CN115537341A

CN115537341A - 一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用

Info

Publication number: CN115537341A
Application number: CN202211110334.5A
Authority: CN
Inventors: 赵钟祥; 卢淇平; 崔辉; 幸丹霞
Original assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2022-12-30

Abstract

本发明公开了一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。本发明所述利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法中所用微生物为救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY‑33菌株，该菌株可将铁冬青酸转化为其衍生物M，而所得衍生物M具有较大的安全系数，在降脂活性筛选中显示具有比原药铁冬青酸更好的降脂活性，因此，可用于制备降脂药物。另本发明所述利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法的反应条件温和、转化效率高，转化过程中所选用培养基的价格低廉、原料来源充足，转化反应具有较高的专一性，分离纯化步骤简单、产物纯度高、易于量化生产。

Description

一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。

背景技术

铁冬青酸(Rotundic acid)是一种从冬青属铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)中分离得到的乌苏烷型三萜皂苷，其具有较好的抗肿瘤、降血脂、抗血栓和抗炎活性，但是较差的溶解性和生物利用度在一定程度上限制了其临床应用。因此，有必要对其进行适当的结构修饰，以期改善其溶解性和生物利用度，扩大其临床应用。

目前，对铁冬青酸进行结构修饰的方法包括化学方法和微生物转化修饰两种。采用化学方法制备所得铁冬青酸类衍生物的溶解性、生物利用度和抗肿瘤活性虽较铁冬青酸有显著的提高(赫玉芳.救必应酸的制备及其衍生物的设计、合成和抗肿瘤活性研究[D].吉林大学,2013)，但化学方法制备铁冬青酸类衍生物的反应过程复杂、条件要求高、所用试剂毒性大、副产物较多、产率较低，在实际应用中有很大的局限性。

微生物转化是指利用微生物代谢过程中所产生的一系列酶对外源性的底物进行选择性结构修饰的过程，具有较好的立体性和区域选择性，能够对非活性碳原子进行结构修饰，或能较大程度地改善底物溶解性、生物利用度和活性等。同时，微生物转化的反应条件温和、成本低，产物的分离纯化相对简单，这些优点均是化学方法所不具备的。目前已有关于对真菌转化培养获得的代谢产物活性的研究，不仅可用于揭示药物进入体内发挥作用的物质基础，亦有助于发现更好药理活性及生物利用度的衍生物。因此，挖掘开发可对铁冬青酸进行结构修饰以提高其活性的微生物，对提高铁冬青酸药理活性，扩大铁冬青酸的临床应用范围具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法及其在制备降脂药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33。

本发明的第二个目的是提供一种铁冬青酸衍生物M。

本发明的第三个目的是提供一种制备铁冬青酸衍生物M的方法。

本发明的第四个目的是提供所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33在制备铁冬青酸衍生物M中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述铁冬青酸衍生物M在制备降脂药物中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种降脂药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明利用组织块分离法，从中药救必应的新鲜树皮中分离得到了一株内生真菌，通过扩增其ITS区域后测序比对发现所得内生真菌为Lasiodiplodia sp.真菌，将其命名为Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株。本发明通过在培养液中添加铁冬青酸溶液发现，所述Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株可以将铁冬青酸转化为铁冬青酸衍生物M(19a,22a,24-trihydroxy-urs-3-oxo-12-ene-28-oic acid)，其结构式如式(I)所示，为新化合物，量大纯度高，且在降脂活性筛选中显示具有比原药铁冬青酸更好的降脂活性。因此，本发明申请保护Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株及其铁冬青酸衍生物的制备方法和应用。

本发明请求保护所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33，该菌株于2022年09月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62757。

本发明还请求保护一种铁冬青酸衍生物M(亦可简称为“衍生物M”)，所述衍生物M的结构式如式(I)所示：

本发明还提供了一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物的方法，即制备式(I)所述铁冬青酸衍生物M的方法，所述衍生物M是将内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33置于含铁冬青酸的培养基中培养分离得到。

具体地，所述制备铁冬青酸衍生物M的方法包括以下步骤：

S1.真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33的活化；

S2.制备Lasiodiplodia sp.JBY-33种子培养液；

S3.将步骤S2所得种子培养液接种至液体培养基中，25～35℃条件下振荡培养12～48h后加入铁冬青酸溶液，相同条件下转化培养24～168h后抽滤；

S4.将步骤S3抽滤所得滤渣用1～3倍质量的甲醇进行提取，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏；

S5.用1～3倍体积的乙酸乙酯对步骤S4所得转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用4～7倍柱体积的40％、50％、60％、70％的甲醇/水梯度洗脱，收集并回收70％甲醇/水洗脱部分，甲醇重结晶即得铁冬青酸衍生物M。

具体地，在重结晶后，采用HR-ESI-TOF-MS和NMR法鉴定转化产物的结构。

具体地，步骤S1所述活化为将冷冻保藏的Lasiodiplodia sp.JBY-33接种于斜面培养基上，25～35℃条件下静置培养24～96h。

更具体地，将冷冻保藏的Lasiodiplodia sp.JBY-33接种于斜面培养基上，28℃条件下静置培养48h。

具体地，步骤S2所述种子培养液是将活化后的Lasiodiplodia sp.JBY-33的孢子接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡培养24～48h得到。

更具体地，所述种子培养液是将活化后的Lasiodiplodia sp.JBY-33的孢子接种至液体培养基中，于28℃、160rpm/min条件下恒温振荡培养24h得到。

具体地，步骤S3中种子液的接种量为1～15％，加入的铁冬青酸溶液的终浓度为0.05～0.50g/L。

更具体地，步骤S3中种子液的接种量为5％，28℃、160rpm/min条件下恒温振荡培养24h后，加入终浓度为0.2g/L的铁冬青酸溶液，相同条件下转化培养144h后抽滤。

具体地，配制铁冬青酸溶液所用溶剂为无水乙醇、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种或几种，且培养液中有机溶剂的最终含量小于3％。

具体地，步骤S4中所述提取为超声提取，滤渣用甲醇超声提取3此，每次1h，以质量计，甲醇用量为滤渣的2倍。

具体地，步骤S5所述甲醇/水是指甲醇/水体积比的混合物。

具体地，上述培养Lasiodiplodia sp.JBY-33所用液体培养基为PDB培养基。

所述PDB液体培养基的配方(每升)为：以质量比计，马铃薯(从中提取浸出粉)300.0g，葡萄糖20.0g。

鉴于本发明所述内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33可将铁冬青酸转化为铁冬青酸衍生物M，因此，本发明还请求保护所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33在制备式(I)所示铁冬青酸衍生物M中的应用。

本发明发现所述铁冬青酸衍生物M较原药铁冬青酸能够有效降低FFA诱导的HepG2细胞高脂模型中的TG含量，具有很好的降脂活性，能够用于制备降脂药物。因此，本发明还请求保护所述铁冬青酸衍生物M在制备降脂药物中的应用。

具体地，所述应用为铁冬青酸衍生物M在制备降低FFA诱导的HepG2细胞高脂模型中TG含量的药物中的应用。

本发明还提供了一种降脂药物，所述药物中含有式(I)所示铁冬青酸衍生物M。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33，所述内生真菌可将铁冬青酸转化为铁冬青酸衍生物M，其结构式如式(I)所示。本发明所述铁冬青酸衍生物M具有较大的安全系数，在降脂活性筛选中显示具有比原药铁冬青酸更好的降脂活性，可将其用于制备降脂药物。本发明为降脂药物的制备提供了新的有效成分，即铁冬青酸衍生物M，其在制备FFA诱导的HepG2细胞高脂模型的降脂药物中具有良好的应用前景。

基于本发明所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33，本发明还提供了一种利用微生物将铁冬青酸转化为其衍生物M的方法，所述方法的反应条件温和、铁冬青酸的转化效率高，转化过程中所选用的培养基价格低廉、原料来源充足，转化反应具有较高的专一性，采用反相色谱和重结晶法分离纯化转化产物发现转化产物中铁冬青酸衍生物M的纯度高达98.0％，分离纯化步骤简单、产物纯度高、易于量化生产。

附图说明

图1为铁冬青酸转变为铁冬青酸衍生物M的结构示意图。

图2为铁冬青酸衍生物M的液相验纯图及保留时间。

图3为铁冬青酸衍生物M的高分辨质谱图。

图4为铁冬青酸衍生物M对细胞活力的影响。

图5为铁冬青酸和铁冬青酸衍生物M的降脂活性研究结果；图中NC为对照组；HC为模型组；ST为辛伐他汀阳性药组；L为低剂量给药组；M为中剂量给药组；H为高剂量给药组；RA为铁冬青酸；M为铁冬青酸衍生物M；相比于正常组，模型组**代表P<0.01，有显著性差异；相比于模型组，给药组#代表P<0.05，##代表P<0.01，有显著性差异。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33的分离

本发明采用组织块分离法从中药救必应(铁冬青)的新鲜树皮中分离得到了一株内生真菌，其生长温度范围为25～35℃。

菌种鉴定：

使用DNA提取试剂盒(TSINGKE，货号为TSP101)，按说明书的步骤提取分离所得内生真菌的基因组DNA，以DNA为模板，用引物ITS1和ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增其ITS区域，测序得到该真菌的ITS-rRNA基因序列，通过序列比对对真菌进行鉴定。

本发明测序所得内生真菌的ITS-rRNA基因序列如下所示：

通过BLAST数据库进行相似度检索，经比较，该序列与Lasiodiplodiapseudotheobromae isolate DSS51、Lasiodiplodia sp.Strain Bpf-20等菌株的同源性为100％，初步确定分离所得内生真菌为Lasiodiplodia sp.真菌，将其命名为内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株。所述Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株于2022年09月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62757，保藏地址为广东广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼。

实施例2 Lasiodiplodia sp.JBY-33转化产物的分离鉴定

本实施例利用实施例1分离所得内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株对铁冬青酸进行了转化培养，并对转化培养所得转化产物进行了分离鉴定。

1、转化培养

S1.活化菌种：将实施例1分离得到的内生真菌JBY-33菌株接种于斜面培养基上，于28℃条件下静置培养24h；

S2.制备种子培养液：将步骤S1中斜面培养基上的孢子接种至30mL PDB液体培养基中，于28℃、160rpm/min条件下恒温振荡培养24h，得到种子培养液；

S3.转化培养：以5％的接种量将步骤S2所得种子培养液接种至600mL的PDB液体培养基中，共接种25瓶，于28℃、160rpm/min条件下恒温振荡预培养24h后加入铁冬青酸溶液，使其终浓度为0.20g/L，一共投入原药铁冬青酸3.0g，然后继续于相同条件下转化培养144h后抽滤；

S4.滤渣提取：步骤S3抽滤所得滤渣用2倍量(以质量计)的甲醇超声提取3次，每次0.5h，合并滤液和甲醇提取液，减压回收得到转化浸膏；

S5.转化产物的分离纯化及结构鉴定：用2倍体积的乙酸乙酯对步骤S4中的转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用5倍柱体积的40％、50％、60％、70％的甲醇/水梯度洗脱，收集并回收70％甲醇/水洗脱部分，甲醇重结晶得其主要转化产物，干燥称重有1.4g，计算得率为46.7％。

具体地，步骤S1中所述斜面培养基的配方(每升)为：马铃薯(从中提取浸出粉)300.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，氯霉素0.1g。

具体地，步骤S2中所述PDB液体培养基的配方(每升)为：马铃薯(从中提取浸出粉)300.0g，葡萄糖20.0g。

具体地，步骤S3中溶解铁冬青酸的溶剂为无水乙醇。

2、转化产物的结构鉴定

内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33菌株对铁冬青酸进行转化所得转化产物为无色针状结晶(甲醇重结晶)，本发明利用HR-ESI-TOF-MS和NMR法对所得转化产物的结构进行了鉴定，将其主要转化产物(纯度高达98％)命名为M，即本发明所述铁冬青酸衍生物M；薄层检测10％硫酸乙醇显草绿色；HR-ESI-TOF-MS m/z 501.3226[M-H]^-(calcd for C₃₀H₄₅O₆，501.3211)。

本发明所得铁冬青酸衍生物M的结构式如式(I)所示：

铁冬青酸(RA)转变为铁冬青酸衍生物M的结构示意图如图1所示，由图1可知，铁冬青酸在内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33作用下发生了3位羰基化及22位的羟基化反应，转变为一个新化合物，即铁冬青酸衍生物M。

铁冬青酸衍生物M液相验纯图及保留时间如图2所示，由图2可知，除2.5min左右的溶剂效应导致的起伏之外，无其他杂质，分离所得衍生物M的纯度高，可用于核磁波谱测试及药理活性研究。

铁冬青酸衍生物M的高分辨质谱数据如表1及图3所示，由表1和图3可知，衍生物M的准分子离子峰为m/z 501.3226[M-H]^-，计算值如表1所示，为C₃₀H₄₅O₆ 501.3211，由此确定衍生物M的分子式为C₃₀H₄₆O₆。

铁冬青酸衍生物M的高分辨质谱数据如表1所示：

表1

Formula	Calculated m/z(Da)	Error(mmu)	Error(ppm)	RDB
					C<sub>30</sub>H<sub>45</sub>O<sub>6</sub>	501.3211	1.53	3.1	9.0

一维核磁共振数据见表2。

表2衍生物M的NMR数据(C₅D₅N，400MHz/100MHz，ppm)

实施例3 Lasiodiplodia sp.JBY-33转化产物的分离鉴定

1、转化培养

S3.转化培养：以5％的接种量将步骤S2所得种子培养液接种至600mL的PDB液体培养基中，共接种25瓶，于28℃、160rpm/min条件下恒温振荡预培养24h后加入铁冬青酸溶液，使其终浓度为0.50g/L，然后继续于相同条件下转化培养24h后抽滤；

S5.转化产物的分离纯化及结构鉴定：用2倍体积的乙酸乙酯对步骤S4中的转化浸膏进行萃取，萃取物经反相柱色谱分离，依次用5倍柱体积的40％、50％、60％、70％的甲醇/水梯度洗脱，收集并回收70％甲醇/水洗脱部分，甲醇重结晶得其主要转化产物。

主要转化产物的分离鉴定结果同实施例2。

实施例4衍生物M的降脂活性及对细胞活力的影响

本实施例所用铁冬青酸衍生物M为实施例2中转化培养、分离、鉴定所得。

1、衍生物M对细胞活力的影响

1)实验方法

(1)原理

依据MTT法来测定细胞活力，MTT的化学名为3(4,5二甲基噻唑2)2,5二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其检测原理为：活细胞和死细胞的区别在于，活细胞中线粒体中存在琥珀酸脱氢酶，能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝色结晶甲臢；二甲基亚砜(DMSO)可以溶解沉积在细胞内的甲臢，依据加入化合物的干预组和阳性对照组，在490或者540nm波长处测定其吸光度，可间接反映细胞存活的数量。

(2)对细胞活力影响实验

将HepG2细胞悬液接种于96孔板，10⁴/孔，各加200μL培养液，96孔板最***每孔100μL PBS，第一列不加细胞只加培养液作为空白对照组，其余分为对照组和给药组，每组6个复孔；于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养。

待细胞密度长至80％左右时，吸弃上清液，给药组用5个不同浓度的转化产物M(实施例2中分离鉴定所得衍生物M，浓度分别为25、50、100、200、400μM)干预24h，不加药组不处理；培养24h后，除了空白对照组，其余各孔加入10μL MTT溶液(质量浓度为5mg/mL)，继续培养4h。

吸出孔内培养液，每孔加入DMSO溶液150μL，室温下将96孔板置摇床上震荡10min，使结晶物完全溶解。应用酶标仪测定各孔在490nm波长下的OD值。重复三次取平均值，计算细胞存活率。

测定6个浓度的衍生物M，绘制剂量抑制率曲线，得出其IC₅₀值。

2)实验结果

衍生物M对细胞活力的影响实验结果如图4所示，由图4可知，衍生物M在25～400μmol/L浓度范围对HepG2细胞的活力基本无影响，细胞存活率均大于80％，说明衍生物M具有较大的安全系数。

2、降脂活性

1)原理

降脂活性实验采用的是临床和实验室常用的细胞内TG(甘油三酯)测定法，TG(甘油三酯)能在脂肪酶和甘油激酶的作用下转化成甘油-3-磷酸，然后经3-磷酸甘油清化酶形成过氧化氢，过氧化氢经过氧化物酶氧化之后形成红色的醌化物，其颜色与甘油三酯含量成正比；测定吸光度值并通过以下公式计算甘油三酯含量，标准品浓度为2.26mmol/L。

2)实验方法

将HepG2细胞悬液接种于6孔板，5×10⁵/孔，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

将细胞分为正常组(NC)、模型组(HC)、辛伐他汀阳性药组(ST，10μmol/L)、铁冬青酸(RA)和衍生物M组，另分别设置低(L，5μmol/L)、中(M，15μmol/L)、高(H，50μmol/L)剂量给药组，待细胞密度长至80％左右时，NC组细胞用含1％BSA的DMEM溶液培养，其他组细胞则与FFA共同孵育，24h后吸弃各孔中的培养基，PBS清洗两次后，用细胞刮刀刮下细胞，转移到离心管中制备成细胞混悬液，1000rpm，离心10min，弃上清液，再用PBS打散细胞，1000rpm，离心10min，弃上清液，留细胞沉淀。

用RIPA裂解液裂解细胞沉淀30min，将细胞混悬液每5min涡旋震荡一次，裂解好的液体严格按照TG试剂盒说明书操作，于96孔板上避光加入TG工作液，每组6个复孔，重复三次。

将96孔板在37℃孵育10min，在510nm波长处测定各孔的吸光度值。取2μL细胞混悬液稀释20倍，在96孔板中测定各组细胞的蛋白浓度。严格按照BCA蛋白浓度定量试剂盒说明书进行操作，操作完成后于562nm处测定各孔吸光度值。

3)实验结果

铁冬青酸和铁冬青酸衍生物M的降脂活性研究结果如图5所示，图中NC为对照组；HC为模型组；ST为辛伐他汀阳性药组；L为低剂量给药组；M为中剂量给药组；H为高剂量给药组；RA为铁冬青酸；M为铁冬青酸衍生物M；相比于正常组，模型组**代表P<0.01，有显著性差异；相比于模型组，给药组#代表P<0.05，##代表P<0.01，有显著性差异。

由图5可知，铁冬青酸(RA)和铁冬青酸衍生物M在低、中、高剂量给药时，细胞内TG含量相比于模型组均显著降低，且随着给药剂量的增大，降甘油三酯活性越显著，具有一定的剂量依赖性。铁冬青酸(RA)和铁冬青酸衍生物M在50μmol/L浓度下TG清除率分别为35.8％和41.8％，由此可知，铁冬青酸衍生物M在50μmol/L浓度下较原药铁冬青酸(RA)显示出更好的降脂作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33，其特征在于，所述内生真菌于2022年09月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62757。

2.一种铁冬青酸衍生物M，其特征在于，所述衍生物M的结构式如式(I)所示：

3.一种制备权利要求2所述铁冬青酸衍生物M的方法，其特征在于，所述衍生物M是将权利要求1所述内生真菌置于含铁冬青酸的培养基中培养后分离得到。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33的活化；

S2.制备Lasiodiplodia sp.JBY-33种子培养液；

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1所述活化为将冷冻保藏的Lasiodiplodia sp.JBY-33接种于斜面培养基上，25～35℃条件下静置培养24～96h。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2所述种子培养液是将活化后的Lasiodiplodia sp.JBY-33的孢子接种至液体培养基中，于25～35℃、100～200rpm/min条件下恒温振荡培养24～48h得到。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S3中种子液的接种量为1～15％，加入的铁冬青酸溶液的终浓度为0.05～0.50g/L。

8.权利要求1所述救必应内生真菌Lasiodiplodia sp.JBY-33在制备式(I)所示铁冬青酸衍生物M中的应用。

9.权利要求2所述铁冬青酸衍生物M在制备降脂药物中的应用。

10.一种降脂药物，其特征在于，含有式(I)所示铁冬青酸衍生物M。