CN113866306B - 一种药物制剂的hplc特征图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法。本发明还提供一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法在药物制剂的质量检测中的用途。本发明进一步提供了一种药物制剂的标准特征图谱的构建方法。本发明更进一步提供了一种药物制剂的特征图谱的质量控制方法。本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，能够获得包含7个特征峰的药物制剂的特征图谱，方法精密度好，稳定性好，重现性好，可真实反映药物制剂的质量差异，完善药物制剂的质量控制体系。
Description
技术领域
本发明属于中药成分分析的技术领域，涉及一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法。
背景技术
药物制剂首载于唐·孙思邈的《备急千金要方·卷第十四(小肠腑)》：“主好忘方，远志、人参(各四分)、茯苓(二两)、菖蒲(一两)，上四味治下筛，饮服方寸匕，日三。”用于心气不足、神志不宁、焦虑失眠、抑郁怔忡等中医情志性疾病，类似于西医的抑郁症，是中医益智养心、安神定志的基本方剂。药物制剂现代临床常用于治疗抑郁症、焦虑症、痴呆症，其临床表现多为神志不宁、精神恍惚、焦虑不安、健忘失眠、惊悸怔忡等症。
由于目前缺乏针对药物制剂中整体评价方法，因此有必要建立相应的HPLC特征图谱方法，对药物制剂进行质量控制，完善药物制剂的质量控制体系。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，采用优化条件的前处理及高效液相色谱方法，建立了药物制剂的HPLC特征图谱，能够对药物制剂中7个化学成分进行了分析，用于解决现有技术中缺乏对药物制剂整体评价方法的问题，全面完善药物制剂的质量控制体系。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，包括：将药物制剂样品加入溶剂溶解后超声提取、冷却、摇匀、过滤，取续滤液获得的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，再根据保留时间对获得的供试品溶液的特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱。
较佳地，所述药物制剂样品加入的质量与溶剂加入的体积之比为2:25～75，g/mL。优选地，所述药物制剂样品加入的质量与溶剂加入的体积之比为2:50，g/mL。
较佳地，所述溶剂选自70％甲醇、甲醇、乙醇或水中一种。优选地，所述溶剂为70％甲醇。上述70％甲醇为体积百分比为70％的甲醇的水溶液。
较佳地，所述超声提取的时间为30-60分钟。优选地，所述超声提取的时间为30分钟。
较佳地，所述冷却至室温。上述室温为20-30℃。
较佳地，所述过滤为取摇匀后溶液的上清液进行滤膜过滤。
优选地，所述滤膜过滤的滤膜为0.22μm滤膜。
较佳地，所述续滤液为滤膜过滤后放弃初滤液即得。
较佳地，所述采用高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：
1)参照物溶液的制备：将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、β-细辛醚、茯苓酸的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成参照物溶液；
2)测定：采用高效液相色谱法(HPLC)法分别测定供试品溶液和步骤1)中的参照物溶液，获得供试品溶液的特征图谱和参照物溶液的特征图谱，将供试品溶液的特征图谱与参照物溶液的特征图谱比较保留时间进行定性，对供试品溶液特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱。
优选地，步骤1)中，所述人参皂苷Rg1的CAS号为22427-39-0、人参皂苷Re的CAS号为52286-59-6、远志
酮Ⅲ的CAS号为162857-78-5、3,6'-二芥子酰基蔗糖的CAS号为139891-98-8、细叶远志苷A的CAS号为139726-35-5、β-细辛醚的CAS号为5273-86-9、茯苓酸的CAS号为29070-92-6。
上述药物制剂为棕黄色粉末，由人参、远志、石菖蒲、茯苓4味中药组成。人参中主要活性成分是人参皂苷，人参皂苷Re与人参皂苷Rg1合适共同作为衡量人参皂苷的标准。远志作为传统的益智药，远志的化学成分主要有三萜皂苷类、酮类、寡糖脂类及生物碱类等。其中的3,6’-二芥子酰基蔗糖是开心散含药血清中抗抑郁的有效成分。远志
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A，分别代表了远志的酮类、寡糖脂类、三萜皂苷类。茯苓中主要含有茯苓多糖、三萜酸类、树胶、蛋白质、甾醇和脂肪酸等，茯苓酸为茯苓中的代表性成分。石菖蒲药材中挥发油含量大，主要成分为β-细辛醚(0.705～1.53％)，是发挥药理作用的重要基础。有研究表明β-细辛醚具有治疗痴呆、抗抑郁的作用。故本发明选取了人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志/>
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、茯苓酸、β-细辛醚为特征图谱的共有峰。
优选地，步骤1)中，所述溶剂选自70％甲醇、甲醇、乙醇或水中一种。更优选地，所述溶剂为70％甲醇。上述70％甲醇为体积百分比为70％的甲醇的水溶液。
优选地，步骤1)中，所述参照物溶液采用逐级稀释制得。
优选地，步骤1)中，所述参照物溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、β-细辛醚、茯苓酸的浓度范围均为10-100μg/mL。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法(HPLC)中，采用检测器为二极管阵列检测器(DAD)。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为C18色谱柱，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
更优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱选自ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)、ORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)、Diamonsil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)中的一种。
进一步优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的检测波长为200-205nm，优选为203nm。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的柱温为28-32℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为30℃。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的流速为0.9-1.1mL/min。更优选地，所述高效液相色谱法中的流速为1.0mL/min。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的进样量为5-20μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为10μL。
优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.05-0.15％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.15％磷酸水溶液；分析时间为102min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为102min；梯度洗脱。
上述0.05-0.15％磷酸水溶液为体积百分数为0.05-0.15％的磷酸水溶液。上述0.10磷酸水溶液为体积百分数为0.10的磷酸水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～35min，A相：B相体积比为10：90-21：79；
35～53min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
53～68min，A相：B相体积比为23：77-45：55；
68～78min，A相：B相体积比为45：55-75：25；
78～100min，A相：B相体积比为75：25-95：5；
100～102min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
本发明第二方面提供一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法在药物制剂的质量检测中的用途。
所述药物制剂包括且不限于开心散等。
本发明第三方面提供一种药物制剂的标准特征图谱的构建方法，包括：通过采用前述药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法分别对多个药物制剂样品进行检测，获得多个药物制剂的特征图谱生成共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，建立药物制剂的标准特征图谱。
优选地，所述药物制剂的特征图谱的图谱生成法采用平均数法。所述平均数法为共有模式法的一种。
具体来说，当获取了一批指纹图谱样本后,需要对这些指纹图谱样本进行相似度分析和评价,以便用于中药质量控制。在相似度评价过程中,需要生成对照指纹图谱。目前生成对照指纹图谱的方法主要有典型指纹图谱选择法和共有模式法。典型指纹图谱选择法选择一个具有典型意义或代表性的指纹图谱作为对照指纹图谱。然而这样产生的对照指纹图谱并没有包含指纹图谱样本的总体信息,只是该样本的个体特征,因此有时不一定能够很好的代表指纹图谱样本的总体特征。而且典型指纹图谱的选取也具有一定的主观性。共有模式法包括均值法和中位数法两种方法。这两种方法生成的对照指纹图谱包含了原始指纹图谱的样本信息。如果在这批样品中不存在超常样本是，一般应推荐使用平均数法。
优选地，所述药物制剂的标准特征图谱构建时，用于匹配共有特征峰的时间窗口宽度为0.1。
优选地，所述药物制剂的标准特征图谱包括7个共有特征峰，以2号峰为参照峰(S1峰，保留时间为1.000)，其他6个共有特征峰的相对保留时间的规定值依次为1号峰(0.665)、3号峰(1.183)、4号峰(1.326)、5号峰(1.346)、6号峰(2.041)、7号峰(2.458)，上述除2号峰外6个共有特征峰的相对保留时间的规定值的相对偏差均≤±5％。
优选地，所述药物制剂的标准特征图谱与参照物溶液的特征图谱进行比较，定位确定所述1号峰为远志
酮Ⅲ的特征峰，所述2号峰为3,6’-二芥子酰基蔗糖的特征峰，所述3号峰为细叶远志苷A的特征峰，所述4号峰为人参皂苷Rg1的特征峰，所述5号峰为人参皂苷Re的特征峰，所述6号峰为β-细辛醚的特征峰，所述7号峰为茯苓酸的特征峰。
本发明第四方面提供一种药物制剂的特征图谱的质量控制方法，包括：采用前述药物制剂的特征图谱的检测方法获得的药物制剂的特征图谱，与采用前述药物制剂的标准特征图谱的构建方法获得的药物制剂的标准特征图谱，将药物制剂的色谱峰与相应共有特征峰进行相对保留时间的相似度比较。
按照《中国药典分析检测技术指南》，特征图谱不要求与指纹图谱一样对图谱的相似性进行全面评价，它的主要特点是要突出该品种与其他品种特征图谱的特异性成分，作为控制中药质量的重要鉴别手段。
本发明第五方面提供一种药物制剂中多味药材的特征图谱的筛选方法，包括下列步骤：
A)缺样阴性样品溶液的制备：将包含茯苓、人参、远志、石菖蒲4味药材的药物制剂样品分别去除其中任一1味药材，按所述药物制剂的特征图谱的检测方法中制备供试品溶液相同步骤进行制备，分别获得4种缺样阴性溶液：茯苓阴性溶液、人参阴性溶液、远志阴性溶液、石菖蒲阴性溶液；
B)测定：采用与所述药物制剂的特征图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定4种缺样阴性溶液，分别获得4种缺样阴性溶液的特征图谱；
C)质量检测：将4种缺样阴性溶液的特征图谱，分别与药物制剂的标准特征图谱的构建方法建立的药物制剂的标准特征图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出4种缺样阴性溶液中相应单味药材在药物制剂的标准特征图谱中的共有特征峰，从而对4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱中的特征峰进行归属定位。
所述茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。
所述人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Meyer的根。
所述远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.的根
所述石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的根茎。
优选地，步骤C)中，所述药物制剂的标准特征图谱中，与4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱的共有特征峰归属定位分别为，所述1、2、3号峰来源于远志；所述4、5号峰来源于人参，所述6号峰来源于石菖蒲，所述7号峰来源于茯苓。本发明中的用水均为纯净水。
如上所述，本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，采用优化条件的前处理和仪器检测方法，对药物制剂进行定性检测。该种方法能实现药物制剂的特征性成分被分离检测，全面的反映药物制剂的成分信息，实现药物制剂特征图谱质量控制、监控药物制剂生产、鉴别药物制剂真伪等应用。具体具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，在建立药物制剂的HPLC特征图谱测定方法过程中，以相对保留时间为指标进行精密度、稳定性和重复性试验考察研究，确认了7个共有特征峰，保证了方法的稳定性和适应性。
(2)本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，由于药物制剂中化学成分复杂，本发明在建立起特征图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，以药物制剂中各有效成分特征图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测少量成分而判定药物制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
(4)本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，具有操作简便，精密度高，稳定性和重现性较好等优点，可真实反映药物制剂的质量差异，确保批次间生产工艺与质量的稳定性，能全面、科学评价药物制剂的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证，为其质量标准的完善提供参考，从而全面完善药物制剂的质量控制体系。
附图说明
图1显示为本发明中药物制剂的精密度结果特征图谱。
图2显示为本发明中药物制剂的不同色谱柱耐用性考察相似度评价图谱。
图3显示为本发明中药物制剂的不同流速耐用性考察相似度评价图谱。
图4显示为本发明中药物制剂的不同柱温耐用性考察相似度评价图谱。
图5显示为本发明中药物制剂的不同pH耐用性考察相似度评价图谱。
图6显示为本发明中药物制剂的不同仪器耐用性考察相似度评价图谱。
图7显示为本发明中药物制剂的稳定性结果特征图谱。
图8显示为本发明中药物制剂的重复性结果特征图谱。
图9显示为本发明中药物制剂的标准特征图谱，其中，1为远志
酮Ⅲ，2为3,6’-二芥子酰基蔗糖，3为细叶远志苷A，4为人参皂苷Rg1，5为人参皂苷Re，6为β-细辛醚，7为茯苓酸。
图10示为本发明中药物制剂中各味药材的专属性色谱图，其中，A为供试品溶液；B为参照物溶液；C为茯苓阴性溶液；D为人参阴性溶液；E为远志阴性溶液：F为石菖蒲阴性溶液。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
15批次药物制剂样品具体为开心散(上海和黄药业有限公司制备)，见下表1。
表1
| 编号 | 批号 | 编号 | 批号 |
| A1 | 2020063001 | A9 | 2020070201 |
| A2 | 2020063002 | A10 | 2020071302 |
| A3 | 2020071401 | A11 | 2020071601 |
| A4 | 2020063003 | A12 | 2020071602 |
| A5 | 2020063004 | A13 | 2020070202 |
| A6 | 2020070101 | A14 | 2020071603 |
| A7 | 2020071301 | A15 | 2020071402 |
| A8 | 2020070102 |
远志
酮Ⅲ(PolygalaxanthoneⅢ)对照品(NATURE STANDARD，ST06290120)；3,6’-二芥子酰基蔗糖(3,6’-disinapoyl sucrose)对照品(中国食品药品检定研究院，111848-202006ID：QNVP-D9TF)；细叶远志苷A(tenuifoliside A)对照品(上海绩奕生物科技有限公司，P16A9F58918)；人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)对照品(中国食品药品检定研究院，110703-201933ID：TWYY-M6VC)；人参皂苷Re(Ginsenoside Re)对照品(中国食品药品检定研究院，110754-202028ID：ZR2T-SE40)；β-细辛醚(β-asarone)对照品(中国食品药品检定研究院，112018-201802ID：N7Q2-LG99)；茯苓酸(Pachymic acid)对照品(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：PRF9090303)。
乙腈(色谱纯，生产商：美国Fisher chemical，购买商：国药集团化学试剂有限公司，批号：204199)；甲醇、磷酸(分析纯，生产商：CNW technologies，购买商：国药集团化学试剂有限公司，批号：J5640045)；超纯水(纯水仪制备)。
2、仪器
Agilent 1260Ⅱ型高效液相色谱仪(Agilent，美国，四元泵)；Waters E2695型高效液相色谱仪(Waters，美国，四元泵)；BT25S型电子分析天平(北京赛多利斯公司，中国)；BSA124S-CW型电子分析天平(北京赛多利斯公司，中国)；KQ-250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；ZP15D1型超声纯水仪(上海泽权仪器设备有限公司，中国)。
ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)(Agilent，美国)；ORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)(Agilent，美国)；Diamonsil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)(迪马科技，中国)。
对于药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，包括以下的测定过程。
1、供试品溶液的制备
取药物制剂样品，精密称定，加入溶剂溶解，其中药物制剂样品加入质量与溶剂加入的体积之比为2:25～75，g/mL，密封，超声处理30～60分钟，冷却至室温、摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即为供试品溶液。上述溶剂选自70％甲醇、甲醇、乙醇或水中一种。
2、参照物溶液的制备
将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、β-细辛醚、茯苓酸的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成参照物溶液。上述溶剂选自70％甲醇、甲醇、乙醇或水中一种。
3、测定
采用高效液相色谱法(HPLC)法分别测定供试品溶液和参照物溶液，获得供试品溶液的特征图谱和参照物溶液的特征图谱，将供试品溶液的特征图谱与参照物溶液的特征图谱比较保留时间进行定性，对供试品溶液特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱。
其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为C18色谱柱，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，具体选自ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)、ORBAX EclipseXDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)、Diamonsil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)中的一种；检测波长为200-205nm；柱温为28-32℃；流速为0.9-1.1mL/min；进样量为5-20μL；流动相为乙腈-0.05-0.15％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.15％磷酸水溶液；分析时间为102min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0～35min，A相：B相体积比为10：90-21：79；
35～53min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
53～68min，A相：B相体积比为23：77-45：55；
68～78min，A相：B相体积比为45：55-75：25；
78～100min，A相：B相体积比为75：25-95：5；
100～102min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
通过采用前述药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法分别对多个药物制剂样品进行检测，获得多个药物制剂的特征图谱生成共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，建立药物制剂的标准特征图谱。
药物制剂的标准特征图谱包括7个共有特征峰，以2号峰为参照峰(S1峰，保留时间为1.000)，其他6个共有特征峰的相对保留时间的规定值依次为1号峰(0.665)、3号峰(1.183)、4号峰(1.326)、5号峰(1.346)、6号峰(2.041)、7号峰(2.458)，上述除2号峰外6个共有特征峰的相对保留时间的规定值的相对偏差均≤±5％。
药物制剂的标准特征图谱与参照物溶液的特征图谱进行比较，定位确定所述1号峰为远志
酮Ⅲ的特征峰，所述2号峰为3,6’-二芥子酰基蔗糖的特征峰，所述3号峰为细叶远志苷A的特征峰，所述4号峰为人参皂苷Rg1的特征峰，所述5号峰为人参皂苷Re的特征峰，所述6号峰为β-细辛醚的特征峰，所述7号峰为茯苓酸的特征峰。
将包含茯苓、人参、远志、石菖蒲4味药材的药物制剂样品分别去除其中任一1味药材，按所述药物制剂的特征图谱的检测方法中制备供试品溶液相同步骤进行制备，分别获得4种缺样阴性溶液：茯苓阴性溶液、人参阴性溶液、远志阴性溶液、石菖蒲阴性溶液。再采用与所述药物制剂的特征图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定4种缺样阴性溶液，分别获得4种缺样阴性溶液的特征图谱。将4种缺样阴性溶液的特征图谱，分别与药物制剂的标准特征图谱的构建方法建立的药物制剂的标准特征图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出4种缺样阴性溶液中相应单味药材在药物制剂的标准特征图谱中的共有特征峰，从而对4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱中的特征峰进行归属定位。
如图10所示，所述药物制剂的标准特征图谱中，与4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱的共有特征峰归属定位分别为，所述1、2、3号峰来源于远志；所述4、5号峰来源于人参，所述6号峰来源于石菖蒲，所述7号峰来源于茯苓。
实施例1
1、供试品溶液的制备
取药物制剂样品2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密封，超声处理(350w、53kHz)30分钟，冷却至室温、摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即为供试品溶液1#。
2、参照物溶液的制备
将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志
酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、β-细辛醚、茯苓酸的对照品，精密称定，加入甲醇定容，制成质量浓度分别为30、30、20、70、20、100、10μg/mL的混合参照物溶液1#。
3、测定
采用高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液1#和参照物溶液1#，获得供试品溶液1#的特征图谱和参照物溶液1#的特征图谱，将供试品溶液1#的特征图谱与参照物溶液1#的特征图谱比较保留时间进行定性，对供试品溶液1#特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱。
其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为203nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水溶液；分析时间为102min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0～35min，A相：B相体积比为10：90-21：79；
35～53min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
53～68min，A相：B相体积比为23：77-45：55；
68～78min，A相：B相体积比为45：55-75：25；
78～100min，A相：B相体积比为75：25-95：5；
100～102min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
实施例2
按实施例1中方法，取15批药物制剂样品进行检测，获得多个药物制剂样品的特征图谱生成共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，建立药物制剂的标准特征图谱。
如图9所示，药物制剂的标准特征图谱包括7个共有特征峰，以2号峰为参照峰(S1峰，保留时间为1.000)，其他6个共有特征峰的相对保留时间的规定值依次为1号峰(0.665)、3号峰(1.183)、4号峰(1.326)、5号峰(1.346)、6号峰(2.041)、7号峰(2.458)。
如图9所示，药物制剂的标准特征图谱与参照物溶液的特征图谱进行比较，定位确定所述1号峰为远志
酮Ⅲ的特征峰，所述2号峰为3,6’-二芥子酰基蔗糖的特征峰，所述3号峰为细叶远志苷A的特征峰，所述4号峰为人参皂苷Rg1的特征峰，所述5号峰为人参皂苷Re的特征峰，所述6号峰为β-细辛醚的特征峰，所述7号峰为茯苓酸的特征峰。
实施例3
取药物制剂样品A15(批号2020071402)，采用实施例1中步骤1中配制供试品溶液。同时，按实施例1中的步骤2中配制参照物溶液，其中，远志
酮Ⅲ的含量为21.23μg/mL、3,6’-二芥子酰基蔗糖含量为72.19μg/mL、细叶远志苷A含量为45.71μg/mL、人参皂苷Rg1含量为28.09μg/mL、人参皂苷Re含量为27.26μg/mL、β-细辛醚含量为143μg/mL、茯苓酸含量为5.78μg/mL。
将包含茯苓、人参、远志、石菖蒲4味药材的药物制剂样品分别去除其中任一1味药材，按实施例1中药物制剂的特征图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得4种缺样阴性溶液：茯苓阴性溶液、人参阴性溶液、远志阴性溶液、石菖蒲阴性溶液。
采用与实施例1中药物制剂的特征图谱的检测方法的步骤3)中相同色谱条件的高效液相色谱法(HPLC)法分别测定供试品溶液、参照物溶液、4种缺样阴性溶液，分别获得供试品溶液的特征图谱、参照物溶液的特征图谱、4种缺样阴性溶液的特征图谱。
将供试品溶液的特征图谱按实施例2中方法建立药物制剂的标准特征图谱。再将4种缺样阴性溶液的特征图谱，分别与药物制剂的标准特征图谱、参照物溶液的特征图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出4种缺样阴性溶液中相应单味药材在药物制剂的标准特征图谱中的共有特征峰，从而对4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱中的特征峰进行归属定位。具体结果见图10。
如图10所示，远志阴性对照图谱与混标及样本对比后，结果表明远志
酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖和细叶远志苷A三个指标性成分仅存在于远志药材中，其专属性良好。人参阴性对照图谱与混标及样本对比后，结果表明人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两个指标性成分仅存在于人参药材中，其专属性良好。石菖蒲阴性对照图谱与混标及样本对比后，结果表明β-细辛醚成分仅存在于石菖蒲药材中，其专属性良好。茯苓阴性对照图谱与混标及样本对比后，结果表明茯苓酸成分仅存在于茯苓药材中，其专属性良好。
实施例4
对本发明的药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、精密度
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，同一天连续进样分析6次，以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各峰的相对保留时间，结果见表2。由表2可知，各个特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表2精密度实验结果
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定药物制剂样品A15的第2次分析结果S2的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图1。计算相似度，结果见表3。由图1、表3可知，6次进样结果的相似度为1，表明仪器精密度良好。
表3精密度相似度结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | 对照特征图谱R | |
| S1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
2、稳定性
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样分析，以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间，稳定性具体结果见表4。结果表明，相对保留时间的RSD均小于5％。
表4稳定性实验结果
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定药物制剂样品A15的在2h进行分析结果S2的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图7。计算相似度，结果见表5。由图7、表5可知，6个时间点的特征图谱相似度均为1，表明该样品在24h内稳定，说明该方法稳定性良好。
表5稳定性相似度结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | 对照特征图谱R | |
| S1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
3、重复性
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1平行制备获得6份供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各峰的相对保留时间，重复性具体结果见表6。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表6重复性实验结果
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定药物制剂样品A15的第2份供试品溶液分析结果S2的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图8。计算相似度，结果见表7。由图8、表7可知，6份样品特征图谱的相似度均为1，表明该方法重复性良好。
表7重复性相似度结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | 对照特征图谱R | |
| S1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| S6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
4、耐用性
4.1不同色谱柱考察
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，进样分析。比较不同厂家色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm，P.N.880975-902)、ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm，P.N.990967-902)、Diamonsil C18(4.6×250mm，5μm，Cat.no：99603，Ser.no：201061838)。以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各峰的相对保留时间，结果见表8。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表8不同色谱柱相对保留时间表
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定SB-C18色谱柱分析结果S1的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图2。计算相似度，结果见表9。由图2、表9可知，不同色谱柱对检测结果影响较小，相似度均为1，耐用性良好。
表9不同色谱柱相似度结果
| SB-C18 | Diamonsil C18 | XDB-C18 | 对照指纹图谱R | |
| SB-C18(S1) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Diamonsil C18(S2) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| XDB-C18(S3) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 |
4.2不同流速考察
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别以0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min流速时进行测定，比较不同流速下的色谱峰变化，以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间，结果见表10。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表10不同流速相对保留时间表
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定流速为1.0ml/min分析结果S1的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图3。计算相似度，结果见表11。由图3、表11可知，在0.9～1.1ml/min下均可进行试验，、相似度均为1，耐用性良好。
表11不同流速相似度结果
| 1.0ml/min | 0.9ml/min | 1.1ml/min | 对照特征图谱R | |
| 1.0ml/min(S1) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 0.9ml/min(S2) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 1.1ml/min(S3) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 |
4.3不同柱温考察
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别在28℃、30℃、32℃进行测定，比较不同柱温下的色谱峰变化。以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各峰的相对保留时间，结果见表12。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表12不同柱温相对保留时间表
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定柱温为30℃分析结果S1的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图4。计算相似度，结果见表13。由图4、表13可知，在28～32℃下均可进行试验，相似度均为1，耐用性良好。
表13不同柱温相似度结果
| 30℃ | 28℃ | 32℃ | 对照特征图谱R | |
| 30℃(S1) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 28℃(S2) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 32℃(S3) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 |
4.4不同磷酸比例考察
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别以0.05％磷酸、0.1％磷酸、0.15％磷酸作为流动相进行测定，比较不同pH下的色谱峰变化。以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间，结果见表14。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表14不同pH相对保留时间表
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定0.1％磷酸分析结果S1的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图5。计算相似度，结果见表15。由图5、表15可知，在0.05％磷酸～0.15％磷酸下均可进行试验，、相似度均为1，耐用性良好。
表15不同pH相似度结果
| 0.1％磷酸 | 0.15％磷酸 | 0.05％磷酸 | 对照特征图谱R | |
| 0.1％磷酸(S1) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 0.15％磷酸(S2) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 0.05％磷酸(S3) | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 1 | 1 | 1 |
4.5不同液相色谱仪器考察
取同一药物制剂样品A15(批号2020071402)，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，比较不同厂家的Agilent infinity 1260Ⅱ两台、Waters E2695设备进行检测，其中，Agilent infinity 1260Ⅱ分别位于液相室、标准化中心2个不同地点。以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各峰的相对保留时间，结果见表16。结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于5％。
表16不同仪器相对保留时间表
将得到的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，设定位于液相室的Agilent infinity 1260Ⅱ分析结果S1的特征图谱为参照图谱，时间窗口宽度设为0.1，进行多点矫正，Mark峰匹配，以平均数法生成对照特征图谱R，具体结果见图6。计算相似度，结果见表17。由图6、表17可知，不同厂家仪器对检测影响较小，相似度均大于0.999，耐用性良好。
表17不同仪器相似度结果
| Agilent1260液相室 | Waters E2695 | Agilent 1260标准化中心 | 对照特征图谱R | |
| Agilent 1260液相室 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Waters E2695 | 1 | 1 | 0.999 | 0.999 |
| Agilent 1260标准化中心 | 1 | 0.999 | 1 | 1 |
| 对照特征图谱R | 1 | 0.999 | 1 | 1 |
实施例5
收集15批药物制剂样品A1-A15，采用实施例1中的步骤1中配制供试品溶液，按照实施例1中步骤3的色谱条件，得到所有样品的HPLC特征图谱。以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间，结果见表18。由表18可知，15批次药物制剂样品的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间的RSD在0～0.15％。并且以3,6’-二芥子酰基蔗糖为参比，其他6个峰相对保留时间的规定值的相对偏差均≤±5％，规定值为：0.665(远志
酮Ⅲ)、1.000(3,6'-二芥子酰基蔗糖)、1.183(细叶远志苷A)、1.326(人参皂苷Rg1)、1.346(人参皂苷Re)、2.041(β-细辛醚)、2.458(茯苓酸)。/>
表18 15批样品测定结果
同时记录15批样本参照峰(3,6’-二芥子酰基蔗糖)的理论塔板数，结果见表19。由表19可知，其***适用性良好。
表18 15批样品理论塔板数结果
综上所述，本发明提供的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，精密度、重现性、稳定性良好，准确可靠，可真实反映药物制剂的质量差异，完善药物制剂的质量控制体系。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，包括：将药物制剂样品加入溶剂溶解后超声提取、冷却、摇匀、过滤，取续滤液获得的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行检测，再根据保留时间对获得的供试品溶液的特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱；药物制剂为开心散；
所述采用高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：
1）参照物溶液的制备：将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、远志口山酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、β-细辛醚、茯苓酸的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成参照物溶液；
2）测定：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和步骤1）中的参照物溶液，获得供试品溶液的特征图谱和参照物溶液的特征图谱，将供试品溶液的特征图谱与参照物溶液的特征图谱比较保留时间进行定性，对供试品溶液特征图谱中的指标成分进行归属定位，从而获得药物制剂的特征图谱；
步骤2）中，所述高效液相色谱法的测定条件为：检测器为二极管阵列检测器；色谱柱为C18色谱柱，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长为200-205nm；流动相为乙腈-0.05-0.15%磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05-0.15%磷酸水溶液；分析时间为102min；梯度洗脱；
所述梯度洗脱的具体程序为：0~35min，A相：B相体积比为10：90-21：79；35~53min，A相：B相体积比为21：79-23：77；53~68min，A相：B相体积比为23：77-45：55；68~78min，A相：B相体积比为45：55-75：25；78~100min，A相：B相体积比为75：25-95：5；100~102min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
2.根据权利要求1所述的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的获得包括以下条件中任一项或多项：
A1）所述药物制剂样品加入的质量与溶剂加入的体积之比为2:25~75，g/mL；
A2）所述溶剂选自70%甲醇、甲醇、乙醇或水中一种；
A3）所述超声提取的时间为30-60分钟。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法在药物制剂的质量检测中的用途；药物制剂为开心散。
4.一种药物制剂的标准特征图谱的构建方法，包括：通过采用权利要求1-2任一所述的药物制剂的HPLC特征图谱的检测方法分别对多个药物制剂样品进行检测，获得多个药物制剂的特征图谱生成共有对照特征图谱，以图谱中均存在的色谱峰作为共有特征峰，确定共有特征峰的相对保留时间，建立药物制剂的标准特征图谱；所述药物制剂为开心散。
5.根据权利要求4所述的一种药物制剂的标准特征图谱的构建方法，其特征在于，所述药物制剂的标准特征图谱符合以下条件中任一项或多项：
B1）所述药物制剂的标准特征图谱包括7个共有特征峰，以2号峰为参照峰S1峰，保留时间为1.000，其他6个共有特征峰的相对保留时间的规定值依次为保留时间为0.665的1号峰、保留时间为1.183的3号峰、保留时间为1.326的4号峰、保留时间为1.346的5号峰、保留时间为2.041的6号峰、保留时间为2.458的7号峰，上述除2号峰外6个共有特征峰的相对保留时间的规定值的相对偏差均≤±5%；
B2）所述药物制剂的标准特征图谱与参照物溶液的特征图谱进行比较，定位确定所述1号峰为远志口山酮Ⅲ的特征峰，所述2号峰为3,6’-二芥子酰基蔗糖的特征峰，所述3号峰为细叶远志苷A的特征峰，所述4号峰为人参皂苷Rg1的特征峰，所述5号峰为人参皂苷Re的特征峰，所述6号峰为β-细辛醚的特征峰，所述7号峰为茯苓酸的特征峰。
6.一种药物制剂的特征图谱的质量控制方法，包括：采用权利要求1-2任一所述的药物制剂的特征图谱的检测方法获得的药物制剂的特征图谱，与采用权利要求4-5任一所述的药物制剂的标准特征图谱的构建方法获得的药物制剂的标准特征图谱，将药物制剂的色谱峰与相应共有特征峰进行相对保留时间的相似度比较；所述药物制剂为开心散。
7.一种药物制剂中多味药材的特征图谱的筛选方法，所述药物制剂为开心散，包括下列步骤：
A）缺样阴性样品溶液的制备：将包含茯苓、人参、远志、石菖蒲4味药材的药物制剂样品分别去除其中任一1味药材，按权利要求1-2任一所述的药物制剂的特征图谱的检测方法中制备供试品溶液相同步骤进行制备，分别获得4种缺样阴性溶液：茯苓阴性溶液、人参阴性溶液、远志阴性溶液、石菖蒲阴性溶液；
B）测定：采用与权利要求1-2任一所述的药物制剂的特征图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定4种缺样阴性溶液，分别获得4种缺样阴性溶液的特征图谱；
C）质量检测：将4种缺样阴性溶液的特征图谱，分别与权利要求4-5任一所述的药物制剂的标准特征图谱的构建方法建立的药物制剂的标准特征图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出4种缺样阴性溶液中相应单味药材在药物制剂的标准特征图谱中的共有特征峰，从而对4种缺样阴性溶液中相应单味药材的特征图谱中的特征峰进行归属定位。
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