CN115469041B - 一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测定方法，采用UPLC‑MS/MS法，同时测定九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的含量。本发明能快速、有效地对九味补血口服液中16种成分的含量进行测定，方法灵敏度高、专属性及重现性良好，检测结果准确、可靠，为提高九味补血口服液的质量控制技术水平和健全质量控制体系提供有效方法，从而保证九味补血口服液的质量均一、稳定及临床疗效和安全。

Description

一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测定方法

技术领域

本发明属于中药质量控制技术领域，涉及一种九味补血口服液中药制剂 的一测多评含量测定方法。

背景技术

九味补血口服液由人参、黄芪、绞股蓝等9味药材组成，具有益气补血、 健脾益胃的功效，用于气血两虚之失眠健忘、心悸怔仲、头晕目眩、神疲乏 力、短气自汗、纳呆食少等症的治疗，补气补血、促睡眠效果良好。公开号 CN1883593A，其发明名称“九味补血口服液”的发明专利公开了该中药制剂制 备方法及用途。

九味补血口服液的物质基础研究相对较少，现行的质量标准

[YBZ00362007-2015Z]和文献收载或报道了本品当归、甘草、陈皮、人参、绞股蓝、黄芪和五味子等药材的薄层鉴别，以及当归中阿魏酸、五味子中五味 子醇甲和黄芪中黄芪甲苷的含量测定，成分的质量控制方法相对单一，缺乏 ***性和全面性。因此，深入九味补血口服液的物质基础研究及开发一种同 时测定其中多种活性成分的含量测定方法作为其质量控制手段势在必行。本 发明研究建立和验证了一种基于超高效快速液相色谱-质谱联用 (UPLC-MS/MS)技术同时测定九味补血口服液中多种成分含量的测定方法，该 方法快速、准确、灵敏度高、专属性强、重现性好，为建立完善的质量控制技术和生产全过程的质量控制体系提供可靠技术，提升九味补血口服液的质 量控制水平，保障产品质量和临床疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测 定方法，是一种基于超高效快速液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术同时测定 一种益气补血、促睡眠中药复方制剂九味补血口服液中多种成分含量的测定 方法，建立一种能同时测定九味补血口服液中药制剂中16种主要成分的含量 测定方法，以提升九味补血口服液的质量控制水平。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：

一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测定方法，采用 UPLC-MS/MS法，同时测定九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的含 量；

(1)建立16种化学成分的标准曲线；

(2)获得九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的多反应离子色谱图， 精密吸取九味补血口服液中药制剂1ml，置于20ml容量瓶，加入甲醇，超声 溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

在与以上步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，将供试品溶液注入液 质联用仪中，获得复方制剂中各化学成分的多反应离子色谱图；

(3)测定九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的含量

根据九味补血口服液中药制剂中各化学成分的多反应离子色谱图的峰面 积，及相应化学成分的标准曲线，测定复方制剂中各化学成分的含量。

所述16种化学成分包括：人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、 人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陈皮素、 五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素、Z-藁本内酯、甘草苷、甘草酸铵。

步骤(1)建立16种化学成分的标准曲线步骤为：分别精密称定对照品 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊 异黄酮、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、 五味子甲素、藁本内酯、甘草苷、甘草酸铵，用体积分数为95％的甲醇溶解， 制成一定浓度的各对照品储备溶液；分别精密吸取16种对照品储备溶液，用 体积分数为95％的甲醇稀释成一系列不同浓度的16种化学成分的对照品混合溶液；在设定的色谱条件和质谱条件下，将各浓度的对照品混合溶液分别注 入液质联用仪中，获得各对照品在不同浓度下的多反应离子色谱图；以各对 照品的色谱峰峰面积为纵坐标，以各对照品的浓度为横坐标，通过线性回归 运算得到各化学成分的标准曲线。

设定的色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动 相：A相为0.1％甲酸或水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.3mL/min； 进样量：1μl；

洗脱程序为：0-5min，2％B；5-30min，2％-80％B；30-35min，80％-95％B。

设定的质谱条件包括：

离子化方式：电喷雾离子化；多反应离子监测方式，全扫描模式；离子 喷雾电压：-4500V或5500V；离子源压力：15psi；气帘气压力：20psi；干燥 气体和雾化气体：氮气。

质谱条件及离子模式如下表:

在本发明的一种具体实施方式中，分别以S/N＝3和S/N＝10时各对照品的 浓度作为最低检测限和最低定量限。

本发明采用UPLC-MS/MS法，同时测定九味补血口服液中16种化学成 分的含量，具有灵敏度高，可靠性强，高效快速的特点，通过测定九味补血 口服液中16种化学成分的含量，可以更有效地对九味补血口服液进行质量控 制，从而保证九味补血口服液的临床疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简要说明。

图1为对照品中藁本内酯在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图2为对照品中毛蕊异黄酮在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图3为对照品中橘皮素在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图4为对照品中川陈皮素在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图5为对照品中五味子醇甲在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图6为对照品中五味子甲素在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图7为对照品中五味子乙素在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图8为对照品中黄芪甲苷在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图9为对照品中甘草苷在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图10为对照品中柚皮苷在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图11为对照品中橙皮苷在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图12为对照品中甘草酸铵在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图13为对照品中人参皂苷Rg1在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图14为对照品中人参皂苷Re在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图15为对照品中人参皂苷Rd在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图16为对照品中人参皂苷Rb1在一定浓度下的多反应离子色谱图；

图17为九味补血口服液供试品中藁本内酯在一定浓度下的多反应离子 色谱图；

图18为九味补血口服液供试品中毛蕊异黄酮在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图19为九味补血口服液供试品中橘皮素在一定浓度下的多反应离子色 谱图；

图20为九味补血口服液供试品中川陈皮素在一定浓度下的多反应离子 色谱图；

图21为九味补血口服液供试品中五味子醇甲在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图22为九味补血口服液供试品中五味子甲素在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图23为九味补血口服液供试品中五味子乙素在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图24为九味补血口服液供试品中黄芪甲苷在一定浓度下的多反应离子 色谱图；

图25为九味补血口服液供试品中甘草苷在一定浓度下的多反应离子色 谱图；

图26为九味补血口服液供试品中柚皮苷在一定浓度下的多反应离子色 谱图；

图27为九味补血口服液供试品中橙皮苷在一定浓度下的多反应离子色 谱图；

图28为九味补血口服液供试品中甘草酸铵在一定浓度下的多反应离子 色谱图；

图29为九味补血口服液供试品中人参皂苷Rg1在一定浓度下的多反应 离子色谱图；

图30为九味补血口服液供试品中人参皂苷Re在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图31为九味补血口服液供试品中人参皂苷Rd在一定浓度下的多反应离 子色谱图；

图32为九味补血口服液供试品中人参皂苷Rb1在一定浓度下的多反应 离子色谱图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能， 解析本发明的优点和精神，下面通过实施例予以进一步阐释，但不构成对本 发明的限制。

以下为实施例中所用到的相关试验仪器、标准品、试剂及样品：

实验仪器：

超高效快速液相色谱***(ExionLC AD)，含在线真空脱气机、二元泵、 自动进样器、柱温箱(日本岛津)；

Sciex三重四级杆串联质谱检测器(SCIEX QTRAP Triple Quad5500+)，含 电喷雾离子源(ESI源)，Analyst软件(美国Sciex)；

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)(美 国Waters)。

Milli-Q去离子水***(美国Millipore)；KQ-500DB型数控超声波清洗器。

对照品：人参皂苷Rg1(批号：110703-202034)、人参皂苷Re(批号： 110754-202129)、人参皂苷Rb1(批号：110704-202028)、黄芪甲苷(批号： 110781-202118)、五味子醇甲(批号：110857-201815)、藁本内酯(批号： 111737-201910)均购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rd(批号：5826)、 橙皮苷(批号：5836)、柚皮苷(批号：10668)、甘草苷(批号：9654)、 甘草酸铵(批号：10845)、橘皮素(批号：10027)、川陈皮素(批号：6082)、 五味子乙素(批号：8366)、毛蕊异黄酮(批号：10659)、五味子甲素(批 号：7954)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

HPLC级乙腈、HPLC级甲醇、HPLC级甲酸(美国Fisher)；去离子水；

九味补血口服液样品：6个不同批次的九味补血口服液，广西白云山盈康 药业有限公司生产。

实施例1基于UPLC-MS技术同时测定九味补血口服液中多种成分含量方 法的建立。

1、供试品溶液的制备

精密吸取本品1ml，置于20ml容量瓶，加入适量甲醇，超声溶解，定容 至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

采用ACQUITY I-CLASS Plus超高效液相色谱-Xevo G2-XS四级杆飞行 时间质谱(美国Waters公司)对九味补血口服液样品溶液中的主要成分进行 了定性研究，共分离了136个化合物，主要包括皂苷类、木脂素类、黄酮类、 苯酞类、萜类、有机酸等化合物，本发明所选取的16个化合物为已与对照品 的色谱、质谱信息进行比对所确证的化合物，该16个化合物包含了九味补血 口服液中含量较高的化合物，包括源于君药人参的4个物质和黄芪的2个物质，源于臣药陈皮的4个物质、五味子的3个物质和当归的1个物质，以及 源于使药甘草的2个物质。

2、将九味补血口服液样品溶液进行UPLC-MS检测分析：

色谱条件：ExionLC AD超高效快速液相色谱***，色谱柱为HSS T3(2.1 mm×100mm，1.8μm)，柱温30℃，流速为0.3mL/min，进样体积为1μL，流 动相A为0.1％甲酸(正离子模式)或水(负离子模式)、流动相B相为乙腈， 梯度洗脱条件：0-5min，2％B；5-30min，2％-80％B；30-35min，80％-95％。

质谱分析条件：Sciex三重四级杆串联质谱检测器，Analyst软件(美国 Sciex)；离子化方式：电喷雾离子化；多反应离子监测方式，全扫描模式；离 子喷雾电压：-4500V或5500V；离子源压力：15psi；气帘气压力：20psi；干 燥气体和雾化气体：氮气。定量采用多重反应监测(MRM)模式，监测化合物 从母离子到某一特定子离子的裂解过程。

优化后的MRM条件见表1所示。

表1：九味补血口服液中16个化合物的MRM参数

表1

3、方法学考察

(1)标准曲线、定量限及检测限

分别精密吸取对照品混合储备液，用95％甲醇稀释成一系列浓度梯度的 混合对照品溶液(n＝6)，每个浓度的对照品进样1μL分析，得到各对照品在不 同浓度下的多反应离子色谱图，以各对照品的色谱峰峰面积对浓度进行线性回归，得到各成分的标准曲线。

将该混合对照品溶液逐步稀释，分别以S/N＝3和S/N＝10时各对照品的浓 度作为检测限(LOD)和定量限(LOQ)。所得结果如表2所示，实验结果表明各 化合物的线性相关系数良好，定量限及检测限符合检测要求。

表2九味补血口服液中16个化合物的标准曲线、线性范围、检测限和定 量限

(2)精密度、重复性、稳定性

精密移取九味补血口服液1ml，置于20ml容量瓶，加入适量甲醇，超声 溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。按上述 色谱条件，重复进样6次，测得各成分浓度，计算其RSD值，以考察仪器精 密度。

精密移取九味补血口服液1ml，置于20ml容量瓶，加入适量甲醇，超声 溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。平行制 备6份，分别按上述色谱条件进样，测得各成分浓度，计算其RSD值，以考察方法重复性。

精密移取九味补血口服液1ml，置于20ml容量瓶，加入适量甲醇，超声 溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。分别室 温放置0，3，6，12，24h后，按上述色谱条件进样，测得各成分浓度，计算 其RSD值，以考察供试品溶液中16种成分室温放置的稳定性。

精密度、重复性和稳定性考察的所得结果如表3所示，实验结果表明其 均符合检测要求。

(3)准确性

采用加样回收法测定。精密移取九味补血口服液0.5ml，置于20ml容量 瓶，分别加入一定量含16个成分的混合对照品溶液，95％甲醇定容至刻度， 摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。平行制备6份，分别按上述 色谱条件进样，测得各成分浓度，计算加样回收率与RSD值，以考察方法准 确度。

准确性考察结果如表3所示，实验结果表明其符合检测要求。

表3九味补血口服液中16个化合物的精密度，重复性，稳定性和准确性

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实施例2九味补血口服液样品中16种成分含量的同时测定

根据实施例1建立的方法，对6批九味补血口服液进行含量测定。制备6 个批次九味补血口服液的供试品溶液，制备方法为：精密移取九味补血口服 液1ml，置于20ml容量瓶，加入适量甲醇，超声溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。分别按上述色谱条件进样1μL，记录 测定成分的峰面积，代入标准曲线计算含量(CA，μg/mL)，根据CA×20计算 九味补血口服液中该化合物的含量，结果如表4所示。

表4 6批九味补血口服液样品中16个化合物的含量(μg/mL)

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综上所述，本发明基于UPLC-MS/MS技术同时测定九味补血口服液中多 种成分含量的方法，其精密度、重复性、准确性良好；本发明的技术方案具 有可行性和先进性。利用本发明的测定方法，可以进一步提升九味补血口服 液的质量控制水平。

Claims (2)

1.一种九味补血口服液中药制剂的一测多评含量测定方法，其特征在于，采用UPLC-MS/MS法，同时测定九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的含量；

(1)建立16种化学成分的标准曲线；

(2)获得九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的多反应离子色谱图，精密吸取九味补血口服液中药制剂1ml，置于20ml容量瓶，加入甲醇，超声溶解，定容至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

在与以上步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，将供试品溶液注入液质联用仪中，获得九味补血口服液中药制剂中各化学成分的多反应离子色谱图；

(3)测定九味补血口服液中药制剂中16种化学成分的含量；

根据九味补血口服液中药制剂中各化学成分的多反应离子色谱图的峰面积，及相应化学成分的标准曲线，测定九味补血口服液中药制剂中各化学成分的含量；

所述16种化学成分包括：人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素、Z-藁本内酯、甘草苷、甘草酸铵；

设定的色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.1%甲酸或水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：30°C；流速：0.3mL/min；进样量：1μl；

洗脱程序为：0-5min，2%B；5-30min，2%-80%B；30-35min，80%-95%B；

设定的质谱条件包括：

离子化方式：电喷雾离子化；多反应离子监测方式，全扫描模式；离子喷雾电压：-4500V或5500V；离子源压力：15psi；气帘气压力：20psi；干燥气体和雾化气体：氮气；

质谱条件及离子模式如下表:

。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）建立16种化学成分的标准曲线步骤为：分别精密称定对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素、藁本内酯、甘草苷、甘草酸铵，用体积分数为95%的甲醇溶解，制成一定浓度的各对照品储备溶液；分别精密吸取16种对照品储备溶液，用体积分数为95%的甲醇稀释成一系列不同浓度的16种化学成分的对照品混合溶液；在设定的色谱条件和质谱条件下，将各浓度的对照品混合溶液分别注入液质联用仪中，获得各对照品在不同浓度下的多反应离子色谱图；以各对照品的色谱峰峰面积为纵坐标，以各对照品的浓度为横坐标，通过线性回归运算得到各化学成分的标准曲线。