CN115491408A - 一种鉴定微生物污染程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种鉴定微生物污染程度的方法，尤其涉及ATP降解缓冲液，该缓冲液能提高ATP降解酶降解ATP的能力，极大提高了ATP降解酶的活性。
Description
技术领域
本申请涉及一种鉴定微生物污染程度的方法，属于生物化学检测领域。
背景技术
传统的微生物污染程度的检测方法主要为微生物培养法和pH方法，其中微生物方法操作复杂，劳动强度大，对操作人员的技术水平要求高，检测速度慢、通常需要7-19天，需要无菌操作环境；pH方法主要通过检测样品中pH的变化来判断微生物污染程度，通常需要5-14天，需要无菌操作环境，另外并非所有微生物的生长繁殖都会改变pH，因此pH方法易出现假阴性结果。由于这些检测方法检测速度较慢，可适用于保质期较长的罐头类食品的检测，而乳制品等自动化程度较高且保质期较短的食品则不适用这样的检测方法。
ATP是一种能量分子，普遍存在于有机体中，ATP含量与微生物活细胞数量成一定正比关系。因此，通过检测样品中ATP的含量判断微生物的污染程度是一种非常有市场前景的、快速检测样品中微生物污染的方法。这种方法的步骤大体包括：首先通过ATP降解剂去除微生物细胞外的游离ATP(若是植物源性食品，要先提取植物体细胞ATP)；再酶解游离ATP和/或植物体细胞ATP；然后裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的ATP；再后在荧光素酶的存在下，ATP可与荧光素快速反应并发光；最后通过检测仪捕获ATP发光反应的发光信号并报告结果。这种方法存在的问题是：ATP降解酶在反应中活力不足，游离ATP去除不完全，微生物细胞裂解不充分，缺乏优质的反应体系，同一套检测方法对不同的样品难以均获得准确度、精密度、灵敏度俱佳的检测结果等。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人联合多家科研单位共同研发，将整套ATP 检测方法流程中的每个环节拆分开来，逐一进行改良，并分工协作，最终摸索出了一套高效的检测微生物污染程度的***，包括试剂盒、检测方法及设备。
本申请首先提供一种ATP降解缓冲液，包括Zn2+离子。
在一种实施方式中，ATP降解缓冲液包括ZnSO4、琥珀酸和氢氧化钠。
本申请还提供一种ATP降解剂，包括上述的缓冲液以及ATP降解酶。
在一种实施方式中，ATP降解酶包括三磷酸腺苷双磷酸酶和/或腺苷磷酸脱氨酶。
本申请还提供一种试剂盒，包括上述的ATP降解缓冲液。
在一种实施方式中，试剂盒进一步包括ATP降解酶、植物细胞ATP提取剂和/或微生物细胞裂解剂。
在一种实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。
上述的ATP降解缓冲液、或上述的ATP降解剂、或上述的试剂盒在降解ATP 中的用途。
上述的ATP降解缓冲液、或上述的ATP降解剂、或上述的试剂盒在检测微生物污染中的应用。
本申请还提供一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，其特征在于，使用上述的ATP降解缓冲液、或上述的ATP降解剂、或上述的试剂盒。
具体实施方式
本申请中的“样品”包括食品、燃油、水体等任何适宜的样品。
本申请中的“食品”包括乳制品、超高温灭菌食品、植物蛋白饮料、婴幼儿灌装辅助食品及罐头类食品、饮料、牛奶、纯奶、巧克力奶、乳饮料、豆奶、炼乳、果泥和肉泥等。
本申请的试剂盒包括ATP降解酶、ATP降解缓冲液和/或微生物细胞裂解剂；可选的，所述试剂盒还包括植物体细胞ATP提取剂；可选的，所述试剂盒还包括发光反应试剂和发光反应缓冲液。
本申请中的ATP降解剂包括ATP降解酶和ATP降解缓冲液。其中，ATP降解酶包括三磷酸腺苷双磷酸酶和和/或腺苷磷酸脱氨酶。ATP降解缓冲液包括 Zn2+离子，例如包括ZnSO4、琥珀酸和氢氧化钠。ATP降解剂中，Zn2+的最佳浓度为0.004mM，最佳反应时间为10分钟。
本申请中的细胞裂解剂包括三甲基甘氨酸，例如包括十八烷基三甲基氯化铵、三甲基甘氨酸和EDTA。
本申请的脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚可由如下步骤制成：
在四口烧瓶中加入脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO7)和三氟化硼***络合物(占 AEO摩尔量的1％)，升温至58℃后，缓慢滴加一定量的环氧氯丙烷(AEO7与环氧氯丙烷的摩尔比例为1:1.2)，滴加完成后继续反应3h。减压除去过量的环氧氯丙烷，然后加入质量分数为40％的氢氧化钠溶液(AEO7与NaOH的摩尔比例为1:1.2)，然后恒温闭环反应4.5h，反应结束后减压除水，过滤即得脂肪醇聚氧乙烯缩水甘油醚中间体。
在四口烧瓶中加入甘油、脂肪醇聚氧乙烯缩水甘油醚和质量分数10％的氢氧化钠乙醇溶液，升温至58℃，减压除去乙醇和水，然后充入氮气，并升温至 150℃反应3.5h，然后用乙醇洗涤、过滤、干燥，即得脂肪醇聚氧乙烯系列聚二甘油醚。其中，脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚氧乙烯基的数量可为3-9(如7)。
本申请得植物体细胞ATP提取剂可由如下步骤制备而成：
称量1.8-2.2g脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚(n＝7)，加入800mL无ATP水中，溶解后定容至1L。每瓶4.5mL。
本申请的ATP降解剂可由如下步骤制备而成：
ATP降解酶制备：称量三磷酸腺苷双磷酸酶(即腺苷三磷酸双磷酸酶)和腺苷磷酸脱氨酶(即腺苷酸脱氨酶)水解脱氨生成次黄嘌呤核苷-5′－磷酸(次黄核苷酸)反应的酶粉末，使每瓶中三磷酸腺苷双磷酸酶和腺苷磷酸脱氨酶活性分别为58-62U和28-32U。
ATP降解缓冲液制备：称量1.1-1.2mg ZnSO4·7H2O、8.500-8.742g琥珀酸、0.120-0.134g氢氧化钠，用800mL无ATP水溶解，混匀后定容至1L，每瓶15mL。
使用时将1瓶ATP降解缓冲液与1瓶ATP降解酶混匀，称为ATP降解剂。
本申请的微生物细胞裂解剂可由如下步骤制备而成：
称量495-505mg十八烷基三甲基氯化铵、3.50-4.50g三甲基甘氨酸、 0.142-0.150mg EDTA，加入800mL无ATP水中，溶解后定容至1L。每瓶23.75mL。
本申请的发光反应试剂可由如下步骤制备而成：
称量248-252μg荧光素酶、1.810-1.818μg D-荧光素钠装入瓶中。
本申请的发光反应缓冲液可由如下步骤制备而成：
称量610-620μg七水硫酸镁、97.69-107.69mg海藻糖、120-130mg二硫苏糖醇和140-160mg牛血清白蛋白，加入800mL无ATP水中，混匀，用10％的氢氧化钠将pH调至7.8，并定容至1L。每瓶23.75mL。
使用时将1瓶发光反应缓冲液与1瓶发光反应试剂混匀，称为发光反应溶液。
本申请方法的主要步骤包括：样品制备(可选的，如保温培养或孵育)；用植物细胞提取剂提取植物细胞ATP(若为植物源性食品，否则无需该步骤)；通过ATP降解剂降解游离ATP和/或植物体细胞ATP；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的ATP；在荧光素酶的存在下，使ATP 可与荧光素快速反应并发光；通过检测仪捕获ATP发光反应的发光信号并反馈结果。
具体而言，本申请的微生物污染(程度)的检测方法或ATP含量测定方法，例如包括如下步骤：
1)样品制备
植物蛋白饮料
a)将样品在36℃保温48小时。
b)吸取30μL植物体细胞ATP提取剂到试管中。
c)取出培养箱中的样品，充分摇晃使样品混合均匀。
d)小心打开包装，吸取1mL样品到对应的含植物体细胞ATP提取剂的试管中，盖紧离心管帽。
e)涡旋10次，使试剂与样品充分混匀。
f)将试管置于室温下静置15分钟，取50μl用于检测。
乳制品、饮料等将样品在36℃保温48小时，取50μl用于检测。
婴幼儿灌装辅助食品及罐头类食品
a)在无菌环境下，取样品25g(mL)至225mL TSB液体培养基中，混匀，培养24h；
b)取培养后的培养液25mL，转移到225mL TSB液体培养基中，混匀，培养48h；
c)取50μl培养后样品，上机检测。
2)测定步骤
a)移取50μL样品至微孔板微孔中，将微孔板置于板架上。
b)在仪器软件页面，输入第一个样品孔的位置和样品数量，然后点击“Start”。
c)检测仪自动进行以下操作：
i.在每个微孔中添加50μL ATP降解剂，孵育10分钟。
ii.在第一个待测微孔中添加95μL微生物细胞裂解剂，反应7秒钟。
iii.再向第一个待测微孔中添加95μL发光反应溶液。1秒后用检测仪检测光信号，单位为RLU(相对发光单位)。
3)结果判定
RLU值小于150时，结果为阴性，表明无微生物污染。
RLU值为151-300时，结果为疑似阳性，表明可能存在微生物污染，需重新取5个样品进行检测，若5个样品中有3个或3个以上样品的检测结果仍为 150-300，或者1个及1个以上样品的结果大于300，则报告为无微生物污染。
RLU值大于300，结果为阳性，表明存在微生物污染。
本申请用于检测微生物污染的检测仪包括流体***、光电***、微孔板承载***和软件***等。流体***由分液***和注射***组成，并采用了反向泵，可将使用后管线中的试剂泵回试剂瓶中，节约试剂；光电***由高灵敏的光电倍增管和信号收集器组成，与光电二极管相比，灵敏度更高，同时采用百叶窗设计，便于用户自行维护。
本申请另外提供一种植物体细胞ATP提取剂，包括脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚。
在一种实施方式中，脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的浓度为0.2％。
在一种实施方式中，脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的氧乙烯基的数量为3-9。
本申请进一步提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的ATP 提取剂。
在一种实施方式中，试剂盒还包括ATP降解酶、ATP降解缓冲液和/或微生物细胞裂解剂。
在一种实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。
本申请还提供上述ATP提取剂或试剂盒在提取植物细胞ATP中的用途。
本申请还提供上述ATP提取剂或试剂盒在检测微生物污染中的应用。
本申请还提供了一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，其特征在于，使用上述的ATP提取剂或试剂盒进行鉴定。
本申请另外提供一种微生物细胞裂解剂，包括三甲基甘氨酸。
在一些实施方式中，裂解剂进一步包括十八烷基三甲基氯化铵和EDTA。
在一些实施方式中，裂解剂的制备方法为：称量495-505mg十八烷基三甲基氯化铵、3.5-4.5g三甲基甘氨酸、0.142-0.150mg EDTA，加入800mL无ATP 水中，溶解后定容至1L。
本申请还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的微生物细胞裂解剂。
在一些实施方式中，试剂盒还包括ATP降解酶、ATP降解缓冲液和/或植物细胞ATP提取剂。
在一些实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。
上述的裂解剂、或上述的试剂盒在裂解微生物细胞中的用途。
上述的裂解剂、或上述的试剂盒在检测微生物污染中的应用。
本申请还提供一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，使用上述的裂解剂或上述的试剂盒。
本申请还提供一种检测样品中ATP含量的方法，其特征在于，使用上述的裂解剂或上述的试剂盒。
本申请另外提供一种检测仪，包括流体***、光电***、微孔板承载***和软件***；所述流体***由分液***和注射***组成；所述光电***由高灵敏的光电倍增管和信号收集器组成。
在一些实施方式中，流体***中采用反向泵将使用后残留在管线中的试剂泵回试剂瓶中。
在一些实施方式中，光电倍增管采用百叶窗设计。
本申请还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括ATP降解酶、ATP 降解缓冲液和/或微生物细胞裂解剂；可选的，所述试剂盒还包括植物细胞ATP 提取剂；可选的，所述试剂盒还包括发光反应试剂和发光反应缓冲液；其中：所述ATP降解缓冲液中包括Zn2+离子；或者所述微生物细胞裂解剂包括三甲基甘氨酸；或者所述植物细胞ATP提取剂包括脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚。
本申请还提供一种用于检测样品微生物污染程度的***，其特征在于，包括上述的检测仪和/或上述的试剂盒。
本申请还提供一种检测ATP含量的方法或鉴定微生物污染程度的方法，其特征在于，包括使用上述的检测仪，或使用上述的试剂盒，和/或使用上述的***。
在一些实施方式中，所述方法包括：样品制备；通过ATP降解剂降解游离 ATP和/或植物体细胞ATP；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的ATP；使ATP与荧光素反应并发光；通过检测仪捕获发光信号并反馈结果。
在一些实施方式中，ATP与荧光素反应的发光反应缓冲液中包括Mg2+、海藻糖、BSA和二硫苏糖醇。
在一些实施方式中，样品制备包括使样品在适于微生物生长的温度下(例如36℃)中保温(如24-72小时，优选为48小时)的步骤。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括通过检测发光强度判断微生物的污染程度，当RLU值小于150时，结果为阴性；当RLU值为151-300时，结果为疑似阳性；当RLU值大于300，结果为阳性，表明存在微生物污染。
实验例1 ATP降解酶中三磷酸腺苷双磷酸酶和腺苷磷酸脱氨酶的最佳活力。
取ATP二钠盐，用无ATP水溶解，使ATP浓度为10-7M。取50μl制备的 ATP溶液，向其中加入50μl由三磷酸腺苷双磷酸酶(A)和腺苷磷酸脱氨酶 (B)制备的ATP降解剂，孵育10分钟，然后加入95μl发光反应溶液，用检测仪测定发光强度(相对发光单位RLU)，每个检测做5个平行，结果取平均值，结果见表1。
表1不同酶活的检测结果
由表1可以看出，当三磷酸腺苷双磷酸酶的活力为60-70U，腺苷磷酸脱氨酶的活力为30-40U时，测得的荧光强度为0，表明酶的水解能力非常强，因此选择将60U和30U分别作为三磷酸腺苷双磷酸酶和腺苷磷酸脱氨酶的最佳活力。
实验例2 ATP降解缓冲液中金属离子的种类。
分别称量0.004mM MgSO4·7H2O、CaSO4、ZnSO4·7H2O，然后加入8.621g琥珀酸、0.127g氢氧化钠，用800mL无ATP水溶解，混匀后定容至1L。使用由不同金属离子制备的ATP降解缓冲液制备ATP降解剂。
取ATP二钠盐，用无ATP水溶解，使ATP浓度为10-7M。取50μl制备的 ATP溶液，向其中加入50μl ATP降解剂，孵育10分钟，然后加入95μl发光反应溶液，用检测仪测定发光强度(相对发光单位RLU)，每个检测做5个平行，结果取平均值，结果见表2。
表2离子种类对发光强度的影响
由表2可见，当ATP降解缓冲液中含Zn2+时，获得的发光强度最低，表明Zn2+对于ATP降解剂的促进能力强于Ca2+和Mg2+。因此，选择Zn2+作为ATP降解剂中的重要成分。
实验例3 ATP降解缓冲液中Zn2+的最佳浓度及最佳反应时间。
取ATP二钠盐，用无ATP水溶解，使ATP浓度为10-7M。取50μl制备的 ATP溶液，向其中加入50μl ATP降解剂，降解剂中Zn2+的浓度分别为0.002mM、 0.003mM、0.004mM、0.005mM、0.006mM，孵育时间分别为6分钟、8分钟、10 分钟、12分钟和14分钟，然后加入95μl发光反应溶液，用检测仪测定发光强度(相对发光单位RLU)，每次测定做3个平行，结果取平均值。
表3离子浓度和孵育时间对发光强度的影响
由表3可见，当Zn2+浓度为0.002-0.004mM时，发光强度随离子浓度的升高而降低，当Zn2+浓度为0.004-0.006mM时，发光强度的变化不明显；当Zn2+浓度为0.002-0.003mM时，发光强度随孵育时间的延长而逐渐降低，当Zn2+浓度为0.004mM,孵育时间为10分钟时，发光强度为0，表明ATP已经被充分降解，因此选择0.004mM为Zn2+的最佳浓度(1.15mg ZnSO4·7H2O)，10分钟为最佳反应时间。
综上，本申请通过改良的方案检测各种样品中ATP的含量，判断其被微生物的污染程度，对各类样品均普遍适用，且结果准确、精密度高、灵敏度高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本申请的权利要求和说明书的范围当中。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (10)
1.一种ATP降解缓冲液，其特征在于，包括Zn2+离子。
2.如权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，包括ZnSO4、琥珀酸和氢氧化钠。
3.一种ATP降解剂，其特征在于，包括权利要求1所述的缓冲液以及ATP降解酶。
4.如权利要求3所述的降解剂，其特征在于，所述ATP降解酶包括三磷酸腺苷双磷酸酶和/或腺苷磷酸脱氨酶。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的ATP降解缓冲液。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括ATP降解酶、植物细胞ATP提取剂和/或微生物细胞裂解剂。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。
8.权利要求1-2之一所述的ATP降解缓冲液、或权利要求3-4之一所述的ATP降解剂、或权利要求5-7之一所述的试剂盒在降解ATP中的用途。
9.权利要求1-2之一所述的ATP降解缓冲液、或权利要求3-4之一所述的ATP降解剂、或权利要求5-7之一所述的试剂盒在检测微生物污染中的应用。
10.一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，其特征在于，使用权利要求1-2之一所述的ATP降解缓冲液、或权利要求3-4之一所述的ATP降解剂、或权利要求5-7之一所述的试剂盒。
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