1H d) 5.05(H-1″1H d)4.45(H-2′1H d J1″-2″＝3.5HZ J2″-3″＝11.0HZ) 3.92(H-3″1H s)2.50(3″-N-CH3 3H S) 2.30(6′-NCH3 3H S) 1.97(4″-C-CH3 3H S) 1.20(1-NCH3 3H S)。
实施例2：SCO-2(C1-N-乙基-小诺霉素)的制备
投料：乙醛/四氢呋喃4.5ml
按上述通用操作方法A法，由14.2g三乙酰小诺霉素得到SCO-2 2.5g。[α]D t 115.4°；元素分析：C：53.70 H；9.40 N：14.20(理论值：C：53.77 H：9.37N：14.30)。IR(cm-1)3361 2935 1453 1373 MS(m/e)491 375 361 346314 289 233 160 143 115 100 43 HNMR(D2O)δ(ppm)  5.27(H-1′1H d) 5.00(H-1″1H d) 4.45(H-2″1H d J1″-2″＝3.5HZ  J2″-3″＝11.0HZ) 3.92(H-3″1H s) 2.48(3″-N-CH3 3H S) 2.35(6′-NCH33H S) 1.95(4″-C-CH3 3H S) 1.30(1-NCH2CH3 2H q) 1.25(1NCH2CH3 3H t)。
实施例3：SCO-3(C1-N-异丁基-小诺霉素)的制备
投料：异丁醛/四氢呋喃4ml
按上述通用操作方法A法，由14.1g三乙酰小诺霉素得到SCO-3 1.9g。[α]D t 119°；元素分析：C：55.40 H：9.51 N：13.49(理论值：C：55.50 H：9.63 N：13.48)。IR(cm-1)3360 2935 1452 1390 1372 MS(m/e)519 375 347 314 272 233 205 160 143 73 57 44 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.25(H-1′1H d) 5.01(H-1″1H d) 4.46(H-2″1H d J1″-2″＝3.5HZ J2″-3″＝11.0HZ) 2.45(3″-NCH3 3H S) 2.32(6′-NCH3 3H S) 1.96(4″-C-CH3 3H S) 1.20(1-NCH2-CH(CH3)2 2H d) 0.90(1-NCH2CH(CH3)2 6H d)。
实施例4：SCO-4(C1-N-苄基-小诺霉素)的制备
投料：苯甲醛/四氢呋喃  3.5ml
按上述通用操作方法A法，由14.3g三乙酰小诺霉素得到SCO-4 3.0g。[α]D t 119.2°；元素分析：C：58.60 H：8.50 N：12.65(理论值：C：58.59 H：8.68N：12.68)。IR(cm-1)3353 2936 1659 1454 1378 MS(m/e) 450 440422 394 360 142 91 HNMR(D2O)δ(ppm) 7.34(苯环5H) 5.24(H-1′1H d) 4.99(H-1″1H d) 4.44(H-2″1H d J1″-2″＝3.5HZ J2″-3″＝11.0HZ) 2.45(3″-NCH3 3H S) 2.30(6′-NCH3 3H S) 1.96(4″-CCH3 3HS) 1.20(1-NCH2-2H s)0.90(1-NCH2CH(CH3)2 6H d)。
实施例5：SCO-5(C1-N-(S)-γ-氨基-d-羟基丁酰基小诺霉素)的制备
投料：：PHBA  7.3gt
按上述通用操作方法B法，得到SCO-5  2.5g。[α]D t75.5°元素分析：C 51.00  H 8.50 N14.90(理论值：C：50.80 H：8.67 N：14.82)。IR(cm-1)33572936 1650 1452 1372 MS(m/e)501 464 451 433 405 372 305160 142 114 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.28(H-1′1H d) 5.05(H-1″1Hd)2.48(3″-NCH3 3H S) 2.34(6′-NCH3 3H S) 1.96(4″-CCH3 3HS) 1.00(1N-COCH(OH)CH2CH2NH2 1H t)
实施例6：SCO-6(C1-N-α-氨基乙酰基小诺霉素1-N-α-氨基乙酰基小诺霉素)的制备
投料：α-邻苯二甲酰胺基-乙酸5.2g
按上述通用操作方法B法，得到SCO-6 3.9g。[α]D t110.1°元素分析：C50.75 H8.46 N16.20(理论值：C：50.76  H：8.40  N：16.15)。IR(cm-1)3141  1713  1642  1402 MS(m/e)506 463 433 407 389 361 160142  114 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.28(H-1′1H d) 5.05(H-1″ 1H d)2.46(3″-NCH3 3H S) 2.32(6′-NCH3 3H S) 1.97(4″-CCH3 3HS) 1.25(1N-COCH2NH2 2H′S)
实施例7：SCO-7(C1-N-α-氨基-β-甲基丁酰基小诺霉素)的制备
投料：α-邻苯二甲酰胺基-β-甲基丁酸6.2g
按上述通用操作方法B法，得到SCO-7 4.5g。[α]D t130.8°元素分析：C52.80 H8.81 N15.40(理论值：C：53.40  H：8.90 N：14.90)。IR(cm-1)3240 1700 1650 1430 1367 MS(m/e)463 431 403 160 142 11499 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.25(H-1′1H d) 5.03(H-1″1H d)2.45(3″-NCH3 3H S) 2.32(6′-NCH3 3H S)1.96(4″-C-CH3 3H S)1.24(1N-COCH2CH(CH3)2 2H d)
实施例8：SCO-8(C1-N-α-氨基-β-羧基丙酰基小诺霉素)的制备
投料：α-邻苯二甲酰胺基-β-羧基丙酸6.6g
按上述通用操作方法B法，得到SCO-8 4.9g。[α]D t151°元素分析：C49.8 H 7.94 N14.59(理论值：C：49.75  H：7.80 N：14.50)。IR(cm-1)32201710 1670 1420 1367 MS(m/e) 464434 334 305 273 160 142114 HNMR(D2O)δ(ppm) 5.29(H-1′1H d) 5.05(H-1″ 1H d) 2.47(3″-NCH3 3H S) 2.34(6′-NCH3 3H S) 1.98(4″-CCH3 3H S)。
试验实施例1  体外活性试验
一、实验材料
1、小诺霉素衍生物SCO-1至SCO-8，均为白色粉末和硫酸小诺霉素白色粉末，效价：557U/mg
2、细菌
(1)临床分离菌株：试验所用菌株均为1999年从四川、北京地区收集的临床分离致病菌，并经本所药理室采用常规方法重新鉴定。
金黄色葡萄球菌7株，表皮葡萄球菌8株，链球菌5株，大肠埃希氏菌11株、肺炎克雷伯氏菌4株，铜绿假单胞菌8株，阴沟肠杆菌3株，共计46株。
(2)标准质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，金黄色葡萄球菌209P，大肠埃希氏菌ATCC25922，铜绿假单位胞菌ATCC27853为四川抗菌素工业研究所保存菌株。
3、培养基
(1)M-H培养基：水解酪蛋白17.5g，牛肉粉5g，可溶性淀粉1.5g，加蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4。固体培养基中加15g琼脂粉。用于革兰氏阳性、阴性需氧菌。
(2)血培养基：在M-H培养基中加入5％脱纤维兔血制成血培养基，用于链球菌的药敏试验。
二、试验方法
采用琼脂二倍稀释法测定SCO-1、SCO-2、SCO-3、SCO-4、SCO-5、SCO-6、SCO-7、SCO-8系列化合物的最低抑菌浓度。用多点接种仪将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面上，每点含菌量约为105CFU/ml，37℃孵育18～20小时，以无细菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。
表(1)SCO-1、SCO-2、SCO-3、SCO-4、SCO-5、SCO-6、SCO-7、SCO-8的抗菌谱
Figure C0113370100211
大肠99-3 ＞128 ＞128 64 ＞128 128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-4 ＞128 ＞128 64 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-5 ＞128 ＞128 64 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-6 ＞128 ＞128 64 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-7 ＞128 ＞128 64 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-142 128 ＞128 128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-147 128 ＞128 8 128 64 ＞128 ＞128 ＞128 32
大肠99-152 ＞128 ＞128 16 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
大肠99-160 ＜0.06 1 0.25 1 ＜0.06 128 64 64 ＜0.06
大肠ATCC25922 0.5 16 4 0.06 0.25 ＞128 ＞128 ＞128 1
克肺99-11 ＜0.06 0.5 ＜0.06 1 ＜0.06 128 64 8 ＜0.06
克肺99-17 128 ＞128 128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
克肺99-23 128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
克肺99-25 0.125 2 16  1 ＜0.06 128 ＞128 ＞128 0.125
绿脓99-46 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
绿脓99-47 8 ＞128 ＞128 16 8 ＞128 ＞128 ＞128 4
绿脓99-48 8 ＞128 ＞128 16 4 ＞128 ＞128 ＞128 4
绿脓99-49 8 ＞128 ＞128 16 8 ＞128 ＞128 ＞128 4
绿脓99-50 8 ＞128 ＞128 8 8 ＞128 ＞128 ＞128 4
绿脓99-111 4 128 ＞128 16 1 ＞128 ＞128 ＞128 4
绿脓99-105 2 128 128 8 4 ＞128 ＞128 ＞128 2
绿脓99-106 1 128 128 4 2 ＞128 ＞128 ＞128 2
绿脓ATCC27853 2 64 32 1 1 ＞128 ＞128 ＞128 8
阴沟99-3 128 128 64 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
阴沟99-4 ＜0.06 0.5 0.125 0.5 ＜0.06 64 64 4 ＜0.06
阴沟99-9 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128 ＞128
三、结果
由上表可以看出SCO-3、SCO-5对大肠埃希氏菌的抗菌活力，优于小诺霉素，其MIC50分别为64、128、128mg/L；SCO-1、SCO-5对铜绿单胞菌的抗菌活力与小诺霉素相当，MIC50均为2mg/L，SCO-4对铜绿假单胞菌的抗菌活力也较强，MIC50为8mg/L；SCO-3对阴沟肠杆菌的抗菌活力，优于小诺霉素。
SCO-1、SCO-4、SCO-5对金黄色葡萄球菌的抗菌活力最强，略低于小诺霉素，其MIC50分别为2、0.25、0.5mg/L；SCO-3、SCO-5对表皮葡萄球菌的抗菌活力优于小诺霉素，其MIC50均为32mg/L；SCO-1、SCO-4、SCO-5对链球菌的抗菌活力，优于小诺霉素，MIC50分别为16、32、32mg/L。
SCO-6、SCO-7、SCO-8对所试菌株的MIC值均大于128mg/L。
试验实施例2小诺霉素衍生物(SCO-1、SCO-2、SCO-5)合成化合物的急性毒性试验
一、实验材料
1、实验动物
选用健康昆明种小白鼠，体重均为18～22克，雌雄各半，随机分组。由四川抗菌素工业研究所动物中心提供，动物合格证：川实动质管第99-30号。
2、实验药品
(1)SCO-1：白色粉末。
(2)SCO-4：白色粉末。
(3)SCO-5：白色粉末。
(4)硫酸小诺霉素：白色粉末。
以上药物均由生理盐水配制备用。
3、给药途径与给药容积
单次静脉给药(i.v.)，25ml/Kg。
二、实验方法
在预试验获得0％和100％致死剂量的范围内将所试动物分为4～6个剂量组，每组受试动物数为10只，雌雄各半，随机均匀分组。分别静脉注射给药，给药后观察各个动物的毒性反应症状，对死亡动物即时进行尸解，肉眼观察各脏器内的病变。根据给药后七天动物死亡数计算其半数致死剂量LD50值。
实验数据处理
按照Bliss法，运用孙瑞元等主编的NDST计算机软件程序计算LD50值及95％可信限。
三、实验结果
1、SCO-1、SCO-4、SCO-5及硫酸小诺霉素对小鼠尾静脉注射给药的急性毒性反应
小鼠尾静脉注射SCO-1、SCO-4、SCO-5及硫酸小诺霉素约12小时后，高剂量组小鼠开始出现挣扎、行动失调等症状，24小时内相继死亡，其余各组未死动物一般在24小时后恢复正常。死亡动物尸解肉眼观察各脏器未见有明显病变。
表2 SCO-1、SCO-2、SCO-3及硫酸小诺霉素对小鼠尾静脉注射给药的LD50测定结果
          剂量   对数剂量  动物数  死亡数  死亡率  机率单位  LD50(mg/kg)
药物
        (mg/kg)     X      (只)    (只)    (％)     (Y)     (95％可信限)
        120.00    2.0792    10      9      90.0     6.59
        108.00    2.0334    10      8      80.0     5.82     96.4
SCO-1   97.20     1.9877    10      6      60.0     5.06     90.40～102.81
        87.48     1.9419    10      3      30.0     4.29
        78.73     1.8961    10      0      0.0      3.52
        145.80    2.1638    10      10     100.0    6.48
        131.22    2.1180    10      7      70.0     5.85     113.73
SCO-4   118.09    2.0722    10      6      60.0     5.22     104.43～122.22
        106.28    2.0265    10      3      30.0     4.60
        95.65     1.9807    10      2      20.0     3.97
SCO-5   150.00    2.1761    10      10     100.0    6.52
        135.00    2.1303    10    6    60.0    5.63    125.27
        121.50    2.0846    10    4    40.0    4.74    118.27～133.12
        109.25    2.0384    10    2    20.0    3.85
        98.32     1.9926    10    0    0.0     2.96
        100.00    2.0000    10    10   100.0   6.61
        90.00     1.9542    10    8    80.0    6.00
硫酸小  81.00     1.9085    10    6    60.0    5.38    75.82
诺霉素  72.90     1.8627    10    4    40.0    4.77    70.49～81.34
        65.61     1.8170    10    2    20.0    4.16
        59.04     1.7711    10    1    10.0    3.54
SCO-1、SCO-4、SCO-5对小鼠尾静脉注射给药的LD50分别为96.44mg/kg，113.73mg/Kg和125.27mg/Kg，硫酸小诺霉素对小鼠尾静脉注射给药的LD50为75.82mg/Kg(见表2)。SCO-1静脉注射对小鼠的毒性低于小诺霉素，比小诺霉素的LD50值高1.27倍。化合物SCO-4静脉注射对昆明种小鼠的毒性明显低于小诺霉素，比小诺霉素的LD50值高1.5倍；化合物SCO-5静脉注射对昆明种小鼠的毒性也明显低于小诺霉素，比小诺霉素高1.65倍。
制剂实施例1合成化合物的注射液
配方：
小诺霉素衍生物         0.3g-100g
亚硫酸钠               3g
EDTA二钠盐             0.5g-2g
注射用水               1000ml
制法：
将小诺霉素衍生物配方量加适量注射用水搅拌溶解，加入配方量亚硫酸钠，搅拌均匀后，再加入EDTA二钠盐，搅拌均匀，最后加注射用水至全量，调pH4.5-6.5之间，加活性炭搅拌，过滤制澄明液，通氮气灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得。

Claims (4)

1、一种下式(I)表示的小诺霉素衍生物或其药学上可接受的盐：
Figure C0113370100021
其中R2为CH3-；
Figure C0113370100022
2、一种制备下式(I)表示的小诺霉素衍生物的方法：
Figure C0113370100023
其中R2为CH3-；
Figure C0113370100024
其反应过程如下：
Figure C0113370100031
Figure C0113370100041
Figure C0113370100042
3、一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的由下式(I)表示的小诺霉素衍生物或其药学上可接受的盐以及药用辅剂，
Figure C0113370100043
其中R2为CH3-；
Figure C0113370100044
4、如权利要求1所述的小诺霉素衍生物的注射液，其组成如下：
小诺霉素衍生物      0.3g-100g
亚硫酸钠           2-10g
EDTA二钠盐         0.5g-2g
注射用水           1000ml
取小诺霉素衍生物配方量加适量注射用水搅拌溶解，加入配方量亚硫酸钠，搅拌均匀后，再加入EDTA  钠盐，搅拌均匀，最后加注射用水至全量，调pH4.5-6.5之间，加活性炭搅拌，过滤制澄明液，通氮气灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得。
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