CN115598246A - 快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)取血浆样品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂，进行蛋白沉淀后，取得过滤液；(2)将亲水作用固相萃取板按照活化、平衡、将过滤液上样、淋洗、洗脱的步骤获得洗脱下来的洗脱液；(3)对步骤(2)洗脱下来的洗脱液进行LC‑MS/MS分析，测定PSTs及TTX类物质的含量。本发明方法可以用于定性、定量检测人血浆中PSTs及TTX类物质，结果可靠、检测限低，速度快。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及快速测定人血浆中麻痹性贝类毒素及河豚毒素类物质的检测方法。
背景技术
河豚毒素类物质，主要包括河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)、11-oxTTX、11-deoxyTTX、11-norTTX-6(R)-ol、11-norTTX-6(S)-ol、4-epiTTX、4,9-anhydroTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、5-deoxyTTX、5,11-dideoxyTTX和6,11-dideoxyTTX等。属于强毒性的非蛋白类的神经毒素，广泛存在于河豚鱼和一些两栖动物体内。TTX类物质的中毒的程度与其摄入量、摄入后的时间和中毒前的健康状况有关。作为一类强效毒素，可选择性的阻断钠离子(NaV)通道，如NaV1.1、NaV1.2、NaV1.3、NaV1.6和NaV1.7，这些通道广泛分布于人类的中枢和外周神经***，通过阻断神经冲动的传导实现神经麻痹，被认为是很有前景的疼痛治疗药物。其中，研究最多的是TTX，有报道TTX对人的致死剂量估计为6～7μg/kg体重，在0.5μg/kg体重时血压就会有下降趋势。当TTX用于临床治疗时，其剂量远低于LD50(小鼠腹腔注射的LD50为8μg/kg)，目前临床试验报告的给药剂量为15-90μg(60kg/人)，血液中Cmax约为1ng/mL。
麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish toxins，PSTs)是一组天然的毒性生物碱，主要包括：石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素(Neo-Saxitoxin，neo-STX)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoyl saxitoxin，dc-STX)、漆沟藻毒素1～6(Gonyautoxin 1～6，GTX 1～6)、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素2(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin 2，C1)、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素3(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin 3，C2)、脱氨甲酰基漆沟藻毒素2(Decarbamoyl gonyautoxin 2，dc-GTX 2)、脱氨甲酰基漆沟藻毒素3(Decarbamoylgonyautoxin 3，dc-GTX 3)等。主要来源于赤潮中的有毒藻类，其毒理与河豚毒素类物质相似，都可通过选择性阻断钠离子通道，导致神经麻痹，甚至呼吸瘫痪。PSTs使人的中毒范围在600～5000μM之间，致死剂量为3000～30000μM。根据基团的相似性可分为四类：氨基甲酸酯类毒素、N-磺酰胺甲酰基类毒素、脱胺甲酰基类毒素和脱氧甲酰基类毒素。近年来发现其与TTX类物质常在贝类动物中被检出，因此，为了确保患者的安全，并了解药物浓度与疗效之间的关系，亟需一种灵敏、准确和可靠的检测方法同时监测人体血液中TTX类物质和PSTs的水平。
目前，测定TTX类物质和PSTs的方法有小鼠生物法、液相荧光法、酶联免疫吸附法和液相色谱-串联质谱法等。然而，小鼠生物法需针对特定动物检测，且前处理繁琐，重复性差；液相荧光法虽然操作简便，但灵敏度低、专一性差。酶联免疫吸附法灵敏度高、特异性强，但前处理复杂，反应耗时长，操作难度较大。与前几种方法相比，液相色谱-串联质谱法是最有优势的技术，它具有特异性好、灵敏度高的特点，可以更快速、精准的测定人血液中TTX类物质和PSTs的浓度，从而为临床诊断提供更高效、准确的判断依据。但该技术仍有很大挑战，主要在于前处理方法的富集效果不佳和去干扰能力差。
TTX类物质和PSTs均为强极性碱性物质，在传统的反相色谱柱上保留性差，质谱电离效率低。亲水作用液相色谱(HILIC)可以帮助解决这些问题，在LC-MS中显示出较好的保留能力和电离效率。生物样品中共流出基质导致目标分析物离子抑制(基质效应)是定量检测血浆中这两类物质的另一个挑战。这类物质样品的制备最常用的技术是固相萃取(SPE)，基于TTX类物质和PSTs的结构特点，可能用到三种不同作用机制的填料，一种是阳离子交换萃取。因化合物结构中所带的正电荷基团与固定相的磺酸基团发生强烈的相互作用，使得目标分析物在SPE上被牢牢保留，只有盐酸等强酸才能将其洗脱，从SPE洗脱的样品需要溶剂蒸发和复溶去除强酸才能进入LC-MS检测，这既耗时又费力，且通常因强酸的加入，可能会带来其它杂质。因此，强阳离子交换萃取技术目前很少用于此类物质的检测。另一种SPE材料是石墨化碳载体，这种材料利用反相吸附原理保留目标分析物，因化合物极性大，通常回收率不佳，主要原因还是在于固定相对其保留的能力有限以及基质分离不足引起的离子抑制。由于目标分析物的亲水性，亲水作用-固相萃取(HILIC-SPE)可作为第三种选择。HILIC-SPE是利用亲水相互作用将亲水性的化合物保留在填料上再进行洗脱的过程，但是HILIC作用力不强，因此保留能力和去除杂质的能力也有限。为了同时满足回收率和去杂质效果，有人先后使用C18和HILIC两种SPE填料希望增加对这类物质的富集和除杂质，该方法包括两次SPE萃取过程，洗脱后的产物需90℃吹干，步骤耗时且较为复杂[Fong BM etal.Talanta.2011Jan 15；83(3):1030-6.]。目前无可供使用的简便且准确灵敏的TTX类物质和PSTs的检测方法用于血浆样本的测定。
因此，本领域迫切需要简便、快速且准确灵敏的测定TTX类物质和PSTs的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速且准确灵敏的测定TTX类物质和PSTs的检测方法。
因此本发明考察了3种市售的HILIC-SPE板(分别为硅羟基SPE、酰胺基SPE、多元羧酸SPE)，并创新了前处理试剂组成，改变TTX类物质和PSTs与HILIC-SPE固定相的单一作用力，使得二者结合时具备了亲水作用和离子交换作用双重模式，该技术用于血浆样本的前处理，结合LC-MS/MS检测血浆中TTX类物质和PSTs，方法的灵敏度佳、基质效应小、回收率高。
本发明提供一种快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)取血浆样品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂，内含内标Arg-15N4，进行蛋白沉淀后，取得过滤液；
(2)用甲醇活化、乙腈平衡亲水作用固相萃取板，将步骤(1)获得的过滤液上样至亲水作用固相萃取板后，用95％乙腈淋洗一次，加入三氯乙酸-乙腈溶液的洗脱液洗脱；
(3)对步骤(2)洗脱下来的洗脱液进行LC-MS/MS分析，测定PSTs及TTX类物质的含量。
上述步骤(1)中含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％-10％，内标Arg-15N4的质量百分比浓度为0.1-10ng/ml。较佳的，所述内标Arg-15N4的质量百分比浓度为0.71ng/ml。
上述步骤(2)中固相萃取板为含多元羧酸键合相、硅羟基键合相以及酰胺基键合相的亲水作用固相萃取板。较佳的，所述固相萃取板为含多元羧酸键合相的亲水作用固相萃取板，本文中也称之为多元羧酸SPE。
上述步骤(3)中三氯乙酸-乙腈溶液组成为：质量百分比浓度0.5％-5％三氯乙酸，质量百分比浓度40％-60％乙腈，其余水。
具体实施例中，上述步骤(3)中三氯乙酸-乙腈溶液组成为质量百分比浓度1％三氯乙酸，质量百分比浓度50％乙腈，其余水。
上述PSTs为石房蛤毒素、新石房蛤毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素、漆沟藻毒素1～6、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素2、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素3、脱氨甲酰基漆沟藻毒素2或脱氨甲酰基漆沟藻毒素3中一种以上。
上述TTX类物质包括河豚毒素、11-oxTTX、11-deoxyTTX、11-norTTX-6(R)-ol、11-norTTX-6(S)-ol、4-epiTTX、4,9-anhydroTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、5-deoxyTTX、5,11-dideoxyTTX或6,11-dideoxyTTX中一种以上。
上述PSTs为漆沟藻毒素，TTX类物质为河豚毒素。
上述步骤(1)中采用沉淀板正压，取得过滤液。
上述步骤(1)中三氯乙酸的乙腈溶液中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％-10％。优选的，所述三氯乙酸的乙腈溶液中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％-5％。
本发明建立了一种基于HILIC-离子交换双重作用模式的SPE萃取技术处理血浆样本，用于人血浆中TTX类物质和PSTs的LC-MS/MS方法检测。
A.本发明在处理溶剂中增加了三氯乙酸试剂，并优化处理溶剂的组成，改变传统单一的HILIC保留原理为HILIC-离子交换双重作用模式，大大增强了固定相与极性、碱性化合物的相互作用，提高了TTX类物质和PSTs的回收率高；
B.本发明使用的三氯乙酸试剂，除了增加TTX类物质和PSTs在SPE上的保留之外，也是沉淀剂的组成部分，这种含三氯乙酸试剂的沉淀剂，增大了分析物与血浆蛋白的解离，从而有利于TTX类物质和PSTs在血浆中的释放，以便其能更好的与SPE发生相互作用，进一步提高回收率；
C.本发明使得TTX类物质和PSTs在SPE上增加保留的同时，去除了过去常常干扰其检测的部分极性干扰物及非极性干扰物等共流出，使得血浆样品经处理后无明显基质效应；
D.本发明描述的处理方法结合LC-MS/MS检测血浆中TTX类物质和PSTs，回收率高、准确度和精密度好，线性范围能很好的满足TTX类物质和PSTs的药代动力学研究和临床中毒的浓度范围，且一针检测时间为4.5分钟，分析时间短，前处理无需蒸发浓缩，简便快速。
(1)TTX类物质和PSTs的释放：和其他方法蛋白沉淀不同，本方法中血浆需用含三氯乙酸的有机溶剂沉淀剂沉淀释放，增加TTX类物质和PSTs的蛋白解离度和释放率。
(2)上样溶液的组成：本方法考察了4种上样溶液对TTX类物质和PSTs回收率的影响，比较后发现含酸上样溶液保留较强，含三氯乙酸的上样溶液强于甲酸，推测含酸上样溶液可使TTX类物质和PSTs与HILIC-SPE形成HILIC-离子交换双模式SPE，增加回收率，而酸的种类和浓度可能使得相互作用的强弱不同。
(3)SPE板的选择：与传统的HILIC-SPE或单纯离子交换模式SPE不同，本方法选用的3种HILIC-SPE，在含酸(三氯乙酸)的上样溶液中部分转化为离子状态，可对TTX类物质和PSTs产生不同程度的离子交换作用，从而对TTX类物质和PSTs产生不同程度的保留。其中，多元羧酸SPE对TTX类物质和PSTs的保留最强，其次是硅羟基SPE，最后是酰胺基SPE。
本发明的有益效果：
与已发表过的方法相比较有以下几种优点：
A.本发明采用快速沉淀结合SPE的过程，无吹干重组等步骤，操作简便，重现性好，LC-MS/MS检测时间仅为4.5分钟，大大节省了时间成本，利于自动化转化。
B.本发明可测得血浆样本中极微量浓度的TTX类物质和PSTs，定量下限可达到0.1ng/mL，为临床提供灵敏度极佳的检测结果。
C.本方法准确度好，精密度高，回收率佳，线性范围广，且无明显基质效应，性能卓越，适用于人体内TTX类物质和PSTs的药代动力学和毒性研究。
D.在液相色谱-串联质谱方法中用HILIC-离子交换的双模式SPE前处理进行检测的方法，萃取机制未见报道。
附图说明
图1TTX和GTX5筛选3种SPE板的回收率；
图2TTX和GTX5考察不同上样溶液的回收率；
图3TTX线性范围图；
图4GTX5线性范围图；
图5样品中各物质色谱图。
a.LLOQ样品及空白样品中TTX色谱图(TTX 0.1ng/mL)；
b.LLOQ样品及空白样品中GTX5色谱图(GTX50.1ng/mL)；
c.LLOQ样品及空白样品中内标色谱图(内标Arg-15N45ng/mL)。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明，本发明试剂均可市场上购买。本发明百分比浓度如无特别说明，均为质量百分比浓度。
实施例1TTX和GTX5的检测
(1)血浆样品前处理
①上样溶液中加酸与否以及不同酸的比较
吸取100μL待测血浆样本到96孔收集板中，再加入700μL沉淀剂(分别为乙腈、含有甲酸或三氯乙酸的乙腈溶液，均含内标Arg-15N40.71ng/mL)，将96孔收集板放到振荡器上1200rpm涡旋混匀5min，再将混匀后的样品全部转移至96孔沉淀板(2ml/well)中正压，取全部过滤液上样SPE处理(本例中为多元羧酸SPE，购自天津赛飞乐生物技术有限公司，货号：S-iHX960302-W，规格：30mg/2mL/well)，洗脱液经LC-MS/MS检测。不同上样溶液的回收率见图2。
②3种HILIC-SPE板回收率比较
吸取100μL待测样本到96孔收集板中，沉淀处理同①(沉淀剂为0.5％-5％三氯乙酸-乙腈溶液，本例中为1％三氯乙酸-乙腈溶液)，取全部过滤液待SPE处理。本方法考察了3种96孔SPE板(硅羟基SPE、酰胺基SPE、多元羧酸SPE)，先后经甲醇、乙腈活化平衡后，过滤液上样至SPE板中，正压。待过滤液完全滴入96孔收集板后，丢弃收集板中的废液，加入200μL淋洗液(80％-100％乙腈，本例采用95％乙腈),再次正压，待淋洗液完全滴入96孔收集板后，丢弃收集板中的废液。向SPE板中加入200μL洗脱液(0.5％-5％三氯乙酸40％-60％乙腈溶液，本方法采用1％三氯乙酸-50％乙腈溶液，其余水)，待洗脱液完全滴入96孔收集板，最后经LC-MS/MS检测。3种SPE板的回收率见图1。
结合图1和图2可看出，含三氯乙酸的沉淀剂血浆TTX和GTX5回收率最高，而3种HILIC-SPE中多元羧酸SPE对TTX和GTX5的回收率最高，分别为80％和78％左右。
(2)液相条件
(3)质谱条件
(4)实施结果及数据分析
①灵敏度和线性范围
该方法线性良好，TTX与GTX5在200倍线性范围(0.1～20ng/mL)内R值分别为0.9997(见图3)和1.0000(见图4)，TTX的定量下限(S/N>10)约为0.1ng/mL(见图5a)，GTX5的定量下限(S/N>10)约为0.1ng/mL(见图5b)。
②方法的准确度、精密度、回收率和基质效应
本方法考察了添加准确度、精密度、回收率和基质效应，并进行了连续三个批次的验证。结果表明(见表1和表2)，血浆中TTX和GTX5在线性范围内具有较好的准确度和精密度。TTX和GTX5的批内准确度分别为98.50％～99.82％和96.21％～98.75％，批间准确度分别为98.84％～99.48％和97.23％～99.48％。TTX方法的批内和批间精密度分别＜6％和＜7％，GTX5方法的批内和批间精密度分别＜6％和＜6％。TTX和GTX5的血浆提取回收率分别在80％和78％左右，无明显基质效应。
表1.血浆中TTX的方法学验证结果表
表2.血浆中GTX5的方法学验证结果表
此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。
Claims (11)
1.一种快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)取血浆样品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂，内含内标Arg-15N4，进行蛋白沉淀后，取得过滤液；
(2)用甲醇活化、乙腈平衡亲水作用固相萃取板，将步骤(1)获得的过滤液上样至亲水作用固相萃取板后，用95％乙腈溶液淋洗一次，加入三氯乙酸-乙腈溶液的洗脱液洗脱；
(3)对步骤(2)洗脱下来的洗脱液进行LC-MS/MS分析，测定PSTs及TTX类物质的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％-10％，内标Arg-15N4的质量百分比浓度为0.1-10ng/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固相萃取板为含多元羧酸键合相、硅羟基键合相以及酰胺基键合相的亲水作用固相萃取板。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固相萃取板为含多元羧酸键合相的亲水作用固相萃取板。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中三氯乙酸-乙腈溶液组成为：质量百分比浓度0.5％-5％三氯乙酸，质量百分比浓度40％-60％乙腈，其余水。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中三氯乙酸-乙腈溶液组成为质量百分比浓度1％三氯乙酸，质量百分比浓度50％乙腈，其余水。
7.如权利要求1-6任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述PSTs为石房蛤毒素、新石房蛤毒素、脱氨甲酰基石房蛤毒素、漆沟藻毒素1～6、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素2、N-磺酰氨甲酰漆沟藻毒素3、脱氨甲酰基漆沟藻毒素2或脱氨甲酰基漆沟藻毒素3中的一种以上。
8.如权利要求1-6任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述TTX类物质包括河豚毒素、11-oxTTX、11-deoxyTTX、11-norTTX-6(R)-ol、11-norTTX-6(S)-ol、4-epiTTX、4,9-anhydroTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、5-deoxyTTX、5,11-dideoxyTTX或6,11-dideoxyTTX中的一种以上。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用沉淀板正压，取得过滤液。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用沉淀板正压，取得过滤液。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中三氯乙酸的乙腈溶液中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％-5％。
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| 冯兵等: "液相色谱-串联质谱法同时测定贝类产品中8种麻痹性贝类毒素", 中国渔业质量与标准, vol. 3, no. 2, 30 June 2013 (2013-06-30), pages 1 * |
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