CN115645385B - 甘草查尔酮b在制备治疗和/或预防ⅰ型干扰素病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Ⅰ型干扰素病药物中的应用，其中，甘草查尔酮B能通过抑制cGAS‑STING信号通路的活化抑制Ⅰ型干扰素的表达，能有效抑制Ⅰ型干扰素的过度活化以及下游相关基因的水平。并且甘草查尔酮B可以于甘草中提取得到，来源广泛、安全性高，疗效显著，非常适于制成治疗和/或预防I型干扰素病相关的药物。

Description

甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Ⅰ型干扰素病药物中的 应用

技术领域

本文涉及生物医药技术领域，尤指涉及甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Ⅰ型干扰素病药物中的应用。

背景技术

Ⅰ型干扰素病是近十年来概念较新的一组疾病，属于免疫缺陷病中的自身炎症性疾病，以体内Ⅰ型干扰素过度激活表达造成炎症损伤为突出特点。I干扰素病是一组遗传性自身炎症性疾病，其特征是I型干扰素(IFN)通路失调，导致多种细胞、组织、器官的功能损伤。

STING(stimulator of interferon genes)，又名为TMEM173、MITA、ERIS或MPYS，在胞质DNA刺激下，它响应来自胞质DNA受体的信号，在诱导产生干扰素的过程中发挥着关键性的作用。宿主细胞的DNA识别受体识别外源或内源的“非己”DNA后将信号传递给内质网上的节点分子STING，随后STING迅速二聚化并从内质网转移到核外周小体上。在这个过程中，激酶TBK1也会被招募并转移到核外周小体上激活，被激活的TBK1磷酸化转录因子IRF3，随后IRF3发生二聚化并进入细胞核激活多种靶基因的转录表达。正常激活的cGAS-STING信号通路有助于机体识别和清除入侵的DNA病原微生物，但是异常过度激活的cGAS-STING信号通路会造成机体发生炎症及自身免疫性疾病等，如Aicardi-Goutieres综合征、***性红斑狼疮或狼疮样疾病。

对于Ⅰ型干扰素病的治疗，抑制I型干扰素的产生具有重要意义。从理论上讲，Ⅰ型干扰素的抗体是一种潜在的治疗方式，体外试验显示抗Ⅰ型干扰素的抗体可阻止Ⅰ型干扰素及其相关基因的过度表达，并且目前显示干扰素单克隆抗体用于治疗***性红斑狼疮正处于Ⅱ期临床实验阶段。另外，有研究指出在Janus kinase(JAK)抑制剂和逆转录酶抑制剂治疗下能改善Ⅰ型干扰素介导的一些相关疾病如AGS综合征，但是到目前为止，接受治疗的患者数量非常少，目前还没有来自临床试验的数据，而且这类药物对中枢神经***疾病的影响难以判断。因此，开发一种高效且有安全性的治疗Ⅰ型干扰素相关疾病的药物是必要的。

发明内容

本申请要解决的技术问题是找寻一种治疗Ⅰ型干扰素疾病的高效，稳定以及有良好安全性的药物。具体地，本申请提供了甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Ⅰ型干扰素病药物中的应用。

在一方面，本申请提供甘草查尔酮B的一种药物新用途。

甘草查尔酮B(Licochalcone B)，其结构式如下所示，CAS号为：58749-23-8。分子式为C₁₆H₁₄O₅，分子量为286.279，橘黄色粉末，溶于甲醇，DMSO。其结构式如下：

申请人发现甘草查尔酮B对cGAS-STING信号通路具有抑制作用，能有效抑制cGAS-STING信号通路的活化，cGAS-STING信号通路的抑制可抑制I型干扰素的产生，并对I型干扰素病具有治疗作用。在本发明的一种实施方案中，本发明提供了甘草查尔酮B作为cGAS-STING信号通路抑制剂的用途，或者，甘草查尔酮B作为治疗I型干扰素病相关的用途。cGAS-STING信号通路异常活化相关疾病包括但不限于Aicardi-Goutières综合征(AGS)、***性红斑狼疮，婴儿期发病的STING相关血管病变、家族性冻疮狼疮和视网膜血管病变伴脑白质营养不良等。

本申请具有以下增益效果：

申请人通过药效学实验证明，本申请提供了一种甘草查尔酮B作为cGAS-STING信号通路异常活化诱导I型干扰素病的治疗方案，尤其是TREX1基因缺陷引起的炎症性或自身免疫性疾病，例如AGS综合征。通过大量的实验表明，甘草查尔酮B在细胞水平能通过抑制cGAS-STING信号通路的活化抑制I型干扰素的表达。进一步研究表明，在体内实验中，甘草查尔酮B能有效改善AGS模型小鼠干扰素及下游相关基因的水平。并且甘草查尔酮B可以于甘草中提取得到，来源广泛、安全性高，疗效显著，非常适于制成治疗和/或预防I型干扰素病相关的药物。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B在小鼠BMDM(骨髓来源的巨噬细胞)细胞中对cGAS-STING信号通路活性的抑制效果的结果图。其中，HT-DNA为cGAS-STING信号通路的激动剂，p-IRF3为IRF3蛋白的磷酸化形式，p-IRF3的增加代表cGAS-STING信号通路的活化程度提高。

图2为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B在小鼠BMDM细胞中对IFN mRNA水平的抑制效果的结果图。

图3为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B在小鼠BMDM细胞中对IFN-β蛋白水平的抑制效果的结果图。

图4为本申请的一种实施方案中在小鼠体内的血清中检测到的甘草查尔酮B对STING激动剂CMA(10-羧甲基-9-吖啶酮(10-carboxymethyl-9-acridanone))诱导的I干扰素水平升高的抑制作用的结果图。

图5为本申请的一种实施方案中在小鼠体内的腹腔中检测到的甘草查尔酮B对STING激动剂CMA诱导的I干扰素水平升高的抑制作用的结果图。

图6为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B对AGS模型小鼠的BMDMs中IFN mRNA水平的抑制效果的结果图。其中，DMSO为空白对照，Trex1 KO为Trex1基因敲除小鼠组。

图7为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B对AGS模型小鼠心脏、肝、肺、肾、胃、肠等IFN mRNA水平的抑制效果的结果图。

图8为本申请的一种实施方案中甘草查尔酮B显著改善AGS模型小鼠心脏、肝、肺、肾、胃、肠等组织的损伤的结果图。

具体实施方式

I型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子。它的产生主要由先天性免疫细胞表面或内部受体，通过胞内的信号分子传递，最终激活转录因子IRF3/7从而启动I型干扰素基因的表达。I型干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性等多种作用。然而，I型干扰素产生/信号传导的失调与多种病理相关，如I型干扰素病。绝大多数的I干扰素病的发病机制与体内的核酸代谢极其相关，由于某种基因缺陷导致机体细胞核内、反转录原件或线粒体内出现异常积累而又不能被快速消除的核酸或核酸代谢产物，那么极有可能造成干扰素病的出现。cGAS-STING信号通路可以感受胞质中异常存在的双链DNA，故不论病原体感染带来的外源DNA，还是自身细胞核或线粒体泄露的内源DNA，都能激活cGAS-STING通路，进而诱导I型干扰素等的表达。

研究表明cGAS-STING通路与I型干扰素病(Aicardi-Goutières综合征(AGS))密切相关，TREX1编码DNA酶，当TREX1缺失或N-端突变破坏了其DNase活性，导致胞质DNA的大量累积，激活cGAS-STING信号通路，引起I型干扰素和其他炎症因子的表达。此外，cGAS-STING通路也与其他I型干扰素病密切相关，如***性红斑狼疮、婴儿期发病的STING相关血管病变、家族性冻疮狼疮和视网膜血管病变伴脑白质营养不良等。因此，抑制I型干扰素的产生对上述疾病的治疗具有重要意义。越来越多的研究显示cGAS-STING信号通路与I型干扰素疾病的发生密切相关。因此，抑制cGAS-STING可能为I型干扰素疾病的治疗带来新的希望。

因此，本申请提供了甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Ⅰ型干扰素病药物中的应用。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物包含甘草查尔酮B的药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是可以被配制成用于药物使用的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。

在一些实施方案中，Ⅰ型干扰素病包括Aicardi-Goutieres综合征、腺苷脱氨酶2缺陷、***性红斑狼疮、STING相关婴儿期起病血管病、蛋白酶体相关的自身炎症综合征、症状性腹泻/三肝肠综合征、X连锁网状色素异常症、脊柱软骨发育不良伴免疫调节异常、家族性冻疮狼疮和视网膜血管病变伴脑白质营养不良中的一种或更多种。

在一些实施方案中，Ⅰ型干扰素病为Aicardi-Goutieres综合征。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物为抑制cGAS-STING信号通路异常活化的抑制剂。cGAS-STING信号通路的异常活化包括Trex1基因变异，如Trex1基因缺陷，以及干扰素诱导剂的诱导等。cGAS-STING信号通路异常活化能诱导各种疾病及并发症，包括但不限于AGS综合征。抑制剂是指抑制、部分或全部阻断刺激或激活、减少、阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调生理/细胞过程的化合物。激动剂是指诱导、激活、刺激、增加、促进、增强激活、敏化或上调至少一种生理/细胞过程的化合物。制备的抑制剂能通过抑制cGAS-STING信号通路异常活化进而降低Ⅰ型干扰素的水平。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物通过口服、静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、***内、直肠内、膀胱内、肿瘤内、局部、肌肉内、皮下、粘膜、吸入、注射、输注，或其任何组合来施用。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物的剂型包括胶囊、片剂、丸剂、液体、粉末、颗粒剂、细颗粒剂、薄膜包衣剂、药丸、锭剂、舌下剂、胶溶剂、含服制剂、糊剂、糖浆、悬剂、酏剂、乳剂、包衣剂、软膏剂、硬膏剂、泥罨剂、透皮制剂、洗剂、吸入剂、气雾剂、注射剂和栓剂。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物还包含药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备药物组合物的通常为安全的、无毒性的且合意的赋形剂，并且包括对于兽医使用以及人类药物使用是可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是固体、液体、半固体的，或者在气雾剂组合物的情况下是气体的。适于口服和表面使用的药用级有机或无机载体和/或稀释剂可以用于制成含有治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物油和动物油以及脂肪。稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐或用于确保适当的pH值的缓冲剂以及皮肤渗透增强剂可以被用作辅助剂。赋形剂的非限制性实例包括制粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、调味剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、植物纤维素材料和成球剂及其任何组合。

在一些实施方案中，甘草查尔酮B或其药学上可接受的盐可以合适地被制备为药物组合物和单位剂型，以作为以下使用：用于口服使用的固体(例如，片剂或填充胶囊)或液体(例如，溶液、悬浮液、乳液、酏剂或用其填充的胶囊)，用于直肠施用的软膏、栓剂或灌肠剂的形式，用于肠胃外使用(例如，肌内施用、皮下施用、静脉内施用、硬膜外施用、关节内施用和鞘内施用)的无菌可注射溶液的形式；或用于肠胃外(例如，表面、含服、舌下、***)施用的软膏、洗剂、乳膏、凝胶、贴剂、舌下条或膜等形式。

在一些实施方案中，本申请中制备的药物制剂可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、***内、直肠内、膀胱内(例如，诸如通过注射或通过膀胱内滴注直接施用至膀胱中)、肿瘤内、局部、肌肉内、皮下、粘膜、口服、局部、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注，经由导管、经由灌洗以乳油、以液体组合物(例如，脂质体)直接局部灌注，或者通过如本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合来施用。

在一些实施方案中，甘草查尔酮B在受试者中的施用剂量为0.5-50mg/kg/d。在一些实施方案中，每天施用至受试者的甘草查尔酮B的剂量选自由以下组成的组：约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约2.0mg/kg、约3.0mg/kg、约4.0mg/kg、约5.0mg/kg、约6.0mg/kg、约7.0mg/kg、约8.0mg/kg、约9.0mg/kg、约10.0mg/kg、约11.0mg/kg、约12.0mg/kg、约13.0mg/kg、约14.0mg/kg、约15.0mg/kg、约16.0mg/kg、约17.0mg/kg、约18.0mg/kg、约19.0mg/kg、约20.0mg/kg、约22.5mg/kg、约25.0mg/kg、约27.5mg/kg、约30.0mg/kg、约32.5mg/kg、约35.0mg/kg、约37.5mg/kg、约40.0mg/kg、约42.5mg/kg、约45mg/kg、约47.5mg/kg和约50.0mg/kg。

在一些实施方案中，受试者是人类、大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、奶牛、猴。在一些实施方案中，受试者的说明性实例包括灵长类动物，特别是人类，伴侣动物诸如猫和狗以及类似动物，工作动物诸如马、驴以及类似动物，牲畜动物诸如绵羊、牛、山羊、猪以及类似动物，实验室测试动物诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠以及类似动物，以及圈养野生动物诸如动物园和野生动物园中的圈养野生动物、鹿、澳洲野狗以及类似动物。在一些实施方案中，受试者是人类。

下面结合附图和实施例对本申请的具体实施方式作进一步详细描述。

本申请描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本申请所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征可以与任何其它实施例中的任何其他特征结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征。

本申请包括并设想了与本领域普通技术人员已知的特征的组合。本申请已经公开的实施例和特征也可以与任何常规特征组合，以形成由权利要求限定的独特的发明方案。任何实施例的任何特征也可以与来自其它发明方案的特征组合，以形成另一个由权利要求限定的独特的发明方案。因此，应当理解，在本申请中示出和/或讨论的任何特征可以单独地或以任何适当的组合来实现。因此，除了根据所附权利要求及其等同替换所做的限制以外，实施例不受其它限制。此外，可以在所附权利要求的保护范围内进行各种修改和改变。

此外，在描述具有代表性的实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤序列。然而，在该方法或过程不依赖于本文所述步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所述的特定顺序的步骤。如本领域普通技术人员将理解的，其它的步骤顺序也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对该方法和/或过程的权利要求不应限于按照所写顺序执行它们的步骤，本领域技术人员可以容易地理解，这些顺序可以变化，并且仍然保持在本申请实施例的精神和范围内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本申请实施例中所采用的甘草查尔酮B均购自MCE公司。

实施例1：甘草查尔酮B在小鼠BMDM细胞中显著抑制了cGAS-STING信号通路活性

1实验方法：

从小鼠大腿股骨出分离出骨髓细胞并培养于含生长因子M-CSF的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)中(10％ FBS,1％青霉素/链霉素)使其完全分化为小鼠骨髓巨噬细胞(BMDMs)。随后，BMDMs以1.2x10⁶个/ml的密度接种于12孔板中过夜。第二天，用甘草查尔酮B(5μM，10μM，20μM，40μM)处理细胞1小时后，再加入cGAS-STING信号通路激动剂HT-DNA刺激2小时。随后，弃去上清，用PBS清洗3遍，然后用RIPA(Radio ImmunoprecipitationAssay)裂解液裂解细胞，并通过免疫印迹评估甘草查尔酮B对cGAS-STING信号通路的抑制情况。免疫印迹检测：检测细胞裂解液中磷酸化IRF3、IRF3、STING、HSP90的蛋白水平。

2、实验结果：

上述实验结果如图1所示，在BMDMs中，甘草查尔酮B对HT-DNA诱导的cGAS-STING信号通路活化有显著的抑制效果。

实施例2：甘草查尔酮B在小鼠BMDM细胞中对cGAS-STING信号通路活化后IFN mRNA水平升高具有抑制作用。

1、实验方法：

实施例2的实验方法与实施例1类似，BMDMs细胞经甘草查尔酮B(5μM，10μM，20μM，40μM)处理1小时后，用HT-DNA刺激2小时。随后，弃去上清，用PBS清洗三遍，然后用RNA裂解液Trizol裂解细胞，并通过qPCR评估甘草查尔酮B对cGAS-STING信号通路活化后IFN mRNA水平的抑制情况。

2、实验结果：

上述实验结果如图2所示，在BMDMs中，甘草查尔酮B显著抑制了HT-DNA诱导的IFNmRNA水平。

实施例3：甘草查尔酮B在小鼠BMDM细胞中对cGAS-STING信号通路活化后产生的IFN-β蛋白具有抑制作用

1、实验方法：

实施例3的实验方法与实施例1类似，BMDMs细胞经甘草查尔酮B(5μM，10μM，20μM，40μM)处理1小时后，用HT-DNA刺激12小时。随后，收集上清，然后通过ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)评估甘草查尔酮B对cGAS-STING信号通路活化后IFN-β蛋白水平的抑制情况。

2、实验结果：

上述实验结果如图3所示，在BMDMs中，甘草查尔酮B显著抑制了HT-DNA诱导的IFN-β蛋白水平。

实施例4：在小鼠体内甘草查尔酮B对STING激动剂CMA诱导的IFN水平有显著的抑制效果

1、实验方法：

选取7-8周C57BL/6雌性小鼠，购自北京斯贝福生物技术有限公司，随机分为4组，分别为空白对照组、CMA模型组、甘草查尔酮B治疗组(20mg/kg)、甘草查尔酮B治疗组(40mg/kg)；空白对照组、模型组腹腔注射等量的5％ DMSO，5％吐温80的生理盐水溶液，其余组别分别腹腔注射溶解于5％DMSO，5％吐温80的生理盐水溶液的甘草查尔酮B；1h后，除空白对照组腹腔注射0.2ml的生理盐水溶液外，其余各组分别注射0.2ml 180mg/kg的CMA，4h后收集小鼠血清，腹腔灌洗液。评估甘草查尔酮B对CMA诱导的IFN水平的抑制效果。

2、实验结果

实验结果如图4部分所示，甘草查尔酮B显著抑制了血清中CMA诱导的IFN水平。另外，如图5部分所示，甘草查尔酮B对腹腔中的IFN水平同样有显著的抑制效果。

实施例5：甘草查尔酮B显著抑制了AGS模型小鼠BMDMs中IFN mRNA水平

1、实验方法：

AGS模型小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。

野生型小鼠(WT)的BMDMs和AGS模型小鼠的BMDMs如实施例1中制备，随后将野生型小鼠(WT)的BMDMs和AGS模型小鼠的BMDMs以1.2x106个/ml的密度接种于12孔板中过夜。以WT BMDMs为空白对照。第二天，用甘草查尔酮B(40μM)处理10小时。随后，用Trizol裂解细胞，收集样品后，通过qPCR评估甘草查尔酮B对AGS模型小鼠BMDMs中IFN mRNA水平的抑制情况。

2、实验结果

实验结果如图6所示，甘草查尔酮B显著抑制了AGS模型小鼠BMDMs中IFN mRNA水平。

实施例6：甘草查尔酮B对AGS模型小鼠心脏、肌肉和舌头等IFN mRNA水平的抑制效果及对AGS模型小鼠心脏，肝，肠等组织损伤的改善作用

1、实验方法：

选用4周大小的WT小鼠和AGS模型小鼠，以WT小鼠作为空白对照，每组3只。Trex1^-/-小鼠用甘草查尔酮B处理(40mg/kg)，通过腹腔注射，并且连续处理2周。给药完成后，取下小鼠的心脏，肝，肠等组织，一部份进行HE染色，检测各组织病理改变，另一部***解于Trizol中，经组织匀浆后，吸取上清液作为RNA裂解液，并通过qPCR评估甘草查尔酮B对AGS模型小鼠各组织中IFN mRNA水平的抑制情况。

2、实验结果：

上述结果如图7所示，AGS模型小鼠心脏、肝、肺、肾、胃、肠等组织IFN mRNA水平在经甘草查尔酮B处理后显著被抑制。图8所示甘草查尔酮B处理后显著改善AGS模型小鼠心脏、肝、肺、肾、胃、肠等组织的损伤。

由上述实施例可知，本发明提供了甘草查尔酮B可以作为I型干扰素病和AGS病人的潜在治疗方案，其为临床诊断和治疗方案提供了重要参照依据。但本发明并不局限于上述详细特征及因cGAS-STING活性失调导致I型干扰素列举疾病类型。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进以及增加因cGAS-STING活性失调导致的I型干扰素病类型的检测等，均属于本发明的保护和公开范围之内。

Claims (9)

1.甘草查尔酮B在制备治疗和/或预防Aicardi-Goutieres综合征药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述甘草查尔酮B以其药学上可接受的盐的形式存在。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物为抑制cGAS-STING信号通路异常活化的抑制剂。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述药物通过口服、静脉内、动脉内、腹膜内或其任何组合来施用。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述药物的剂型选自胶囊、片剂、丸剂、液体、粉末、颗粒剂和注射剂中的一种或更多种。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述药物还包含药学上可接受的赋形剂。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述甘草查尔酮B在受试者中的施用剂量为0.5-50mg/kg/d。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述受试者是哺乳动物。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述受试者为人类、大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、奶牛或猴。