CN115484946A - 用于诊断和治疗***癌的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于治疗和检测癌症的组合物、试剂盒和方法，并且更具体地公开了用于癌症患者的靶向放疗的经放射性标记的缀合物。

Description

用于诊断和治疗***癌的组合物、试剂盒和方法

相关案

本申请要求于2020年4月24日提交的美国临时申请号63/015,182的优先权，所述美国临时申请在法律允许的最大程度上以引用方式整体并入本文。

背景技术

本公开总体上涉及癌症治疗。更具体地，本公开涉及使用放射性标记的缀合物对癌症患者进行靶向放疗。

已经开发了各种用于治疗癌细胞的药物。为了特异性靶向癌细胞，已经开发了靶向组合物来治疗癌细胞，而不影响在所述癌细胞附近的健康细胞。为了靶向所述癌细胞，提供了具有被设计以用于特异性结合癌细胞的部分的化学物质的靶向组合物。与健康细胞相比，此类组合物可在癌细胞中过表达。这些组合物还被设计用于结合并破坏癌细胞，而不破坏患者体内的其他细胞。

用于癌症治疗的缀合物的示例提供于美国专利/申请号2016/0143926、2015/0196673、2014/0228551、9408928、9217009、8858916、7202330、6225284、6683162、6358491和WO2014052471中，这些专利的全部内容据此以引用方式并入本文。肿瘤靶向组合物的示例提供于美国专利/申请号US2007/0025910和US5804157中，这些专利的全部内容据此以引用方式并入本文。

下面提供了关于癌症治疗的附加信息。

附图说明

当结合附图阅读时，从以下详细描述将最好地理解本公开。需强调的是，根据行业中的标准实践，各种特征未按比例绘制。实际上，为了讨论清楚起见，各种特征的尺寸可以任意增大或减小。

图1描述了对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植物中⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA(注射剂量45uCi)的microPET成像研究。图像是在注射后1小时采集的。小鼠的照片(左边)示出了所植入的肿瘤的实际大小。

图2描述了在注射后2h进行的对LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究；a)重建的融合PET/CT扫描；b)冠状面视图；c)轴向视图。根据本公开的一个或多个示例，该试剂被保留在LNCap来源的肿瘤和22Rv1来源的肿瘤两者中。

图3描述了在注射后4h进行的对LNCap(左胁腹，体积500mm³)和22Rv1(右胁腹，体积192mm³)异种移植小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA(62.3uCi)的microPET成像研究；a)重建的PET/CT融合扫描；b)矢状面视图；c)冠状面视图；d)轴向视图。根据本公开的一个或多个示例，该试剂被保留在LNCap肿瘤和22Rv1肿瘤两者中以及非靶向器官肝脏中。

图4示出了根据本公开的一个或多个示例，标绘22RV1肿瘤和正常器官(肝脏、肾脏、肌肉和唾液腺)中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA分布的时间依赖性变化的图表。

图5A描述了对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究。扫描是在注射后1h采集的。肿瘤体积低于150mm³。

图5B是示出根据本公开的一个或多个示例所植入的肿瘤的大小的小鼠照片。

图6描述了根据本公开的一个或多个示例对在NOG小鼠中生成的LNCap异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究；研究是在注射后1h(A)和24h(B)进行的。

图7示出了标绘在注射后1h、2h和24h进行的对无胸腺裸小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究的图表。根据本公开的一个或多个示例，肝脏和肾脏是显示出最高试剂积聚的脱靶器官。

图8示出了标绘根据本公开的一个或多个示例，在注射后2h和24h进行的对R2G2小鼠的LNCap异种移植物和22RV1异种移植物中以及在注射后1h和24h进行的对NOG小鼠的LNCap异种移植物和22RV1异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究的图表。

图9描述了在注射后1h和3h进行的将²¹²Pb-DOTAM-PSMA施用于无胸腺裸小鼠的过表达PSMA的异种移植物的生物分布结果。

图10表示在注射后1h和3h对LNCAP异种移植物中²¹²Pb-DOTAM-PSMA累积的并排比较。

图11描述了在注射后1h将²⁰³Pb-DOTAM-PSMA施用于无胸腺裸小鼠的过表达PSMA的异种移植物的生物分布结果。

图12表示在注射后3h将²⁰³Pb-DOTAM-PSMA施用于无胸腺裸小鼠的过表达PSMA的异种移植物的生物分布结果。

图13A示出了在室温下储存1小时的Pb203-RMX-PSMA的选择性放射-HPLC色谱。经放射性标记的产物的保留时间(Rt)为14.7min。

图13B示出了在室温下储存48小时的Pb203-RMX-PSMA的选择性放射-HPLC色谱。经放射性标记的产物的保留时间(Rt)为14.7min。

图13C示出了在室温下储存72小时的Pb203-RMX-PSMA的选择性放射-HPLC色谱。经放射性标记的产物的保留时间(Rt)为14.7min。

具体实施方式

以下描述包括体现本主题的技术的示例性装置、方法、技术和/或指令序列。然而，应当理解的是，所描述的实施方式可以在没有这些具体细节的情况下实践。

***特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)在***癌细胞的表面上以及各种实体瘤的新生血管中独特地过表达。因此，PSMA作为一种检测和处理(management)***癌的临床生物标志物已经引起了人们的关注。通常，这些方法利用特异性靶向PSMA的抗体来引导成像剂或治疗剂。例如，已被FDA批准用于***癌的检测和成像的ProstaScint(Cytogen,Philadelphia,Pa.)利用抗体来递送螯合的放射性同位素(铟-111)。然而，目前认识到ProstaScint技术限于检测死细胞，并且因此其临床相关性是有疑问的。

使用抗体的癌症诊断和疗法的成功受到例如这些生物分子从血液中的缓慢清除和不良的血管渗透性的挑战的限制。此外，与细胞表面靶标结合的大抗体造成相邻细胞表面位点处的附加抗体的后续结合的阻碍，从而导致了减少的细胞表面标记。

除了充当用于递送诊断剂或治疗剂的抗体的细胞表面靶标之外，PSMA的一个很大程度上被忽视的独特性质是其酶促活性。也就是说，PSMA能够识别和加工像二肽一样小的分子。尽管存在这种特性，但是在开发新颖的诊断和治疗策略方面在很大程度上尚未被探索。文献中有几个最近的示例已经描述了使用经标记的PSMA小分子抑制剂检测***癌细胞的结果。

在至少一个方面中，本公开涉及一种用于治疗过表达PSMA的癌细胞的癌症靶向组合物。所述组合物包含放射性同位素、螯合剂和靶向部分。在一个实施方式中，所述螯合剂包含氮环结构，例如DOTAM。

螯合剂(DOTAM)可具有以下通式：

氮环结构可以包含选自由以下组成的组的衍生物：四氮杂环十二烷衍生物、三氮杂环壬烷衍生物和四氮杂双环[6.6.2]十六烷衍生物。靶向部分可以包含PMSA受体靶向肽。PSMA受体靶向肽可以缀合至与放射性同位素配位的螯合剂，从而靶向癌细胞以消除和治疗所述癌细胞。例如，螯合剂DOTAM可以经由其羧酸取代基处的共价键缀合至靶向部分。放射性同位素可以是用于对癌症(包括***癌和结直肠癌)进行成像的任何放射性同位素，以及用于治疗癌症(包括***癌和结直肠癌)的任何放射性同位素。在一些实施方式中，放射性同位素可以是⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²⁰³Pb或²¹²Pb。

本文公开了用于治疗过表达PSMA受体的癌细胞的癌症靶向组合物。所述癌症靶向组合物包含以下或其产品：放射性同位素；螯合剂，所述螯合剂包含氮环结构，所述氮环结构包含DOTAM；以及靶向部分，所述靶向部分包含PSMA受体靶向肽，其中所述靶向部分缀合至与放射性同位素配位的螯合剂，从而靶向癌细胞以消除和治疗所述癌细胞。

在一个实施方式中，所述癌症靶向组合物是具有以下通式的DOTAM-PSMA：

其中M是放射性同位素。在一个实施方式中，放射性同位素是⁶⁴Cu。在另一个实施方式中，放射性同位素是⁶⁷Cu。在仍另一个实施方式中，放射性同位素是²⁰³Pb。在还另一个实施方式中，放射性同位素是²¹²Pb。本文的公开内容不局限于上述结构中的PSMA靶向部分，而是可以涵盖显示为足以结合癌细胞表面上的PSMA受体的任何PSMa靶向部分。

当用能够形成盐的基团或原子适当取代时，本发明的化合物可以采取盐形式。此类基团和原子是有机化学领域的普通技术人员所熟知的。术语“盐”涵盖作为本发明化合物的游离酸或游离碱的加成盐。术语“药学上可接受的盐”是指具有在药学应用中提供效用的范围内的毒性特征的盐。然而，药学上不可接受的盐可具有诸如高结晶度的性质，这在本发明的实践中是有效用的，例如在本发明化合物的合成、纯化或配制过程中是有效用的。

合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。无机酸的示例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂肪族类、脂环族类、芳香族类、芳脂族类、杂环族类、羧酸类和磺酸类有机酸，所述有机酸的示例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(embonic)(帕莫酸(pamoic))、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸(sulfanilic)、环己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、粘酸和半乳糖醛酸。药学上不可接受的酸加成盐的示例包括例如高氯酸盐和四氟硼酸盐。

本发明化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属盐、碱土金属盐和过渡金属盐，例如如钙盐、镁盐、钾盐、钠盐和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包括由碱性胺制成的有机盐，所述碱性胺例如如N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。药学上不可接受的碱加成盐的示例包括锂盐和氰酸盐。

虽然本文所述的方法和组合物涉及某些癌症治疗，但是这也可适用于心血管疾病、感染、糖尿病、癌症和/或其他病况。对于涉及癌症的病例，所述癌症可以是例如源自癌症如肝癌、***癌、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、腺样体癌、口腔癌、皮肤癌、肺癌、睾丸癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌、上皮癌等的实体瘤，例如，所述实体瘤可以是原发性实体瘤或者转移性实体瘤。

在另一方面，提供了一种治疗患有细胞增殖性病症、特别是癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体单独施用或与药学上可接受的载体组合施用有效量的至少一种本文所公开的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐。

在还另一方面，提供了一种在患有癌症的个体中诱导癌细胞(例如肿瘤细胞)凋亡的方法，所述方法包括向所述个体单独施用或与药学上可接受的载体组合施用有效量的至少一种根据式I的化合物或其药学上可接受的盐。

所述式I化合物可以通过任何途径施用，所述途径包括口服、直肠、舌下和肠胃外施用。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、***内、膀胱内(例如，至膀胱)、皮内、经皮、局部或皮下施用。在本发明的范围内还考虑了将药物以受控制剂的形式滴注到患者体内，稍后发生药物的全身或局部释放。例如，可以将药物定位在贮库(depot)中以用于向循环中控释，或者用于向肿瘤生长的局部部位释放。

可用于实践本公开的一种或多种化合物可以通过相同或不同的途径同时施用，或者在治疗期间的不同时间施用。所述化合物可以在包含其他抗增殖化合物在内的其他药物之前、同时或之后施用。

所述治疗可以在必要的时间内进行，可以是一次不间断的治疗，也可以是不连续的治疗。治疗医师将知道如何根据患者的反应增加、减少或中断治疗。所述治疗可以进行约4周至约16周。治疗方案可以根据需要重复。

特别地，癌症治疗组合物可以包含与放射性同位素和PSMA肽靶向部分联合使用的DOTAM螯合剂，以进一步增强治疗特性。放射性同位素，例如212Pb、203Pb、64Cu和/或其他放射性核素α-发射体，具有高线性能量转移(linear energy transfer,LET)发射和短路径长度，辐射距离短，例如在约1-2个细胞直径内，和/或可不需要氧合或繁殖来不可逆地损伤(例如，杀伤)肿瘤细胞。

如本文所示，这些组分与同位素形成稳定的复合物，所述复合物试图防止铅放射性同位素在弱酸性条件下(例如体内)从缀合物中解离。本文的示例使用212Pb、203Pb或64Cu作为结合至DOTAM的放射性同位素，用于癌症的靶向成像和疗法。其他放射性同位素可包括例如铁、钴、锌和密度大于约3.5g/cm3的其他金属。

基于DOTAM的癌症治疗组合物还可以与其他放射性同位素形成稳定的复合物，并由此选择性地将放射性同位素递送至癌细胞并防止所述癌细胞解离，所述解离可在正常细胞中诱导细胞毒性效应。此类组合物由于其特性而可用于以特定的癌症治疗来治疗PSMA肿瘤，其中通过靶向部分(例如奥曲肽酸、奥曲肽或其他生长抑素类似物)将同位素选择性地递送至表达PSMA的癌细胞。

放射性同位素可用于例如经由间接发射来提供α辐射源。放射性同位素(例如，212Pb、203Pb、64Cu、67Cu等)可与螯合剂(例如DOTAM、TCMC等)和靶向部分组合成癌症靶向组合物，以用于将所述组合物快速摄取到癌细胞中。DOTAM螯合剂可用于避免放射性同位素在弱酸性条件下(例如在患者体内)从缀合物中解离。

靶向癌症治疗可涉及使用与螯合剂结合的放射性同位素，所述螯合剂与靶向部分结合，所述靶向部分识别并结合至在特定癌细胞上表达(或被上调)的细胞表面受体。这可导致放射性同位素螯合剂与特定癌细胞结合，从而当放射性同位素经历放射性衰变时对特定癌细胞进行靶向辐射。

癌细胞的治疗(例如，成像和/或凋亡)可涉及使用发射体(例如，发射α(阿尔法)、β(贝塔)、γ(伽马)和/或正电子的放射性同位素)作为放射性同位素(一种或多种)。通过PSMA靶向部分将发射α的放射性同位素递送至所靶向的癌细胞是本领域已知的。这些发射α的放射性同位素可以是特别令人感兴趣的，因为与其他放射性同位素例如177Lu、90Y和/或其他β-发射体相比，所述发射α的放射性同位素具有高LET，并且可以在约1个至约2个癌细胞簇内的约70μm至约100μm长的路径追踪(tracking)内沉积其高能量。这种高LET辐射可不取决于活跃的细胞增殖或氧合，和/或由于发射α的放射性同位素的LET更高，由α粒子导致的所得脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的损伤可比由发射β的放射性同位素导致的损伤更难修复。

发射α的放射性同位素可以具有强有力的LET，并且通常也被限制在癌细胞的内部区域内。来自发射α的放射性同位素的发射也可具有不需要等待癌细胞的生命周期就造成对癌细胞的不可逆损伤如氧合或繁殖的能力。此外，发射α的放射性同位素可导致发展出对β-发射体疗法的抗性的癌细胞的死亡和凋亡。

发射α的放射性同位素可以例如在基于铅的放射性同位素(例如212Pb放射性同位素)的衰变期间产生。212Pb是一种半衰期为约10.6小时的发射β的放射性同位素，具有含有衰变产物的放射性发射谱(profile)，所述衰变产物为具有发射α的放射性同位素的性质的α发射体。因为212Pb衰变成212Bi(其为一种具有约60分钟的半衰期的发射α的放射性同位素)，所述212Bi通过α发射衰变成208Tl(其半衰期为约3min)，所述208Tl通过β发射衰变成208Pb(其是稳定的)；或者所述212Bi通过β发射衰变成212Po(其半衰期为约0.3μs)，所述212Po通过α发射衰变成208Pb。

使用半衰期相对较长的放射性同位素，例如半衰期为约10.6小时的212Pb，可以允许在放射性药房处集中生产经放射性标记的组合物，并运至将其施用于患者的诊所。212Bi的α-发射体衰变可以最大化地发生在癌细胞内，从而一旦在癌细胞内就提供最大的α-辐射损伤和癌细胞的凋亡以及对癌细胞的杀伤。在由212Bi进行α发射后，最终结果是稳定的208Pb。

实施例

非临床研究报告

⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的非临床研究确定了这种试剂在肿瘤器官和正常器官中的时间依赖性积聚。这些研究是在以下三种不同品系的雄性小鼠中生成的过表达PSMA的LNCap和22Rv1来源的异种移植物中进行的：a)无胸腺裸小鼠(Envigo,Indianapolis,IN andTaconic,Rensselaer,NY)；b)NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγ^空)小鼠(Taconic,Rensselaer,NY)；和c)R2G2(Rag2-II2rg双敲除)小鼠(Envigo,Indianapolis,IN)。⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的所有非临床研究均由RadioMedix,Inc.,Headquarter的药物发现和临床前核心实验室(DrugDiscovery and Preclinical Core Facility)进行。

实施例1-在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap和22Rv1来源的异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的PET成像

方法

肿瘤接种

将悬浮在100μL的含50％基质胶(Corning,Corning,NY)的RPMI 1640中的约5×10⁶个LNCap和22Rv1细胞皮下注射到6-7周龄小鼠的上胁腹中。异种移植物是在无胸腺裸小鼠(Envigo,Indianapolis,IN and Taconic,Rensselaer,NY)中生成的。当异种移植肿瘤达到直径为0.25cm³大小时，将所有小鼠随机分组以供用于PET成像和生物分布研究。

PET成像方法和分析

使用GENISYS⁴扫描仪(Sofie Bioscience,Curlver City,CA)进行PET/X射线成像研究。使用异氟烷(在98％氧气中2％)将小鼠麻醉，并且在试剂注射和图像采集期间用加热灯将所述小鼠的温度保持在38℃。所有图像都针对光子衰减进行校正，但是不应用散射校正。使用最大似然预期最大化来创建最终图像体积。静态PET扫描是大致在静脉注射200μL体积的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA后1h、2h、4h时采集的。图像采集时间为10分钟。使用VivoQuant软件(Invicro,Boston,MA)来确定肿瘤、肝脏、肾脏、肌肉和唾液腺的ROI(总和)，其相当于在不同时间点试剂摄取的％ID/g。

结果和结论

⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA PET扫描已经显示，早在注射后1h，来自LNCap异种移植物和22Rv1异种移植物二者的肿瘤中就有试剂积聚。在注射后对试剂在肿瘤中的保留进行了长达4h的跟踪(图1)。由于酶、铜/锌过氧化物歧化酶(SOD)和金属硫蛋白对来自⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的⁶⁴Cu进行酶促反螯合，在肝脏中观察到了试剂的最高脱靶摄取。这种经⁶⁴Cu-DOTA标记的试剂的体内反螯合已经描述于文献[a)Anderson CJ,Ferdani R.Copper-64radiopharmaceuticals for PET imaging of cancer:advances in preclinical andclinical research.Cancer Biother Radiopharm.2009；24(4):379-393；b)L.A.Bass,M.Wang,M.J.Welch,C.J.Anderson,In Vivo Transchelation of Copper-64from TETA-Octreotide to Superoxide Dismutase in Rat Liver,Bioconjugate Chem.20001；14527-532；c)Miao L,St Clair DK.Regulation of superoxide dismutase genes:implications in disease.Free Radic Biol Med.2009；47(4):344-356；d)Ying Wang,Robyn Branicky,Alycia

Siegfried Hekimi,Superoxide dismutases:Dual rolesin controlling ROS damage and regulating ROS signaling,JCB,Jun 2018,217(6)1915-1928]中。Cu/Zn SOD的表达水平和催化活性在生理状态(例如衰老)和年龄相关疾病(例如心血管疾病、神经退行性疾病和癌症)中发生变化[Griess B,Tom E,Domann F,Teoh-Fitzgerald M.Extracellular superoxide dismutase and its role in cancer.FreeRadic Biol Med.2017；112:464-479]。SOD的低表达与降低的癌症患者存活率相关，表明细胞外氧化还原调节的丧失促进了癌症进展。癌症患者中SOD表达的减少应转化为基于⁶⁴Cu-DOTAM的缀合物的更高酶促稳定性，这类似于在⁶⁴Cu-DOTATATE的临床研究中观察到的结果[Johnbeck CB,Knigge U,Loft A,Berthelsen AK,Mortensen J,Oturai P,Langer SW,Elema DR,Kjaer A.,Head-to-Head Comparison of ⁶⁴Cu-DOTATATE and ⁶⁸Ga-DOTATOCPET/CT:A Prospective Study of 59Patients with Neuroendocrine Tumors,J NuclMed.2017Mar,58(3):451-457]。

图1描述了对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植物中⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA(注射剂量45uCi)的microPET成像研究。图像是在注射后1小时采集的。(A)是重建的融合PET/CT扫描，并且(B)是显示所植入的肿瘤的实际大小的小鼠照片。这种试剂保留在LNCap来源的肿瘤和22Rv1来源的肿瘤两者中。

在注射后2h采集的microPET成像研究证实了⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap来源的肿瘤和22Rv1来源的肿瘤中的保留(图2)。这种结果表明，⁶⁴Cu的酶促反螯合发生在刚进行试剂静脉注射后试剂通过血流的初始分布期间，并且这种过程对已经保留在肿瘤中的试剂没有显著影响。

图2描述了在注射后2h进行的对LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究；a)重建的融合PET/CT扫描；b)冠状面视图；c)轴向视图。根据本公开的一个或多个示例，该试剂被保留在LNCap来源的肿瘤和22Rv1来源的肿瘤两者中。

在注射后4h进行的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的后续micoPET成像研究证实了其在LNCap癌细胞和22Rv1癌细胞中的肿瘤保留(图3)。

图3描述了在注射后4h进行的对LNCap(左胁腹，体积500mm³)和22Rv1(右胁腹，体积192mm³)异种移植小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA(62.3uCi)的microPET成像研究；a)重建的PET/CT融合扫描；b)矢状面视图；c)冠状面视图；d)轴向视图。根据本公开的一个或多个示例，该试剂被保留在LNCap肿瘤和22Rv1肿瘤两者中以及非靶向器官肝脏中。

在无胸腺裸小鼠中完成的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的定量PET成像研究允许确定肿瘤器官和正常器官中试剂摄取的时间依赖性差异(图4)。肿瘤中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA积聚在注射后4h达到最高值6.71E+05％ID/g。试剂的肝脏摄取从注射后1h的3.3E+06％ID/g略微降低至24h时间点的2.5E+06％ID/g。在早期时间点(注射后1h)，肾脏和唾液腺中⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的摄取是相当的，然而在24h唾液腺中试剂积聚减少了2倍，而所述试剂在肾脏中的积聚保持几乎不变。

图4示出了标绘22RV1肿瘤和正常器官(肝脏、肾脏、肌肉和唾液腺)中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA分布的时间依赖性变化的图表。

实施例2-在无胸腺裸小鼠中生成的低体积LNCap来源的和22Rv1来源的异种移植物中采集的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的PET成像(肿瘤体积为0.1-0.150mm³)

方法：

肿瘤接种

将悬浮在100μL的含50％基质胶(Corning,Corning,NY)的RPMI 1640中的约5×10⁶个LNCap和22Rv1细胞皮下注射到6-7周龄无胸腺裸小鼠(Envigo,Indianapolis,IN)的上胁腹中。当异种移植肿瘤达到直径为0.1cm³大小时，将所有小鼠随机分组以供用于PET成像和生物分布研究。

PET成像方法和分析

根据研究报告PSMA-001中所述的方案，使用GENISYS⁴扫描仪(Sofie Bioscience,Curlver City,CA)进行PET/X射线成像研究。

结果和结论

⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA在过表达PSMA的肿瘤中的摄取不依赖于肿瘤体积，并且所述试剂可以检测小于150mm³的肿瘤(图5A和图5B)。

图5A描述了对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap(左胁腹)和22Rv1(右胁腹)异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究。扫描是在注射后1h采集的。肿瘤体积低于150mm³。图5B是示出根据本公开的一个或多个示例所植入的肿瘤的大小的小鼠照片。

实施例3-在NOG品系小鼠中的LNCap异种移植物和22Rv1异种移植物中采集的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的PET成像(肿瘤体积为0.1-0.150mm³)

为了评估⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA在不同品系小鼠中的肿瘤积聚和器官分布的差异，在NOG小鼠中生成的异种移植物中进行micro PET成像研究。

方法：

肿瘤接种

将悬浮在100μL的含50％基质胶(Corning,Corning,NY)的RPMI 1640中的约5×10⁶个LNCap和22Rv1细胞皮下注射到6-7周龄NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγ^空)小鼠(Taconic,Rensselaer,NY)的上胁腹中。当异种移植肿瘤达到直径为0.25cm³大小时，将所有小鼠随机分组以供用于PET成像和生物分布研究。

PET成像方法和分析

根据研究报告PSMA-001中所述的方案，使用GENISYS⁴扫描仪(Sofie Bioscience,Curlver City,CA)进行PET/X射线成像研究。

结果和结论

在NOG小鼠中生成的LNCap肿瘤中⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的积聚和保留与在无胸腺裸小鼠中观察到的相似。在注射后1h，肾脏和膀胱中试剂的摄取略高(图6)。

图6描述了对在NOG小鼠中生成的LNCap异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的microPET成像研究；研究是在注射后1h(A)和24h(B)进行的。

实施例4-在无胸腺裸小鼠中的LNCap来源的异种移植物和22Rv1来源的异种移植物中进行的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究。

方法

向荷有LNCap异种移植物和22Rv1异种移植物的小鼠通过尾静脉注射50-100μCi在150-200μL盐水中重建的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA。在注射后1h、2h和24h，在麻醉状态下通过心脏穿刺收集血液，并通过颈椎脱臼处死小鼠。收集心脏、肺、肝脏、胃、胰腺、脾脂肪、肾脏、肌肉、肠、皮肤和肿瘤。对每个器官称重，并用自动γ计数器(2470Wizard2γ计数器，Perkin-Elmer,Waltham,MA)测量组织放射性。计算每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。所有测量值都进行了衰变校正。

结果和结论

⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的肿瘤摄取在注射后2h处于24.8±31.1％ID/g的宽范围内，并在4h时降低至9.7±10.9％ID/g(图7)。在注射后2h测量的肝脏和肾脏中药物的脱靶积聚分别为45.8±6.2％ID/g和20.0±2.9％ID/g。在4h时间点，试剂在肝脏中的积聚进一步减少至17.1±10.1ID/g，并且其肾脏保留减少至13.0±0.6％ID/g。如前所提及，在由过氧化物歧化酶催化的反应中，⁶⁴Cu从DOTAM缀合物中的反螯合可以解释试剂的高肝脏摄取。⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的肾脏保留可与肾近端小管中PSMA受体的表达相关。这些试剂的脱靶摄取不应影响⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的诊断性质。

与4h时间点相比，在注射后24h⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA在肿瘤中的保留没有显著变化(10.0±11.1％ID/g)。在24h时间点，肝脏和肾脏中的试剂摄取分别降至12.4±11.9％ID/g和7.8±7.9％ID/g。

图7示出了标绘在注射后1h、2h和24h进行的对无胸腺裸小鼠中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究的图表。肝脏和肾脏是显示出最高的试剂积聚的脱靶器官。

实施例5-在R2G2品系小鼠中生成的LNCap来源的异种移植物和22Rv1来源的异种移植物中进行的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究。

方法

向荷有LNCap异种移植物和22Rv1异种移植物的R2G2品系小鼠通过尾静脉注射50-100μCi在150-200μL盐水中重建的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA。在注射后1h、2h和24h，在麻醉状态下通过心脏穿刺收集血液，并通过颈椎脱臼处死小鼠。收集心脏、肺、肝脏、胃、胰腺、脾脂肪、肾脏、肌肉、肠、皮肤和肿瘤。对每个器官称重，并用自动γ计数器(2470Wizard2γ计数器，Perkin-Elmer,Waltham,MA)测量组织放射性。计算每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。所有测量值都进行了衰变校正。

结果和结论

在注射后2h在R2G2品系小鼠和NOG品系小鼠中生成的肿瘤(LNCap和22Rv1)中显示出非常相似的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA积聚率。与NOG品系相比，R2G2小鼠品系中反螯合的Cu64的肝脏保留量更高，但是其仍低于在相同时间点在无胸腺裸小鼠中观察到的保留量。在注射后24h测量的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的肿瘤保留量在R2G2品系中比在NOG品系中有利得多。在NOG小鼠中观察到的⁶⁴Cu的较高反螯合率可导致在24h时间点试剂在肿瘤中的较低摄取和在肝脏中显著较高的摄取。

图8示出了标绘在注射后2h和24h进行的对R2G2小鼠的LNCap异种移植物和22RV1异种移植物中以及在注射后1h和24h进行的对NOG小鼠的LNCap异种移植物和22RV1异种移植物中的⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的生物分布研究的图表。

不需要单剂量毒性研究的理由

本文所公开的临床前研究证实了⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA对基于PSMA阳性的LNCap和22Rv1的异种移植物的体内选择性和特异性。⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的肾脏保留与针对其他经放射性标记的PSMA衍生物观察到的肾脏保留相似，并且其与近端小管中PSMA受体的表达相关。在动物模型中观察到的药物的高肝脏摄取是由于过氧化物歧化酶对Cu64的反螯合。因为这种酶在癌症患者中的表达和/或活性降低，所以从缀合物体内释放的⁶⁴Cu也应该减少。

每位患者待施用的DOTAM-PSMA的量不会超过100μg的微剂量量，并且将远低于1期临床试验(NCT01384253)和探索性临床研究(IND编号130960)中使用的PSMA或螯合DOTAM的已知毒性。所有这些结果表明，在⁶⁴Cu-DOTAM-PSMA的eIND临床研究期间，微剂量PET成像研究不需要毒性研究。

实施例6-对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap来源的异种移植物中²¹²Pb-DOTAM-PSMA的生物分布研究

方法

向荷有LNCap异种移植物的无胸腺品系小鼠通过尾静脉注射15μCi在150-200μL盐水中重建的²¹²Pb-DOTAM-PSMA。在注射后1h、3h，在麻醉状态下通过心脏穿刺收集血液，并通过颈椎脱臼处死小鼠。收集心脏、肺、肝脏、胃、胰腺、脾脂肪、肾脏、肌肉、肠、皮肤和肿瘤。对每个器官称重，并用自动γ计数器(2470Wizard2γ计数器，Perkin-Elmer,Waltham,MA)测量组织放射性。计算每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。所有测量值都进行了衰变校正。

结果和结论

²¹²Pb-DOTAM-PSMA的肿瘤摄取在注射后1h在5.7±0.9％ID/g范围内，并且在3h增加至7.2±2.6％ID/g(图9)。通过肾脏从血流中清除该试剂，并且在注射后1h其肾脏保留为32.2±15.6％ID/g，并且在3h时间点下降55％至17.7±9.4％ID/g。²¹²Pb-DOTAM-PSMA的肾脏保留可与肾近端小管中PSMA受体的表达相关。骨和脾脏中没有试剂摄入，这证实了²¹²Pb-DOTAM-PSMA复合物的高体内稳定性。图10示出了在注射后1h和3h的LNCAP异种移植物中²¹²Pb-DOTAM-PSMA积聚的并排比较。

实施例7-对在无胸腺裸小鼠中生成的LNCap来源的异种移植物中²⁰³Pb-DOTAM-PSMA的生物分布研究

为了确定螯合对DOTAM-PSMA的器官分布的影响，使用²⁰³Pb-DOTAM-PSMA进行初始比较生物分布研究。²⁰³Pb是t1/2＝51.9h的γ发射体(279keV)，适用于单光子发射计算机断层摄影(single-photon emission computed tomography,SPECT)成像。²⁰³Pb是²¹²Pbα粒子疗法的理想替代品，因为这两种同位素具有相同的化学性质。

方法

向荷有LNCap异种移植物的无胸腺品系小鼠通过尾静脉注射40μCi在200-250μL盐水中重建的²⁰³Pb-DOTAM-PSMA。在注射后1h和3h，在麻醉状态下通过心脏穿刺收集血液，并通过颈椎脱臼处死小鼠。收集心脏、肺、肝脏、胃、胰腺、脾脂肪、肾脏、肌肉、肠、皮肤和肿瘤。对每个器官称重，并用自动γ计数器(2470Wizard2γ计数器，Perkin-Elmer,Waltham,MA)测量组织放射性。计算每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。所有测量值都进行了衰变校正。

结果和结论

²⁰³Pb-DOTAM-PSMA和²¹²Pb-DOTAM-PSMA两者都显示出非常相似的正常器官分布。这两种试剂的高肾保留量与肾脏中PSMA受体的表达相关，并且也可归因于这些缀合物的+2正电荷。在注射后1h，²⁰³Pb-DOTAM-PSMA的肿瘤摄取在16.1±0.8％ID/g的范围内(图11)。在正常器官例如骨和脾脏中没有试剂的摄取。

在注射后3h，²⁰³Pb-DOTAM-PSMA保留在肿瘤中，并且摄取高于4.8％ID/g。与早期时间点相比，²⁰³Pb-DOTAM-PSMA的肾保留量减少了32％，任何其他正常器官均无附加的试剂摄取。图12表示在注射后3h进行的无胸腺裸小鼠的过表达PSMA的异种移植物中²⁰³Pb-DOTAM-PSMA的生物分布研究。

实施例8-Pb203-RMX-PSMA的放射化学稳定性

为了测试放射化学稳定性，用15mCi(30μl，0.1HCl)放射性标记0.4M NH4OAC(400μl)中的RMX-PSMA(5μg)。反应在10min后完成。在室温下孵育，并将等分试样(200ul)在室温下放置长达72小时。将样品在不进行附加稀释的情况下通过放射/UV HPLC(Shimadzu)分析。选定的色谱如图13A至图13C所示。Pb203-RMX-PSMA合成的放射化学产率高于98％，并且放射性示踪剂在室温下稳定长达72小时。

如本文所提供的实验数据所指示，使用缀合至PSMA受体靶向部分的DOTAM或TCMC螯合的某些放射性同位素的组合提供了治疗特性，例如增加的放射化学稳定性、增强的结合和增加的癌细胞摄取，和/或癌细胞内导致所述癌细胞凋亡的高LET发射和/或靶向生物分布。

本文的方法可以以任何次序进行，并根据需要重复。

虽然参考各种实施方案和利用描述了实施方式，但应理解，这些实施方式是说明性的，并且本发明主题的范围不限于这些实施方式。许多变化、修改、添加和改进都是可能的。例如，可以进行本文所述的部分或全部技术的各种组合。

可以为本文描述为单个实例的组件、操作或结构提供多个实例。一般而言，在示例性配置中作为单独组件呈现的结构和功能可以实现为组合的结构或组件。类似地，作为单个组件呈现的结构和功能可以实现为单独的组件。这些和其他变化、修改、添加和改进可落入本发明主题的范围内。

在以上描述和附图公开了不在本文权利要求(一个或多个)范围内的任何附加主题的情况下，本发明不专用于公众并且保留提交一项或多项申请以要求保护这种附加发明的权利。虽然这里呈现了非常狭窄的权利要求，但是应该认识到，本发明的范围比权利要求书呈现的范围要宽得多。更广泛的权利要求可以在要求本申请的优先权权益的申请中提交。

Claims (14)

1.一种用于治疗过表达PSMA的癌细胞的癌症靶向化合物，所述癌症靶向化合物包含放射性同位素、螯合剂和PSMA靶向部分，其中所述PSMA靶向部分联接至所述螯合剂。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述螯合剂包含氮环结构。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述氮环结构包含DOTAM。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述放射性同位素选自由以下组成的组：⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²⁰³Pb和²¹²Pb。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述PSMA靶向部分包含PSMA受体靶向肽。

6.一种用于诊断过表达PSMA的癌细胞的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的化合物。

7.一种用于治疗过表达PSMA的癌细胞的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的化合物。

8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构

并且其中M是放射性同位素。

9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述放射性同位素选自由以下组成的组：⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²⁰³Pb和²¹²Pb。

10.根据权利要求8所述的化合物，其中所述放射性同位素是⁶⁴Cu。

11.根据权利要求8所述的化合物，其中所述放射性同位素是⁶⁷Cu。

12.根据权利要求8所述的化合物，其中所述放射性同位素是²⁰³Pb。

13.根据权利要求8所述的化合物，其中所述放射性同位素是²¹²Pb。

14.一种用于诊断过表达PSMA的癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含放射性同位素、螯合剂和靶向部分。

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