CN115480023B

CN115480023B - 一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法

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Publication number: CN115480023B
Application number: CN202211365388.6A
Authority: CN
Inventors: 柯润辉; 吴海平; 王烁; 吴奕萱; 段嘉耘
Original assignee: Sinolight Inspection and Certification Co Ltd
Current assignee: Sinolight Inspection and Certification Co Ltd
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-11-03
Also published as: CN115480023A

Abstract

本发明提供一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，涉及食品检测领域。该方法包括：配制标准溶液：称取单糖标准品，加入溶剂溶解并配制成所需浓度的标准溶液；配制供试品溶液：取乳、液态乳制品或固态乳制品配制而成的乳，加入醋酸溶液水解，加入乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液，加入三氟乙酸溶液水解，定容，将定容液进行过滤和净化，得到供试品溶液；含量测定：通过离子色谱‑串联质谱法测定标准溶液以及供试品溶液中单糖的峰面积，根据标准曲线法计算单糖的含量。本发明提供的检测方法线性良好，且该方法的灵敏度、稳定性及重复性好，适用于乳及乳制品中母乳低聚糖五种组成单糖的准确测定。

Description

一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法。

背景技术

母乳低聚糖（Human Milk Oligosaccharides，HMOs）是母乳中含量第三的固体成分，它可以促进肠道中有益菌的生长，让肠道产生对婴儿健康至关重要的短链脂肪酸，进而有效增强婴儿的免疫力。人类母乳中HMOs由5种单体组成：D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、L-岩藻糖（L-fucose，Fuc）和唾液酸（sialic acid，Sia），其中N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是唾液酸最主要的存在形式。

目前，食品中检测低聚糖含量的方法分为两种，一种是先通过水解或酶解等方式将低聚糖分解成小分子的单糖，再推算还原出低聚糖含量；另一种是直接通过低聚糖的标准物质一一进行对应检测。然而，已经确认的母乳低聚糖有200多种，如果直接对每种HMOs去测定，那么所需标准品较多，难度较大，成本较高。此外，唾液酸是一种天然的大脑营养素，能够促进婴儿的智力发育，提高记忆力，对抵抗肠道感染发挥重要作用；L-岩藻糖可以促进婴儿的神经***及免疫***的发育，同时也是HMOs岩藻基结构的重要组成成分。鉴于特定单糖调控不同类型的发育过程，并且牛乳和羊乳中的唾液酸和L-岩藻糖在含量、种类以及结构方面与母乳差异较大，以牛乳或羊乳为基础的婴幼儿配方粉作为母乳的代替品，其营养和健康越来越受到关注，所以对特定类型单糖含量的检测也同样重要。

运用常规方法对母乳低聚糖中的组成单糖进行检测难度较大，因为单糖类化合物之间性质相似，都具有强极性且易溶于水，难溶于一般有机试剂，难挥发，缺少发色和荧光基团的特性。目前，单糖的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）以及离子色谱法（IC）。其中薄层色谱法（TLC）虽然操作较为简单，但是灵敏度低且分离度差。高效液相色谱法（HPLC)和气相色谱法（GC)进行测定时需要通过衍生化来降低极性，或者通过引入紫外光吸收，再或者通过荧光发射基团来进行测定。有时，对于较为复杂的基体，衍生化过程反应不彻底或者生成其他衍生物，都会影响检测结果的准确性。并且这两种方法衍生化条件多，较为苛刻，操作复杂，容易受到样品中共存化合物和离子的干扰。非衍生的糖类化合物通常在反相C₁₈固定相上无法保留而得不到有效分离，因此使用液相色谱或液相色谱-串联质谱容易发生共流出导致定性困难或灵敏度差。相对来说，离子色谱法（IC）检测单糖类化合物，具有无需进行衍生化处理，分离效果好，线性范围宽，灵敏度高的优势。但是由于乳及乳制品基质较为复杂，离子色谱定性、定量手段单一，导致检测灵敏度低。如果仅以保留时间作为定性依据，那么需要被测化合物达到基线分离才能进行准确测定。

现有技术公开了同时测定螺旋藻多糖水解产物中鼠李糖、木糖、***糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸12种糖类化合物的超高效液相色谱-串联质谱分析方法（赵丹等. "超高效液相色谱-串联质谱法测定螺旋藻多糖的单糖组成." 色谱35.4(2017):8.），然而由于糖类极性较大，通常在反相液相色谱柱上难以保留且峰形较差从而得不到有效分离，此外，乳及乳制品基质较为复杂，参照该方法仍无法对母乳低聚糖的多种组成单糖含量进行准确测定。

如何提供一种选择性强、灵敏度高、可以准确测定乳及乳制品中母乳低聚糖的多种组成单糖含量的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。目前，采用离子色谱-串联质谱法（IC-MS/MS）对乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖进行检测的方案未见报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中对母乳低聚糖中的组成单糖进行检测难度较大的缺陷，从而提供一种新的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，所述组成单糖为L-岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸中的至少一种，所述方法包括以下步骤：

（1）配制标准溶液：称取单糖标准品，加入溶剂溶解并配制成所需浓度的标准溶液；

（2）配制供试品溶液：取乳、液态乳制品或固态乳制品配制而成的乳，加入醋酸溶液水解，加入乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液，加入三氟乙酸溶液水解，定容，将定容液进行过滤和净化，得到供试品溶液；

（3）含量测定：通过离子色谱-串联质谱法测定标准溶液以及供试品溶液中单糖的峰面积，根据标准曲线法计算单糖的含量，

其中，色谱条件包括：流动相A：水，流动相B：250mmol/L的NaOH溶液，流动相C：500mmol/L的NaAc溶液，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：0.00~12.00min，A：94%，B：6%，C：0%；12.00~12.10min，A：94%→30%，B：6%→40%，C：0%→30%；12.10~17.00min，A：30%，B：40%，C：30%；17.00~17.10min，A：30%→60%，B：40%，C：30%→0%；17.10~22.00min，A：60%，B：40%，C：0%；22.00~22.10min，A：60%→94%，B：40%→6%，C：0%；22.10~27.00min，A：94%，B：6%，C：0%。

进一步地，步骤（3）中，采用离子色谱仪和串联质谱仪进行检测，所述离子色谱仪与所述串联质谱仪相连且两者之间设置有三通管，所述三通管不连通所述离子色谱仪与所述串联质谱仪的一端用于收集废液。

进一步地，步骤（3）中，色谱条件包括：Dionex ICS3000型离子色谱仪；DionexIonPac PA10型阴离子分析柱，250mm×4mm；Dionex IonPac PA10型保护柱，50mm×4mm；Dionex ADRS 600阴离子抑制器，4mm，外接水模式，抑制电流297mA。

进一步地，步骤（3）中，色谱条件包括：柱温25~30℃；检测池温度30~35℃；进样量20~25μL；流速0.6~0.8mL/min。

进一步地，步骤（3）中，色谱条件包括：柱温30℃；检测池温度35℃；进样量25μL；流速0.8mL/min。

进一步地，步骤（3）中，质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；电离模式：负离子模式；扫描方式：多级反应监测模式；调节进入串联质谱仪的流速为0.3~0.4mL/min。

进一步地，步骤（3）中，质谱条件包括：调节进入串联质谱仪的流速为0.4mL/min。

进一步地，步骤（3）中，质谱条件包括：Waters TQ Detector三重四极杆串联质谱仪；毛细管电压3.00kV；锥孔气体流量50-150L/h；碰撞气体流量0.15mL/min；碰撞池出口电位5V；脱溶温度500℃；脱溶气体流量700-1000L/h。

进一步地，步骤（3）中，质谱条件包括：锥孔气体流量为50L/h；脱溶气体流量为700L/h。

进一步地，步骤（3）中，质谱条件包括：

L-岩藻糖定量离子对：m/z 163.0/89.10，碰撞能7V；L-岩藻糖定性离子对：m/z163.0/59.10，碰撞能12V；锥孔电压17V；

半乳糖定量离子对：m/z 179.0/89.10，碰撞能10V；半乳糖定性离子对：m/z179.0/59.10，碰撞能18V；锥孔电压15V；

葡萄糖定量离子对：m/z 179.0/89.10，碰撞能9V；葡萄糖定性离子对：m/z 179.0/59.10，碰撞能12V；锥孔电压15V；

N-乙酰氨基葡萄糖定量离子对：m/z 220.2/119.20，碰撞能7V；N-乙酰氨基葡萄糖定性离子对：m/z 220.2/89.20，碰撞能12V；锥孔电压18V；

N-乙酰神经氨酸定量离子对：m/z 308.2/87.20，碰撞能18V；N-乙酰神经氨酸定性离子对：m/z 308.2/290.20，碰撞能7V；锥孔电压19V。

进一步地，步骤（1）中，所述溶剂为含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中水和甲醇的体积比为4：1。

进一步地，步骤（2）中，乳或液态乳制品、醋酸溶液、乙腈、三氟乙酸溶液的体积比为200：200：400：1，所述醋酸溶液的质量分数为1%，所述三氟乙酸溶液的浓度为0.1mol/L。

进一步地，步骤（2）中，所述离心的条件为：转速8000r/min，时间10min；加入三氟乙酸溶液水解的条件为：温度80℃，时间20~60min。

进一步地，步骤（2）中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：温度80℃，时间40min。

进一步地，步骤（2）中，使用含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液定容，所述甲醇水溶液中水和甲醇的体积比为4：1，乳或液态乳制品与定容液的体积之比为1：50。

进一步地，步骤（2）中，所述过滤和净化的条件为：将定容液依次过0.22μm滤膜和IC-RP固相萃取小柱，收集滤液。

进一步地，步骤（2）中，当待测样品为固体乳制品时，将其配制成乳的方法为：取固体乳制品于超纯水中，加热使其充分溶解，其中固体乳制品与超纯水的质量体积比为0.1g/mL。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明首次提出通过离子色谱-串联质谱法（IC-MS/MS）对乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，将离子色谱对极性物质的高分离能力和三重四极杆质谱的高选择性、高灵敏度监测能力及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，通过验证适用于乳及乳制品这种复杂基质中母乳低聚糖五种组成单糖（L-岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸）的分离和检测，不仅可以实现单糖与基质杂质的分离，而且可以对其结构进行确证，提高检测的灵敏度和准确性。

2.本发明提供的检测方法线性良好，且该方法的灵敏度、稳定性及重复性好，适用于乳及乳制品中母乳低聚糖五种组成单糖的准确测定，为生产企业的质量控制和食品质量***门的监督提供了强有力的技术支持。

3.本发明优选在离子色谱仪中增加配置ADRS 600型抑制器，这是因为离子色谱流动相为强碱性物质（NaOH、NaAc），这类物质在使用ESI源测定时无法挥发，腐蚀性物质会堵在进样口，对仪器的损伤较大，在测定时需要避免难挥发缓冲盐进入质谱检测器，离子色谱中的电解抑制器可以实现在线除盐，消除洗脱液中的盐或碱对ESI源的影响和对质谱部件的损害。通过调节抑制器的电流，使抑制器电解外接水产生H⁺，通过阳离子交换膜使Na⁺与H⁺进行交换然后排至废液，最终进入质谱的为经过抑制器抑制后的产物，纯水和少量乙酸，进而消除无机酸和碱对质谱检测器的影响。

附图说明

图1是本发明实施例所用仪器的连接关系示意图；

图2是本发明配制的标准品混合液的总离子流图；

图3是本发明采用不同水解时间所得的供试品溶液中五种单糖对应的峰面积统计图；

图4是本发明采用不同色谱柱的检测结果图，其中，a为采用Dionex CarbonPacPA1色谱柱的总离子流图；b为采用Dionex CarbonPac PA20色谱柱的总离子流图；c为采用Dionex CarbonPac PA10色谱柱的总离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细地阐述本发明的技术特点。

1.标准品

L-岩藻糖（L-Fucose，纯度98%，北京Solarbio科技有限公司），半乳糖（Galactose，纯度99.9%，坛墨质检标准物质中心）、葡萄糖（Glucose，纯度98.7%，坛墨质检标准物质中心）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetyl-D-Glucosamine，纯度98%，北京Solarbio科技有限公司）、N-乙酰神经氨酸（N-Acetylmeuraminic acid，纯度98%，北京Solarbio科技有限公司）。

2.仪器与设备

Dionex ICS3000型离子色谱仪（美国Dionex公司）、安培检测器和Chromeleon6.70色谱工作站；Waters TQD三重四极杆串联质谱仪（MS/MS）（日本Waters公司），配有电喷雾离子化源（ESI）和LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站；超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）；Dionex IonPac^TM PA10型阴离子分析柱（250mm×4mm，美国Thermo公司）；Dionex IonPac^TM PA10型保护柱（50mm×4mm，美国Thermo公司）；Dionex ADRS 600 阴离子抑制器（4mm，美国Thermo公司）；涡旋混合器（德国IKA）；Milli-Q超纯水纯化***（美国Millipore公司）；0.22μm滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）；IC-RP固相萃取小柱（博纳艾杰尔科技公司）。

3.样品前处理

称取待测的婴幼儿配方奶粉1g于10mL超纯水中，加热至50℃，使奶粉充分溶解；吸取奶粉溶解液200μL于离心管中，加入200μL质量分数1%的醋酸溶液，再加入400μL乙腈沉淀蛋白，混匀后冰浴10min，在8000r/min条件下离心10min，将上清液移入新的离心管；于上清液中加入1mL浓度0.1mol/L的三氟乙酸溶液，80℃水解40min，取出后冷却至室温；用含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液（水与甲醇的体积比4：1）定容至10mL，混匀，得定容液；将定容液依次过0.22μm滤膜和IC-RP固相萃取小柱，收集滤液，得到供试品溶液。

4.仪器条件

色谱条件：Dionex ICS3000型离子色谱仪；Dionex IonPac^TM PA10型阴离子分析柱，250mm×4mm；Dionex IonPac^TM PA10型保护柱，50mm×4mm；Dionex ADRS 600阴离子抑制器，4mm，外接水模式，抑制电流297mA；柱温30℃；检测池温度35℃；进样量25μL；流动相A：水，流动相B：250mmol/L的NaOH溶液，流动相C：500mmol/L的NaAc溶液，流速0.8mL/min，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：Waters TQ Detector三重四极杆串联质谱仪；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多级反应监测模式；电离模式：负离子模式；毛细管电压3.00kV；锥体气体流量50L/h；碰撞气体流量0.15mL/min；脱溶温度500℃；脱溶气体流量700L/h。使用分析软件(MassLynx，4.1 版)进行***控制和数据处理。进入串联质谱仪的流速为0.4mL/min。

五种单糖的质谱参数见表2。

表2 五种单糖的质谱参数

仪器连接方式如图1所示。检测***主要由离子色谱仪和串联质谱仪组成，洗脱液经泵进入离子色谱仪，标准溶液以及供试品溶液通过注射器进入离子色谱仪，通过PA10型号色谱柱分离待测物，Dionex ADRS 600阴离子抑制器在线除盐，消除洗脱液中的盐或碱对ESI源的影响和对质谱部件的损害。由于PA10色谱柱的最佳流速为0.8mL/min，若该流速直接进入质谱检测器会使溶剂挥发不完全，未雾化的液滴还有可能进入质谱，污染质谱内部，同时使背景噪音增大影响检测，所以在进入质谱检测器前安装三通管来进行分流，将部分液体作为废液引出，使进入质谱的流速保持在0.4mL/min，在保证被测物质良好分离的情况下，能够以适于质谱检测的流速进入质谱，从而得到良好的检测结果。

5.五种单糖的分离效果

将五种单糖标准样品（岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰神经氨酸）溶于含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液（水：甲醇=4：1）中，得到标准品混合液，其中每种单糖的质量浓度均为5mg/L，岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰神经氨酸的总离子流图如图2所示（各出峰位置代表的化合物如下：1-L-岩藻糖、2-半乳糖、3-葡萄糖、4-N-乙酰氨基葡萄糖、5-N-乙酰神经氨酸）。由图2可见采用前述仪器条件实现了五种单糖的基线分离，峰型良好，可以用于婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖组成多糖的含量检测。

6.线性范围、检出限和定量限

分别称取五种单糖标准品1mg于1mL容量瓶中，加溶剂（含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液，甲醇水溶液中水和甲醇的体积比为4：1）溶解，定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度1mg/mL的单标准储备液，于-18℃下避光保存；用相同溶剂稀释并配制成中间储备液，于4℃下避光保存；用相同溶剂对中间储备液进行逐级稀释，配制成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0μg/L的系列混合标准溶液，临用现配。

在前述色谱及质谱条件下检测各标准溶液单糖的峰面积，并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制单糖的标准工作曲线。以信噪比为3确定方法的检出限（LOD），以信噪比为10确定方法的定量限（LOQ）。评价结果如表3所示。

表3 五种单糖的线性范围及检出限评价结果

如表3所示，五种单糖的线性关系良好，相关系数均大于0.995。

7.精密度

称取五种单糖标准品分别用含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液（水和甲醇的体积比为4：1）配制成浓度5mg/L的标准溶液，在前述色谱及质谱条件下连续进样6次，记录单糖的峰面积并计算离子峰面积的相对标准偏差RSD，分别为：L-岩藻糖5.8%、半乳糖3.1%、葡萄糖5.5%、N-乙酰氨基葡萄糖5.2%、N-乙酰神经氨酸3.2%，结果表明此方法的精密度较为良好。

8.加标回收率

取空白奶粉样品，按照样品本底含量的50%、100%和200%三个水平加入标准样品，按照前述样品的前处理方法配制供试品溶液（在前述方法基础上将供试品溶液稀释5倍进样），在前述色谱及质谱条件下采用标准曲线法对加标样品中五种单糖含量进行测定，取6份平行样本，测定结果取平均值，计算回收率及相对标准偏差，其中，加标回收率=（加标供试品溶液测定值-供试品溶液测定值）/加标量×100%，结果如表4所示。

表4 奶粉中五种单糖的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

9.样品测定

实施例1

本实施例的待测样品为市售的两种没有添加母乳低聚糖的婴幼儿配方奶粉（编号1、2）和两种添加母乳低聚糖的婴幼儿配方奶粉（编号3、4）。在前述色谱及质谱条件下采用标准曲线法对四种样品中五种单糖含量进行测定，每种样品平行测定3次，结果为3次测定结果的平均值，如表5所示。

表5 婴幼儿配方奶粉中的母乳低聚糖组成单糖含量(n=3)

婴幼儿配方奶粉1是以羊奶粉为基底的配方奶粉，其L-岩藻糖含量较高，说明羊奶粉中以L-岩藻糖基化的中性低聚糖含量较多，所以在进行人工添加时，可适当的增加酸性母乳低聚糖的种类及含量。婴幼儿配方奶粉2是以牛奶粉为基底的配方奶粉，其L-岩藻糖含量未检出，而N-乙酰神经氨酸含量较高。说明此类奶粉中含有唾液酸残基的酸性低聚糖含量较多，可以通过添加中性低聚糖的种类和含量来平衡营养。婴幼儿配方奶粉3和4是来自同一品牌，不同年龄段的添加HMOs的奶粉样品，可以看出二者五种单糖含量差异不大，较高年龄段奶粉3含量略低于低年龄段奶粉4含量，这与人体母乳中的母乳低聚糖含量变化趋势相同，酸性低聚糖及中性低聚糖含量较为均衡。

实施例2

本实施例提供检测母乳中母乳低聚糖的组成单糖含量的检测方法，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，样品的前处理方法为：吸取母乳200μL于离心管中，加入200μL质量分数1%的醋酸溶液，再加入400μL乙腈沉淀蛋白，混匀后冰浴10min，在8000r/min条件下离心10min，将上清液移入新的离心管；于上清液中加入1mL浓度0.1mol/L的三氟乙酸溶液，80℃水解40min，取出后冷却至室温；用含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液（水与甲醇的体积比4：1）定容至10mL，混匀，得定容液；将定容液过0.22μm滤膜，收集滤液，得到供试品溶液。

实施例3

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，样品的前处理方法中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：80℃水解20min。

实施例4

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，样品的前处理方法中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：80℃水解30min。

实施例5

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，样品的前处理方法中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：80℃水解50min。

实施例6

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，样品的前处理方法中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：80℃水解60min。

将按照实施例1和实施例3~6的方法配制的供试品溶液（均用婴幼儿配方奶粉配制）在前述色谱条件和质谱条件下进行测定，记录峰面积，结果如图3所示，可见，加入三氟乙酸溶液在80℃下水解40min时单糖的水解效果最好。

实施例7

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，色谱条件中，采用Dionex CarbonPac PA1色谱柱。

实施例8

本实施例对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，其方法参照实施例1，不同之处仅在于，色谱条件中，采用Dionex CarbonPac PA20色谱柱。

分别按照实施例1和实施例7~8的方法对婴幼儿配方奶粉中母乳低聚糖的组成单糖含量进行检测，结果如图4所示，其中a为采用Dionex CarbonPac PA1色谱柱的总离子流图；b为采用Dionex CarbonPac PA20色谱柱的总离子流图；c为采用Dionex CarbonPacPA10色谱柱的总离子流图。由图可知，Dionex CarbonPac PA1无法将半乳糖和葡萄糖分离完全，影响待测物质含量的准确测定；Dionex CarbonPac PA20色谱柱所需要检测时间较长，且峰形欠佳；Dionex IonPac PA10可实现五种单糖峰形的基线分离，适用于五种组成单糖含量的检测。图中各出峰位置代表的化合物如下：1-L-岩藻糖、2-半乳糖、3-葡萄糖、4-N-乙酰氨基葡萄糖、5-N-乙酰神经氨酸。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，其特征在于，所述组成单糖为L-岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸中的至少一种，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用离子色谱仪和串联质谱仪进行检测，所述离子色谱仪与所述串联质谱仪相连且两者之间设置有三通管，所述三通管不连通所述离子色谱仪与所述串联质谱仪的一端用于收集废液。

3.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，其特征在于，步骤（3）中，色谱条件包括：Dionex ICS3000型离子色谱仪；Dionex IonPac PA10型阴离子分析柱，250mm×4mm；Dionex IonPac PA10型保护柱，50mm×4mm；Dionex ADRS 600阴离子抑制器，4mm，外接水模式，抑制电流297mA；

柱温25~30℃；检测池温度30~35℃；

进样量20~25μL；流速0.6~0.8mL/min。

4.根据权利要求3所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，其特征在于，步骤（3）中，色谱条件包括：柱温30℃；检测池温度35℃；进样量25μL；流速0.8mL/min。

5.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（3）中，质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；电离模式：负离子模式；扫描方式：多级反应监测模式；调节进入串联质谱仪的流速为0.3~0.4mL/min。

6.根据权利要求5所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（3）中，质谱条件包括：调节进入串联质谱仪的流速为0.4mL/min。

7.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（3）中，质谱条件包括：Waters TQ Detector三重四极杆串联质谱仪；毛细管电压3.00kV；锥孔气体流量50~150L/h；碰撞气体流量0.15mL/min；碰撞池出口电位5V；脱溶温度500℃；脱溶气体流量700~1000L/h。

8.根据权利要求7所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（3）中，质谱条件包括：锥孔气体流量为50L/h；脱溶气体流量为700L/h。

9.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（1）中，所述溶剂为含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中水和甲醇的体积比为4：1。

10.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（2）中，乳或液态乳制品、醋酸溶液、乙腈、三氟乙酸溶液的体积比为200：200：400：1，所述醋酸溶液的质量分数为1%，所述三氟乙酸溶液的浓度为0.1mol/L；所述离心的条件为：转速8000r/min，时间10min；加入三氟乙酸溶液水解的条件为：温度80℃，时间20~60min；使用含有10mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液定容，所述甲醇水溶液中水和甲醇的体积比为4：1，乳或液态乳制品与定容液的体积之比为1：50。

11.根据权利要求10所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（2）中，加入三氟乙酸溶液水解的条件为：温度80℃，时间40min。

12.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（2）中，所述过滤和净化的条件为：将定容液依次过0.22μm滤膜和IC-RP固相萃取小柱，收集滤液。

13.根据权利要求1所述的检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法，步骤（2）中，当待测样品为固体乳制品时，将其配制成乳的方法为：取固体乳制品于超纯水中，加热使其充分溶解，其中固体乳制品与超纯水的质量体积比为0.1g/mL。