CN115541893B - 糖化检测卡膜处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血糖监测设备技术领域，提供了糖化检测卡膜处理方法，包括如下步骤：步骤一、膜活化反应；步骤二、预处理反应；步骤三、膜处理一；步骤四、膜处理二，将经过膜处理一处理后的膜放入膜处理二反应液中；步骤五、干燥处理。本发明克服了现有技术的不足，设计合理，结构紧凑，本发明利用水处理的多孔PE膜为基础材料，经过膜活化反应，预处理反应、膜处理一、膜处理二和干燥，这五步物理化学反应将多孔PE膜功能化，将功能化的多孔PE膜组装成检测卡，可以实现糖化血红蛋白的快速测定，整个加工过程简单，无污染，同时加工效率高，反应彻底，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及血糖监测设备技术领域，具体涉及糖化检测卡膜处理方法。
背景技术
血糖监测是糖尿病日常诊治工作中非常重要的一个环节，良好的血糖控制能有效延缓糖尿病急、慢性并发症的发生和发展。
目前，临床和实验室使用的HbA1c（糖化血红蛋白）测定方法有很多种，大体可以基于原理分为两种类型：(1) 基于HbA1c和非糖化血红蛋白的电荷不同，主要方法有离子交换法和电泳法；(2) 基于HbA1c和非糖化血红蛋白的结构不同，这种结构不同主要来自于糖基化位点，主要方法有免疫法和亲和层析法。
液相色谱法是目前国际所公认的HbA1c测定方法，临床上也大量使用。这种方法虽然较为稳定、有参考价值且线性度好，但此法的缺点是设备昂贵，仪器巨大，且需要专业的操作人员操作，检测费时长，不利于广泛使用。
电泳法利用不同电荷的血红蛋白样本在检测卡（电泳凝胶）上迁移速度不同的原理测定HbA1c。由于电泳法操作复杂，得到结果时间长，现在该方法已很少应用于临床。免疫法基于抗体和抗原特异性结合的原理，其中，侧向免疫层析试纸，以荧光量子点/荧光微球/金纳米颗粒为信号载体，以检测线和质控线的信号为检测结果，适合有快速诊断需求的科室和家庭，但该方法线性范围小、易受血红蛋白变异体和HbA1c前体的干扰，应用受到巨大限制。
亲和层析法基于硼酸基团对多羟基类物质的吸附能力，亲和层析柱中的硼酸基团首先与HbA1c糖基化位点的顺位二醇结合，接着从柱子中流出的部分为非糖化的血红蛋白(用紫外-可见吸收光谱判断浓度)，再用Tris、甘露醇、山梨醇等多羟基类物质竞争并洗脱柱子上的HbA1c，最后从柱子中流出的部分为HbA1c。亲和层析柱法测定HbA1c在临床上也有所普及，亲和层析柱法不受诸多血红蛋白变异体的影响。HbA1c前体的存在对其所测定结果无明显影响，血样无需预处理去除HbA1c前体。
但目前亲和层析柱法的检测卡膜昂贵、操作复杂并且得到结果所需要的时间较长。
无论是离子交换法和亲和层析法都需要通过糖化检测卡来检测HbA1c，而且糖化检测卡通过其上的膜与HbA1c进行反应从而来实现检测，但是传统的糖化检测卡膜处理方法造价较高，工艺流程复杂，并且得到结果所需要的时间较长。
为此，我们结合离子交换法和亲和层析法两种方法学，提出糖化检测卡膜处理方法。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了糖化检测卡膜处理方法，克服了现有技术的不足，设计合理，结构紧凑，本发明利用水处理的多孔PE膜为基础材料，经过膜活化反应，预处理反应、膜处理一、膜处理二和干燥，这五步物理化学反应将多孔PE膜功能化，将功能化的多孔PE膜组装成检测卡，可以实现糖化血红蛋白的快速测定，整个加工过程简单，无污染，同时加工效率高，反应彻底，具有很强的实用性。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
糖化检测卡膜处理方法，包括如下步骤：
步骤一、膜活化反应
采用等离子活化处理；
准备一张多孔PE膜，将多孔PE膜固定于处理架上，运行低温等离子处理***，进行膜活化反应；
步骤二、预处理反应
步骤二（1）PEI反应
将经过膜活化反应后的膜放入盛PEI反应液的摇床中，反应3分钟，然后进行多次清洗干燥；
步骤二（2）聚丙烯酸反应
将步骤二（1）PEI反应后膜放入盛聚丙烯酸反应液的摇床中，反应8分钟，然后进行多次清洗，并通过95℃干燥25分钟；
步骤三、膜处理一
将步骤二预处理反应后的膜浸泡在膜处理一反应液中，并进行密封处理，同时在60℃加热反应2小时；
然后进行多次清洗，并通过95℃鼓风干燥25分钟；
步骤四、膜处理二
将经过膜处理一处理后的膜放入膜处理二反应液中，同时启动摇床，摇床速度为150r/min，反应10 min；
然后将上述膜放入 MES缓冲液，进行多次清洗；
步骤五、干燥处理
将步骤四处理后的膜进行干燥处理，干燥时间不少于12 h。
进一步的，所述步骤一中等离子处理条件为：本底气压20Pa、氧气流量100sccm、放电功率500W、放电时间300s。
进一步的，在所述步骤一中需要对多孔PE膜进行爬水测试，具体的操作流程如下：在步骤一处理前，先在多孔PE膜上标记出一定面积的小条，在小条两端相应位置分别划线标记，在经过步骤一处理后，将已标记好的小条沿标记线剪下，再将小条的两端标记端放入纯化水中，记录纯化水自膜下端渗透至标记高度的时间。
进一步的，所述步骤二（1）中PEI反应液包括如下组分：
35-50份 PEI原液、3800-4200份纯化水和3000-3200份乙醇。
进一步的，所述步骤二（2）中聚丙烯酸反应液包括如下组分：
15-25份聚丙烯酸原液、6500-7000份纯化水和900-920份乙醇。
进一步的，所述步骤三中膜处理一反应液包括如下组分：
25-30份邻苯二甲酸酐、0.5-1份三乙醇胺盐酸盐和800-850份 DMSO；
且膜处理一反应液的制备过程包括：将DMSO加入到邻苯二甲酸酐和三乙醇胺盐酸盐的固体混合物中，并用保鲜膜将容器封口，磁力搅拌器搅拌使固体完全溶解。
进一步的，所述步骤四、膜处理二中还包括裁切：
将经过膜处理一反应后的膜按设定好的尺寸切为若干条等宽的膜条，多个膜条依次有序地放入膜处理二反应液中，在反应过程中，需要持续观察，且需要不时拨动膜条。
进一步的，所述步骤四中膜处理二反应液包括如下组分：
1-1.5份间氨基苯硼酸、8-10份甲醇、4600-4900份MES缓冲液；
且膜处理二反应液的制备过程包括：称取1-1.5份间氨基苯硼酸于研钵中，加入8-10份甲醇，研磨溶解，然后称取MES缓冲液4600-4900份，用MES缓冲液稀释间氨基苯硼酸的甲醇溶液，并倒入膜处理二反应液配制专用瓶中。
进一步的，所述步骤四中在进行膜处理二反应前需要在膜处理二反应液中添加1.2-1.5份的EDC，快速混匀，同时确保EDC加入膜处理二反应液后3分钟内开始膜处理二反应。
进一步的，所述MES缓冲液包括如下组分：
200-220份MES、9800-10000份纯化水、1000-1500份氢氧化钠溶液，且MES缓冲液的pH值控制在6.3-6.7之间。
（三）有益效果
本发明实施例提供了糖化检测卡膜处理方法。具备以下有益效果：
1.本发明利用水处理的多孔PE膜为基础材料，经过膜活化反应，预处理反应、膜处理一、膜处理二和干燥，这五步物理化学反应将多孔PE膜功能化，将功能化的多孔PE膜组装成检测卡，可以实现糖化血红蛋白的快速测定，整个加工过程简单。
2.通过采用PEI反应，将PEI均匀溶解到溶液中，利用PEI固有的性质与活化后的膜反应，使PE膜改性，使PE具有化学活性。
3.采用聚丙烯酸反应，因已经接枝的PEI的PE膜亲水性不够，所以用聚丙烯酸与PEI上的氨基反应（酰胺缩合反应），使其PE膜上接枝了聚丙烯酸，引入了大量的羧基，PE膜有了非常好的亲水性，同时羧基的大量引入是实际使用需求（1.增加亲水性，2.在实际使用过程中发挥结合血红蛋白的作用）。
4.通过对原膜进行爬水测试，具体的操作流程如下：在步骤一处理前，先在原膜上标记出一定面积的小条，在小条两端相应位置分别划线标记，在经过步骤一处理后，将已标记好的小条沿标记线剪下，再将小条的两端标记端放入纯化水中，记录纯化水自膜下端渗透至标记高度的时间。
5.通过将经过膜处理一反应后的膜按设定好的尺寸切为若干条等宽的膜条，多个膜条依次有序地放入膜处理二反应液中，且在反应过程中，需要持续观察，且需要不时拨动膜条，能够提高反应的效率，同时也不会造成浪费，减少污染，更加环保。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
糖化检测卡膜处理方法，包括如下步骤：
步骤一、膜活化反应
爬水样品标记
抽样一张多孔PE膜，用铅笔和刻度尺沿边沿标记小条，并在小条两端1cm和0.5cm处分别划线。
等离子活化处理
检查等离子处理条件，等离子处理条件为：气压20Pa、氧气流量100sccm、放电功率500W、放电时间300s。
运行低温等离子处理***，进行膜活化反应，通过等离子处理，采用物理和化学的方法，将惰性的PE膜活化，使其有反应位点，能开始参与接枝反应。
爬水测试
将已标记好的小条沿标记线剪下，再将小条的标记端放入纯化水中，记录纯化水自膜下端渗透至标记高度的时间。
步骤二、预处理反应
步骤二（1）PEI反应
将膜放入盛PEI反应液的摇床中，反应3分钟，然后用超声仪清洗两次，每次3分钟，用滤纸将膜上的水吸干，采用PEI反应，将PEI均匀溶解到溶液中，利用PEI固有的性质与活化后的膜反应，使PE膜改性，使PE具有化学活性。
步骤二（2）PEI溶液配制
称取40.0 份 PEI原液、4000 份纯化水和3156 份乙醇，用纯化水和乙醇溶解稀释称取的PEI原液，磁力搅拌充分混匀，待用。
聚丙烯酸反应
将膜放入盛聚丙烯酸反应液的摇床中，反应8分钟，然后用超声仪清洗两次，每次3分钟，95℃干燥25分钟，干燥间冷却，而采用聚丙烯酸反应，因已经接枝的PEI的PE膜亲水性不够，所以用聚丙烯酸与PEI上的氨基反应（酰胺缩合反应），使其PE膜上接枝了聚丙烯酸，引入了大量的羧基，PE膜有了非常好的亲水性，同时羧基的大量引入是实际使用需求（1.增加亲水性，2.在实际使用过程中发挥结合血红蛋白的作用）。
聚丙烯酸溶液配制称取20.0 份 聚丙烯酸原液和6800 份纯化水和915 份 乙醇，用纯化水和乙醇溶解稀释称取的聚丙烯酸原液，磁力搅拌充分混匀，待用。
步骤三、膜处理一
将膜处理一反应液倒入长方形玻璃盆中，再将膜层层叠放浸泡在反应液中，用保鲜膜密封反应容器，60℃加热反应2小时。
用少量水摇晃清洗5-10分钟，然后用超声仪清洗两次，95℃鼓风干燥25分钟，干燥间冷却。
经等离子处理、PEI和丙烯酸反应的膜，虽然亲水性很好，但膜上接枝的羧基（-COOH）数量严重不足，采用膜处理一的工艺，用二酸酐与膜上的氨基（主要为仲氨基，即-NH-）反应，将氨基封闭的同时引入更多的羧基，从而提高弱酸性条件下膜结合血红蛋白的能力（离子交换法），达到功能化的效果。
膜处理一反应液配制
称取30.0 份 邻苯二甲酸酐、0.75 份 三乙醇胺盐酸盐和825 份 DMSO，将DMSO加入到固体混合物中，用保鲜膜将容器封口，磁力搅拌器搅拌使固体完全溶解（如果没完全溶解也可超声或加热加速溶解）。
步骤四、膜处理二
将经过膜处理一处理后的膜放入膜处理二反应液中，同时启动摇床，摇床速度为150r/min，反应10 min；
因膜处理一是过量反应，所以完成膜处理一的膜表面基本全部是羧基。糖化血红蛋白在碱性条件下能与硼酸基团配位结合（亲和层析法），所以膜上要接枝部分硼酸基团，故用带氨基的硼酸试剂与膜上的羧基发生酰胺缩合反应，均匀地接枝硼酸基，使硼酸基和羧基的数量达到适宜的比例，达到功能化的效果。
然后将上述膜放入 MES缓冲液，进行多次清洗；
在进行膜处理二反应之前使用裁条装置，按设定好的尺寸将膜处理一完毕的膜切为24条等宽的膜条，能够提高提高膜与膜处理二反应液的接触面积，提高反应效率，同时也能减少反应液的用量，更加环保。
在完成膜处理二反应后，依次有序排空上述反应液，并立即依次有序地在每个反应器中加入600mL MES缓冲液，从第一个反应器倒入缓冲液开始倒计时5 min，进行第一次清洗。
第一次清洗5min完成后，依次有序排空上述反应液，并立即依次有序地在每个反应器中加入600mL MES缓冲液，从第一个反应器倒入缓冲液开始倒计时15 min，进行第二次清洗。
第二次清洗15min完成后，关闭摇床，回收上述清洗缓冲液作为下一批膜的第一次清洗液。
取出膜条，排列在单层滤纸中（或者滤垫上），避免膜条重叠放置。
MES缓冲液配制
称取213.3 份 MES和9850 份 纯化水，将称取好的MES和纯化水转移至玻璃瓶中，磁力搅拌器搅拌，pH计测量pH值，用氢氧化钠溶液将缓冲液pH值调至6.50。用微孔滤膜过滤后，保存备用。
膜处理二反应液配制
称取1.484 份间氨基苯硼酸于研钵中，加入8.5 份 甲醇，研磨溶解。称取MES缓冲液4800 份，用适量MES缓冲液稀释间氨基苯硼酸的甲醇溶液，并倒入膜处理二反应液配制专用瓶中。用适量MES缓冲液涮洗研钵内壁三次，将涮洗液均倒入膜处理二溶液配制专用瓶中，保证研钵中无间氨基苯硼酸残留。将剩余的MES缓冲液倒入膜处理二溶液配制专用瓶中，充分混匀。
步骤五、干燥处理
将膜条放于干燥间干燥，干燥时间不少于12 h。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.糖化检测卡膜处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、膜活化反应；
采用等离子活化处理；
准备一张多孔PE膜，将多孔PE膜固定于处理架上，运行低温等离子处理***，进行膜活化反应；
步骤二、预处理反应；
步骤二（1）PEI反应；
将经过膜活化反应后的膜放入盛PEI反应液的摇床中，反应3-5分钟，然后进行多次清洗干燥；
步骤二（2）聚丙烯酸反应；
将步骤二（1）PEI反应后膜放入盛聚丙烯酸反应液的摇床中，反应8-10分钟，然后进行多次清洗，并通过95℃干燥20-30分钟；
步骤三、膜处理一；
将步骤二预处理反应后的膜浸泡在膜处理一反应液中，并进行密封处理，同时在50-70℃加热反应2-3小时；
然后进行多次清洗，并通过9 0-100℃鼓风干燥20-30分钟；
步骤四、膜处理二；
将经过膜处理一处理后的膜放入膜处理二反应液中，同时启动摇床，摇床速度为140-160r/min，反应8-10min；
然后将上述膜放入 MES缓冲液，进行多次清洗；
步骤五、干燥处理；
将步骤四处理后的膜进行干燥处理，干燥时间不少于12 h；
所述步骤一中等离子处理条件为：本底气压15-25Pa、氧气流量80-120sccm、放电功率450-500W、放电时间300-360s；
所述步骤二（1）中PEI反应液包括如下组分：
35-50份 PEI原液、3800-4200份纯化水和3000-3200份乙醇；
所述步骤二（2）中聚丙烯酸反应液包括如下组分：
15-25份聚丙烯酸原液、6500-7000份纯化水和900-920份乙醇；
所述步骤三中膜处理一反应液包括如下组分：
25-30份邻苯二甲酸酐、0.5-1份三乙醇胺盐酸盐和800-850份 DMSO；
且膜处理一反应液的制备过程包括：将800-850份DMSO加入到25-30份邻苯二甲酸酐和0.5-1份三乙醇胺盐酸盐的固体混合物中，并用保鲜膜将容器封口，磁力搅拌器搅拌使固体完全溶解；
所述步骤四中膜处理二反应液包括如下组分：
1-1.5份间氨基苯硼酸、8-10份甲醇、4600-4900份MES缓冲液；
且膜处理二反应液的制备过程包括：称取1-1.5份间氨基苯硼酸于研钵中，加入8-10份甲醇，研磨溶解，然后称取MES缓冲液4600-4900份，用MES缓冲液稀释间氨基苯硼酸的甲醇溶液，并倒入膜处理二反应液配制专用瓶中。
2.如权利要求1所述的糖化检测卡膜处理方法，其特征在于：在所述步骤一中需要对多孔PE膜进行爬水测试，具体的操作流程如下：在步骤一处理前，先在多孔PE膜上标记出一定面积的小条，在小条两端相应位置分别划线标记，在经过步骤一处理后，将已标记好的小条沿标记线剪下，再将小条的两端标记端放入纯化水中，记录纯化水自膜下端渗透至标记高度的时间。
3.如权利要求1所述的糖化检测卡膜处理方法，其特征在于：所述步骤四、膜处理二中还包括裁切：
将经过膜处理一反应后的膜按设定好的尺寸切为若干条等宽的膜条，多个膜条依次有序地放入膜处理二反应液中，在反应过程中，需要持续观察，且需要不时拨动膜条。
4.如权利要求1所述的糖化检测卡膜处理方法，其特征在于：所述步骤四中在进行膜处理二反应前需要在膜处理二反应液中添加1.2-1.5份的EDC，快速混匀，同时确保EDC加入膜处理二反应液后3分钟内开始膜处理二反应。
5.如权利要求1所述的糖化检测卡膜处理方法，其特征在于：所述MES缓冲液包括如下组分：
200-220份MES、9800-10000份纯化水、1000-1500份氢氧化钠溶液，且MES缓冲液的pH值控制在6.3-6.7之间。
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