CN117106912B

CN117106912B - 一种与结直肠癌高危人群识别和早期筛查相关的增强子rna功能性位点及其应用

Info

Publication number: CN117106912B
Application number: CN202311053501.1A
Authority: CN
Inventors: 田剑波; 缪小平; 蔡祎旻; 鲁泽群; 金梦
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2023-08-21
Filing date: 2023-08-21
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-08-21
Also published as: CN117106912A

Abstract

本发明涉及一种与结直肠癌高危人群识别和早期筛查相关的增强子RNA功能性位点及其应用，基于前期大规模人群数据以及生物功能学实验，我们发现rs3094296位点与中国人群的结直肠癌易感性相关，其作用机制为rs3094296位点通过转录eRNA SENP7e来促进靶基因SENP7的表达，最终抑制癌细胞的增殖。通过对rs3094296位点进行精确地引物和探针设计，能够依靠荧光定量PCR，即可对正常人群进行rs3094296位点的检测，从而鉴别结直肠癌的高危人群。本技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，对于结直肠癌患者的早期筛查及诊断提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行早期干预。

Description

一种与结直肠癌高危人群识别和早期筛查相关的增强子RNA 功能性位点及其应用

技术领域

本发明涉及于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种与结直肠癌高危人群识别和早期筛查相关的增强子RNA功能性位点及其应用。

背景技术

结直肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁我国人民的健康，其发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中分别位列第三位和第二位。随着人口老龄化的加剧以及居民生活方式和饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率和死亡率呈现逐年上升趋势，成为我国亟待解决的重大公共卫生问题。目前，针对结直肠癌最有效的筛查方法是粪便隐血检查(FIT)结合结肠镜检查。但是，这些方法存在检出率不高以及患者接受度不高等弊端。因此，需要更加便捷精准的方法对结直肠癌的高危个体开展筛查和早期诊断，提高患者的接受度更高，从而为国家节省大量的医疗支出。

近年来，以分子遗传学为基础的个体化筛查方案，成为结直肠癌高危人群筛查的重点。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为一类最常见的遗传变异，能够反映个体的遗传背景差异，已被证实与肿瘤的发生风险相关。迄今为止，全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study，GWAS)已经鉴别出了一系列与中国人群结直肠癌易感性密切相关的遗传变异位点。然而，鉴定出的大部分结直肠癌相关位点位于基因组的非编码区域，揭示这些统计学关联背后真正起作用的功能性遗传变异及其潜在的生物学机制仍然十分困难，为此，研究人员利用一种基于数量性状位点(Quantitative TraitLoci，QTL)的分析方法***挖掘真正的功能SNP。非编码区域包含着许多顺式调控元件，其中增强子在基因表达调控中起着至关重要的作用。随着高通量测序技术的快速发展，活性增强子被发现可以转录出一种非编码RNA，称为增强子RNA(enhancer RNA，eRNA)，它们能够激活增强子活性、促进增强子-启动子环的形成,从而激活下游基因的表达，人类的许多癌症和疾病都与eRNA的异常表达有关。此外，研究报道位于增强子上的遗传变异通过影响eRNA的产生，从而进一步影响疾病的发生。因此，在全基因组范围内***鉴定影响eRNA表达的遗传变异(enhancer RNA quantitative trait locus,eRNAQTL)，是解析易感位点生物学功能的一个重要的切入点，同时鉴定出的SNP标记可以应用于中国人群结直肠癌高危个体的识别、早期筛查和辅助诊断。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种与结直肠癌高危人群识别和早期筛查相关的增强子RNA功能性位点及其应用。

具体为增强子RNA功能性位点rs3094296的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用。

检测试剂包括增强子RNA功能性位点rs3094296的特异性扩增引物和特异性探针，所述特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

本发明的有益效果为：本发明从分子生物学及基因诊断水平上，提供了筛选结直肠癌高危人群的技术方法。通过结合结直肠癌eRNAQTLs遗传图谱和大规模人群验证显示，rs3094296位点与中国人群的结直肠癌易感性相关。通过针对rs3094296位点进行巧妙的引物和探针设计，能够依靠荧光定量PCR，即可对正常人群进行rs3094296变异的检测，从而鉴别结直肠癌的高危人群，辅助结直肠癌患者的早期筛查及诊断。该技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估结直肠癌的患病风险提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行结直肠癌筛查和早期干预。

附图说明

图1为eRNAQTLs图谱筛选结直肠癌易感位点rs3094296的流程图；

图2为eRNAQTL rs3094296的人群结果和潜在调控的目标eRNA示意图；

图3为基于SNP位点rs3094296的结直肠癌风险预测模型AUC曲线示意图；

图4为rs3094296双荧光素酶报告基因实验结果示意图；

图5为转录因子HOXA5等位基因特异性结合于rs3094296上下游示意图；

图6为rs3094296基因型对靶基因SENP7表达水平的调控示意图；

图7为SENP7e和SENP7影响结直肠癌细胞系增殖能力的示意图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

结合中国人群结直肠癌功能性eRNAQTLs和多中心病例对照研究，鉴定出一种与结直肠癌早期筛查和辅助诊断相关的增强子RNA功能位点标志物，该标志物为rs3094296。

所述rs3094296的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

所述rs3094296的特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

上述与结直肠癌易感性相关的增强子RNA功能位点标志物的检测试剂在制备结直肠癌早期筛查和辅助诊断试剂盒中的应用。

一种结直肠癌早期筛查和辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs3094296。

所述结直肠癌早期筛查和辅助诊断试剂盒包括功能位点标志物rs3094296的特异性扩增引物和特异性探针。

本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的受试者血液样本，***收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择结直肠癌病例和健康对照，在eRNAQTL显著的位点中找到与中国人群结直肠癌发病相关的功能位点标志物，(3)对筛选出的阳性关联功能位点标记，在独立的样本中进行验证，以判断其关联的稳定性。(4)结直肠癌辅助诊断试剂盒的研制：根据结直肠癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传功能位点标记开发早期筛查及辅助诊断试剂盒。

具体来说本发明的研究的实验方法主要包括以下内容：

首先，我们从华中科技大学附属同济医院收集由结直肠癌外科手术切除的10对新鲜结直肠癌及其癌旁正常组织样本，分别进行ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq实验。通过整合ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq数据，注释出一批活性的增强子元件，进一步去除与蛋白编码基因重叠的区域后得到eRNA的区域。随后，我们利用154例中国结直肠癌样本在eRNA区域的转录组数据及其相应样本的基因型数据，在全基因组范围内***识别和鉴定结直肠癌的功能性eRNAQTLs，用于结直肠癌高风险人群的识别。接下来，通过两阶段、多中心病例-对照研究识别影响结直肠癌风险的eRNAQTLs，并通过一系列分子生物学实验，探究eRNAQTL影响结直肠癌发生的生物学机制。

人群验证包含两阶段病例-对照研究，其中发现阶段的结直肠癌病例-对照样本招募于北京(中国医学科学院)及武汉多家医院(同济医院、武汉大学人民医院和武汉大学中南医院)，共收集到4,293例结直肠癌患者和7,176例健康对照的血液样本。基本人口学特征如表1所示。采用非条件Logi st i c回归模型，在校正年龄、性别、吸烟饮酒混杂因素后，我们计算了在加性模型下eRNAQTLs与结直肠癌易感性的关联，并由此绘制曼哈顿图，结果如图2中a图所示。我们以P值＜0.05作为显著性阈值，共鉴定出2,901个与结直肠癌风险相关的eRNAQTLs，其中3q12.3区域人群最显著。在该区域我们发现，rs3094296功能位点在结直肠癌组织中与目标eRNA ENSR00000155786的表达显著相关，结果如图2中b图所示。病例对照研究结果表明，携带rs3094296风险基因型的个体，在中国人群样本中，结直肠癌的患病风险分别较正常人降低9％(OR＝0.88，95％CI:0.83-0.94，P＝2.69×10^-5)，结果见表2。

表1.发现阶段中国人群病例对照研究样本的基本资料

采用双侧独立t检验计算；*采用双侧χ²检验计算

表2.中国人群样本rs3094296结直肠癌风险关联分析结果

验证阶段我们从北京武汉两地区共募集到的具有完整病历资料的6,024例结直肠癌患者和10,022例无肿瘤病史的正常对照的中国人群，并对这些人进行了基因分型。结直肠癌患者和正常对照均为汉族。患者经组织病理学确诊，无年龄限制；正常对照无肿瘤病史，经体检无肿瘤体征。同时收集了研究对象的性别、年龄等信息。每个研究对象均知情同意参加本研究并捐献2ml外周静脉血，用于分离制备淋巴细胞基因组DNA。基本人口学特征如表3所示。

表3.验证阶段中国人群病例对照研究样本的基本资料

^*采用双侧χ²检验比较；采用双侧独立样本t检验比较。

我们将两地募集到的人群样本用于人群验证，通过采用非条件logistic回归模型并校正性别、年龄、吸烟和饮酒情况后，对两个阶段人群样本分别计算SNP位点rs3094296与结直肠癌易感性的关联。中国人群两阶段病例对照分析结果显示，携带rs3094296[T]风险基因型的个体，结直肠癌的患病风险分别降低16％和6％(OR＝0.84，95％CI:0.75-0.92，P＝3.74×10^-4；OR＝0.94，95％CI:0.90-0.99，P＝1.76×10^-2)。为加强病例对照研究的检验效能，合并两阶段的样本，检验rs3094296与结直肠癌易感性的关联。发现中国人群病例对照研究结果与发现阶段样本的结果一致，携带rs3094296[T]风险基因型的个体罹患结直肠癌的风险降低9％(OR＝0.93，95％CI:0.89-0.97，P＝4.97×10^-4)，详细结果见表4。

表4.中国人群样本rs3094296结直肠癌风险关联分析结果

*采用Logistic回归模型计算，校正性别、年龄、吸烟和饮酒情况。

前期多阶段人群关联分析验证该位点是结直肠癌风险位点，因此我们进一步用这个SNP位点建立了结直肠癌的风险预测模型。中国人群来自发现阶段GWAS研究(4,293例病例和7,176例对照)，欧洲人群来自GECCO项目(17,789例病例和19,951例对照)。我们构建了一个公式，综合考虑SNP的三种基因型和性别、年龄、吸烟及饮酒情况。其中，对于SNP基因分型，野生纯合型＝“1”，杂合型＝“2”，突变纯合型＝“3”；对于性别，男性为“1”，女性为“0”；对于年龄，大于或等于60岁为“1”,小于60岁为“0”。分析时以多因素logistic回归系数β为权重，得到基于rs3094296分型危险评分的公式如下：

中国人群危险评分＝(-0.0692×性别的评分)+(0.0023×年龄的评分)+(0.1203×吸烟评分)+(-0.0139×饮酒评分)+(-0.1244×rs3094296分型的评分)。

欧洲人群危险评分＝(-0.1891×性别的评分)+(0.0296×年龄的评分)+(-0.0654×rs3094296分型的评分)

通过绘制AUC曲线，可得该模型曲线下面积在欧洲人群和中国人群分别为0.532和0.571，具体见图3。

为在功能上解析rs3094296功能位点的结直肠癌风险关联，我们运用eRNAQTL分析发现该致病位点不同等位基因型与目标eRNA ENSR00000155786的表达显著相关。随后利用报告基因实验在两种结直肠癌细胞系HCT116和SW480中证实，转染rs3094296[T]等位基因重组质粒的报告基因活性均显著高于pGL3-Promoter空载组，表明目的位点所在DNA片段具有增强子活性。相较于rs3094296[T]基因型组，rs3094296[C]基因型组的报告基因活性显著下降。以上实验结果表明rs3094296[T]所在区域具有增强子活性，且该位点rs3094296[T]的增强子的转录激活效应比rs3094296[C]更强，结果如图4所示。机制上，我们发现rs3094296[T]等位基因与转录因子HOXA5的结合能力更强，使得的rs3094296[T]的增强子活性更强，从而促进ENSR00000155786的表达，具体见图5。

鉴于确定eRNA ENSR00000155786调控的下游靶基因有助于明确其在结直肠癌发生发展中的作用，我们结合了共表达和eQTL分析。结果发现rs3094296在结直肠癌组织中与SENP7的表达显著关联，如图6所示，因此我们确定SENP7为该eRNA的靶基因，并将ENSR00000155786命名为SENP7e。接下来，我们采用细胞增殖实验CCK-8和克隆形成实验检测SENP7e和SENP7对结直肠癌细胞生长的影响。实验结果显示，分别敲降SENP7e和SENP7均可使结直肠癌细胞增殖和克隆形成能力增强，并且同时敲降这两个基因会使细胞生长变化更加显著，如图7所示。以上细胞表型实验表明，SENP7e和SENP7在结直肠癌中发挥抑癌作用，且可发挥一定的协同效应抑制结直肠癌细胞的生长。

结合以上生物信息学分析、大规模人群数据和生物学功能实验，结果显示相比携带rs3094296[C]等位基因的个体，携带rs3094296[T]等位基因的个体具有更低的结直肠癌患病风险，其作用机制通过影响rs3094296与转录因子HOXA5的结合能力，从而具有更强的增强子活性导致该区域eRNA SENP7e表达增加，进一步促进下游靶基因SENP7的表达，最终抑制结直肠癌细胞的生长。因此，对人群进行rs3094296变异的检测，有助于鉴别结直肠癌的高危人群，从而辅助结直肠癌患者的早期干预。

实验方法：

1.外周血DNA提取：

我们用常规酚-氯仿法提取DNA，具体步骤如下：

1)取约3mL抗凝血，室温下5,000×g离心15min，弃去上层，留约0.3mL血细胞。加入0.5mL新鲜配制的终浓度为20μg/mL RNA酶的抽提缓冲液，混匀后37℃孵育1h。

2)加入终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，混匀后37℃孵育过夜。

3)每管加入Tris缓冲液平衡的酚(pH＝7.0)0.7mL，充分混匀，室温下8,000×g离心15min。

4)将上层液体转移到另一1.5mL离心管中，加入等体积酚–氯仿(1:1)0.7mL，充分混匀15min；室温8,000×g离心15min。

5)将上层液体转移到另一干净1.5mL离心管中，加入10％体积的10M乙酸铵溶液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，–20℃静置2h以沉淀DNA。

6)沉淀出的DNA用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体；再用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体。

7)将管倒立在吸水纸上，待乙醇挥发干净后，每管加适当TE缓冲液，4℃放置一周后保存于–20℃备用。

2.基因分型

采用的分型平台为TaqMan基因分型技术(ABI 7900HT Real Time PCR system,Applied Biosystems)，5μL PCR反应体系如表5所示：

表5.TaqMan基因分型PCR反应体系

反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃15sec和60℃1min共45个循环，降温到4℃。

反应所用的引物和探针如下：

rs3094296引物：

正向引物：ACCCATCTCTCACATCCAGATT(SEQ ID NO：1)

反向引物：GTGAGGGTATCTTAGTCTTTGTCTTTC(SEQ ID NO：2)

rs3094296探针：

正向探针：FAM-CTTAGTAATCTAACTGCATTCC-MGB(SEQ ID NO：3)

反向探针：VI C-TTAGTAATTTAACTGCATTCCT-MGB(SEQ ID NO：4)

3.双荧光素酶报告基因实验

1)报告基因质粒载体

本研究选择pGL3-Promoter载体构建报告基因质粒，以验证目的位点所在区域是否具有增强子活性。pGL3-Promoter载体包含一个萤火虫荧光素酶基因及其上游SV40启动子，可在多种细胞系中高效表达萤火虫荧光素酶。将目的片段***SV40启动子的上游或下游，可检测该区域是否具有转录调控效应。此外，我们选择了pRL-SV40载体作为内参对照。pRL-SV40载体包含一个海肾荧光素酶基因和早期增强子与启动子元件，可在多种细胞系中高效表达海肾荧光素酶。本研究将pRL-SV40与pGL3-Promoter质粒共同转染细胞，使萤火虫荧光素酶活性归一化，以消除实验中固有的变化，提高结果的准确度。

针对rs3094296的报告基因质粒，我们从NCBI下载了以该位点为中心、上下游各500bp的DNA序列，常规合成含该位点不同等位基因的DNA片段，将目的序列正向(5'端添加MluI酶切位点，3'端添加XhoI酶切位点)克隆至pGL3-Promoter载体中，由此构建了2种重组报告基因质粒，如图4所示。质粒委托于擎科生物科技公司(武汉)构建，以穿刺菌形式制备，并通过DNA测序及限制性内切酶酶切验证片段准确性。

2)质粒扩增及提取

①提前配制液体培养基：取5g LB培养基粉末与200ml去离子水充分震荡溶解，高压灭菌，冷却后用封口膜封口，于4℃冰箱保存；

②向50ml离心管加入15ml LB液体培养基和30μl氨苄青霉素，轻柔震荡混匀；

③用无菌枪头轻挑选穿刺菌，打入离心管中；

④将离心管固定于恒温摇床，设置温度37℃，转速220rpm，振荡12～16h(以14h为宜)，肉眼可见液体浑浊时收取菌液；

⑤收取质粒扩增后的新鲜菌液，室温下5 000g离心15min，弃尽上清；

⑥使用Omega公司的无内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，采用NanoDrop 1000检测质粒浓度和纯度，将合格的质粒分装后放入-20℃冰箱保存。

3)报告基因质粒瞬时转染

①转染前一天将细胞铺至96孔培养板，恒温培养箱中培养16～24h，待细胞生长达70％～90％融合度时进行转染；

②转染前30min更换新鲜培养基，并放回恒温培养箱孵育，期间配制转染体系；

③每孔的转染试剂配制比例如下：

a.取1.5ml EP管配制A液：分别加入5μl Opti-MEM、0.3μl Lipofectamine 3000试剂，轻柔吹打混匀；

b.另取1.5ml EP管配制B液：分别加入5μl Opti-MEM、2ng pRL-SV40内参质粒、200ng rs4810856报告基因质粒、0.2μl P3000试剂，轻柔吹打混匀；

④将A液与B液充分混匀，室温下静置5～10min，获得DNA-脂质体复合物；

⑤按每孔10μl加入配制好的复合物，轻摇混匀后放回恒温培养箱中继续培养。

4)双荧光素酶报告基因活性检测

本研究使用Promega的双荧光素酶报告基因检测***检测荧光素酶活性。按说明配制LAR II起始液和Stop&Glo终止液，分装后放入-80℃冰箱保存。具体步骤如下：

①报告基因质粒转染24～36h后收获细胞，加入PBS清洗2次，弃尽残留的PBS；

②用超纯水稀释PLB裂解液(5×)至工作浓度(1×)，按每孔30μl加入96孔培养板中，轻摇混匀；

③将培养板封口后，放入-80℃冰箱过夜(8h以上)，使细胞充***解；

④测荧光前从-80℃冰箱取出细胞板以及所需量的荧光试剂，室温下静置融化；

⑤取1.5ml无色透明EP管，分别加入20μl起始液与5μl细胞裂解液，轻柔吹打混匀，注意避免产生气泡，立即放入仪器中检测萤火虫荧光素酶活性；

⑥加入20μl终止液，轻柔吹打混匀后立即检测海肾萤光素酶活性；计算：归一化荧光素酶活性＝萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性，相对荧光素酶活性＝实验组归一化萤光素酶活性/对照组归一化萤光素酶活性均值。

4.细胞增殖实验

1)细胞计数

在进行CCK-8增殖实验和克隆形成实验前，需要进行细胞计数，保证不同组别孔板中接种数量合适的细胞。本实验使用血球计数板进行细胞计数，该计数板由两个大小相同的计数池组成，每个计数池又由九个1mm×1mm方格组成，每个方格可容纳0.1mm³液体体积。具体计数步骤如下：

①将已培养一段时间后的细胞孔板进行消化，获得细胞悬液，尽量充分混匀打散细胞。

②对计数板进行消毒后盖上盖玻片。

③吸取10μL细胞悬液，沿玻片边缘缓慢滴入计数板中，保证盖玻片和计数板中间无气泡产生)。

④放置1min，于显微镜下观察计数板，并按如下原则对四角的方格进行计数：a.对于压住方格边线的细胞，只对上边和左边的细胞进行计数，b.若细胞成团块状，则计为一个细胞。

⑤细胞悬液浓度＝四角方格内细胞总数/4×10⁴个/mL。

2)CCK-8细胞增殖实验

本研究采用CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)检测结直肠癌细胞增殖能力。

①吸取细胞悬液100μL并按计数浓度稀释至细胞量为2,000左右，接种于96孔板中。

②在24h、48h、72h和96h四个时间点进行细胞活性检测。向每个孔内加入10μLCCK-8试剂，上下左右摇晃以轻柔混匀，放回细胞培养箱继续培养1.5h。

③使用酶标仪进行吸光度测定，波长设定为450nm，根据四个时间点的吸光度值绘制不同实验组别的细胞增殖曲线以比较其差异。

3)克隆形成实验

①在转染细胞36h后，进行细胞计数并稀释至合适浓度。在6孔板的每孔中加入2mL细胞悬液使得细胞量为1,000左右，继续培养2周左右。

②期间每2～3天观察细胞形态并更换新鲜培养基。若显微镜下观察到细胞克隆时，可进行固定染色。

③从培养箱中取出6孔板，吸去废液并缓慢加入PBS清洗2次。吸净每孔PBS后加入2mL甲醇溶液，于室温放置30min。

④吸去甲醇后加入0.25％结晶紫溶液，避光放置30min进行染色。

⑤染色完成后，吸去孔中废液，并用双蒸水清洗孔板直至视野清晰，进行拍照保存。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.增强子RNA功能性位点rs3094296的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，检测试剂包括增强子RNA功能性位点rs3094296的特异性扩增引物和特异性探针，所述特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，特异性探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。