CN115448992A - 一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 - Google Patents
一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115448992A CN115448992A CN202211236364.0A CN202211236364A CN115448992A CN 115448992 A CN115448992 A CN 115448992A CN 202211236364 A CN202211236364 A CN 202211236364A CN 115448992 A CN115448992 A CN 115448992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- camellia oleifera
- shell polysaccharide
- oleifera shell
- extracting
- polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000526900 Camellia oleifera Species 0.000 title claims abstract description 73
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 67
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 67
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 15
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims abstract description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 claims description 42
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 14
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 13
- 101000725401 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 2 Proteins 0.000 description 12
- 101000605127 Homo sapiens Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 12
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 12
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 12
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 10
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 9
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 8
- 235000018597 common camellia Nutrition 0.000 description 8
- 240000001548 Camellia japonica Species 0.000 description 7
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 7
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 6
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 6
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 6
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 101150071146 COX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209507 Camellia Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 101150109636 Inos gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明提供一种油茶果壳多糖提取方法,将油茶果壳进行充分干燥,经闪式提取器进行粉碎、过筛得出油茶果壳粉末,用蒸馏水对油茶果壳粉末进行加热浸提,离心保留上清液;将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩,并用有机溶剂进行沉淀,离心保留沉淀物,将沉淀物用蒸馏水溶解,并用活性炭进行脱色,离心、将上清液抽滤并冷冻干燥,得油茶果壳多糖。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、制备工艺简单,成本低、免疫活性好。
Description
技术领域
本发明属于天然活性成分提取和应用领域,具体涉及一种油茶果壳多糖提取方法及其应用。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel)属于山茶科、山茶属小乔木,为我国重点发展的第一大木本油料作物,在长江中下游地区拥有悠久的种植历史。油茶在加工榨油的过程中会产生大量副产物,油茶果壳作为主要的榨油剩余物之一,约占油茶果重量的60%左右,主要由木质素、纤维素、半纤维素、多糖、黄酮类、酚类和萜烯类组成。目前关于油茶果壳的高附加值开发利用并未多见。
免疫是机体抵御外界病原微生物和病原体入侵的一道重要屏障,巨噬细胞在免疫反应中发挥了重要作用。RAW264.7细胞作为一种巨噬细胞,通常被用来作为免疫活性物质研究和开发的模式细胞。当前,涉及天然植物活性多糖提取及其调节机体免疫的研究报道很多,其中一些产品对人类健康和经济社会发展产生了重要影响。然而目前关于油茶果壳免疫活性物质的提取及应用研究鲜见报道。因此,对油茶果壳的免疫成分进行提取和开发应用对于提高产品附加值具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油茶果壳多糖提取方法及其应用,以油茶果壳为原料,经闪式提取器粉碎、过筛、蒸馏水加热浸提、离心、减压浓缩、有机溶剂沉淀、活性炭脱色和冷冻干燥等步骤制得了油茶果壳多糖,对所得油茶果壳多糖进行免疫活性测试,其可刺激RAW264.7细胞免疫分子产生、增强免疫蛋白表达、促进TNFα释放和mRNA表达,激活免疫相关信号通路,并且对细胞形态和存活率影响较弱。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、工艺简单、成本低、免疫活性好。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:一种油茶果壳多糖提取方法,包括如下步骤:
(1)将油茶果壳充分干燥,经闪式提取器粉碎、过筛,再用蒸馏水加热浸提,离心保留上清液;
(2)将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩,并用有机溶剂进行沉淀,离心保留沉淀物;
(3)将沉淀物用蒸馏水溶解,加入活性炭进行脱色,离心保留上清液,将上清液抽滤并冷冻干燥,得出油茶果壳多糖。
进一步优选,干燥后的油茶果壳水分含量为15%-20%。
进一步优选,闪式提取器参数设置为4000-6000rpm/分钟,提取时间为1-3分钟。
进一步优选,过筛规格为80-100目。
进一步优选,油茶果壳粉末与蒸馏水的质量体积比为1:20-40,加热时间为8-12h。
进一步优选,旋转蒸发器参数设置为40-60bar,55-65℃,50-65rpm。
进一步优选,进行减压浓缩时,浓缩后溶液密度应达到1.1-1.3g/cm3。
进一步优选,有机溶剂选择甲醇、乙醇或丙酮中的一种。
进一步优选,浓缩液与有机溶剂的体积比为1:4-6。
进一步优选,进行机溶剂沉淀时,采用4℃保温,静置12-18h。
进一步优选,沉淀与蒸馏水的质量体积比为1:10-30。
进一步优选,活性炭与粗多糖的质量比为1:4-9。
进一步优选,进行活性炭脱色时,采用恒温水浴加热,温度为50-60℃,时间为2-4h;
一种油茶果壳多糖的应用,所得油茶果壳多糖用于制备增强RAW264.7细胞免疫反应的药物。
本发明具有如下有益效果:本发明以油茶果壳为原料,采用闪式提取器粉碎、过筛、蒸馏水加热浸提、减压浓缩、有机溶剂沉淀、活性炭脱色以及冷冻干燥等步骤制得了油茶果壳多糖,通过RAW264.7细胞模型进行免疫活性测试,其可刺激NO和PGE2产生、增强iNOS和COX2蛋白表达、促进TNFα释放和mRNA表达、上调MAPKs信号蛋白ERK、P38和JNK磷酸化水平,促进NF-κB核转位,并且对细胞形态和存活率影响较弱,有利于作为制备增强RAW264.7细胞免疫反应药物上的应用。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、制备工艺简单、成本低、免疫活性好。
附图说明
图1本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响细胞形态的数据图谱;
图2本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响细胞存活率的数据图谱;
图3本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响NO产生的数据图谱;
图4本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响PGE2产生的数据图谱;
图5本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响iNOS蛋白表达的数据图谱;
图6本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响COX2蛋白表达的数据图谱;
图7本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响TNFα释放的数据图谱;
图8本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响IL-6释放的数据图谱;
图9本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响IL-1β释放的数据图谱;
图10本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响iNOS基因表达的数据图谱;
图11本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响COX2基因表达的数据图谱;
图12本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响TNFα基因表达的数据图谱;
图13本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响IL-1β基因表达的数据图谱;
图14本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响IL-6基因表达的数据图谱;
图15本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响GAPDH基因表达的数据图谱;
图16本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响MAPKs信号通路蛋白ERK、P38和JNK磷酸化水平的数据图谱;
图17本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响MAPKs信号通路蛋白ERK磷酸化水平的量化数据图谱;
图18本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响MAPKs信号通路蛋白P38磷酸化水平的量化数据图谱;
图19本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响MAPKs信号通路蛋白JNK磷酸化水平的量化数据图谱;
图20本发明实施例1中油茶果壳多糖(CPS)影响NF-κB核转位的数据图谱。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明,所述的是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到20%左右,称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛,并加入20倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提8h,离心(4000rpm,10min)保留上清液;用旋转蒸发器将上清液减压浓缩,参数设置为60bar、55℃、50rpm,使浓缩液体积约为500mL,密度为1.1g/cm3,用4倍体积甲醇对浓缩液进行沉淀,搅拌均匀,4℃静置12h,离心得沉淀物;将沉淀物用10倍体积蒸馏水溶解,加入10%活性炭,水浴加热至50℃,维持2h,离心并将上清液进行抽滤,滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥,采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为37.1%,得率为25.34%,保存备用。
准确称取油茶果壳多糖100mg,加入10mL蒸馏水充分溶解,紫外灭菌30min,4℃保存备用;按照倍比稀释方式,用无血清DMEM高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/mL,现配现用;培养RAW264.7细胞至对数生长期,将细胞接种于96孔板中过夜,密度为5x10^4/孔,体积为100μL/孔;将配好的油茶果壳多糖和LPS(2μg/mL)处理细胞24h,100μL/孔;通过显微镜拍照显示细胞形态,MTT法检测细胞存活率,通过Griess法检测细胞上清液中NO产生;结果表明油茶果壳多糖对细胞形态改变和存活率影响较弱(参照图1和图2),并且可以刺激RAW264.7细胞NO产生(参照图3)。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1x10^6/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞24h,通过western blotting检测iNOS和COX2蛋白表达,通过ELISA检测细胞上清液中PGE2、TNFα、IL-6和IL-1β含量,通过RT-PCR检测iNOS、COX2、TNFα、IL-6和IL-1βmRNA水平;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞PGE2产生(图4),增强iNOS和COX2蛋白表达(图5和图6),并且促进TNFα释放(图7至图9)和mRNA表达(图10至图15)。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜,密度为1.5x10^6/孔,体积为4mL/皿;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞1、2、6h,通过western blotting检测ERK、P38和JNK蛋白表达以及磷酸化水平;结果显示油茶果壳多糖可以上调RAW264.7细胞ERK、P38和JNK蛋白磷酸化水平(图16至19)。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1x10^5/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞6h,通过免疫荧光技术分析NF-κB核转位情况;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞NF-κB核转位(图20)。
实施例2
将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到18%左右,称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛,并加入25倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提10h,离心(4000rpm,10min)保留上清液;用旋转蒸发器将上清液减压浓缩,参数设置为50bar、60℃、50rpm,使浓缩液体积约为500mL,密度为1.2g/cm3,用5倍体积丙酮对浓缩液进行沉淀,搅拌均匀,4℃静置14h,离心得沉淀物;将沉淀物用20倍体积蒸馏水溶解,加入15%活性炭,水浴加热至55℃,维持3h,离心并将上清液进行抽滤,滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥,采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为38.5%,得率为26.17%,保存备用。
准确称取油茶果壳多糖100mg,加入10mL蒸馏水充分溶解,紫外灭菌30min,4℃保存备用;按照倍比稀释方式,用无血清DMEM高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/mL,现配现用;培养RAW264.7细胞至对数生长期,将细胞接种于96孔板中过夜,密度为8x10^4/孔,体积为100μL/孔;将配好的油茶果壳多糖和LPS(2μg/mL)处理细胞24h,100μL/孔;通过显微镜拍照显示细胞形态,MTT法检测细胞存活率,通过Griess法检测细胞上清液中NO产生;结果表明油茶果壳多糖对细胞形态和存活率影响较弱,并且可以刺激RAW264.7细胞NO产生。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1.5x10^6/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞24h,通过western blotting检测iNOS和COX2蛋白表达,通过ELISA检测细胞上清液中PGE2、TNFα、IL-6和IL-1β含量,通过RT-PCR检测iNOS、COX2、TNFα、IL-6和IL-1βmRNA水平;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞PGE2产生,增强iNOS和COX2蛋白表达,并且促进TNFα释放和mRNA表达。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜,密度为1x10^6/孔,体积为4mL/皿;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞1、2、6h,通过western blotting检测ERK、P38和JNK蛋白表达以及磷酸化水平;结果显示油茶果壳多糖可以上调RAW264.7细胞ERK、P38和JNK蛋白磷酸化水平。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1.5x10^5/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞6h,通过免疫荧光技术分析NF-κB核转位情况;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞NF-κB核转位。
实施例3
将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到15%左右,称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛,并加入30倍体积蒸馏水、加热至85℃、浸提12h,离心(4000rpm,10min)保留上清液;用旋转蒸发器将上清液减压浓缩,参数设置为40bar、60℃、55rpm,使浓缩液体积约为500mL,密度为1.3g/cm3用6倍体积乙醇对浓缩液进行沉淀,搅拌均匀,4℃静置15h,离心得沉淀物;将沉淀物用30倍体积蒸馏水溶解,加入20%活性炭,水浴加热至60℃,维持4h,离心并将上清液进行抽滤,滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥,采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为39.2%,得率为27.83%,保存备用。
准确称取油茶果壳多糖100mg,加入10mL蒸馏水充分溶解,紫外灭菌30min,4℃保存备用;按照倍比稀释方式,用无血清DMEM高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/mL,现配现用;培养RAW264.7细胞至对数生长期,将细胞接种于96孔板中过夜,密度为1x10^5/孔,体积为100μL/孔;将配好的油茶果壳多糖和LPS(2μg/mL)处理细胞24h,100μL/孔;通过显微镜拍照显示细胞形态,MTT法检测细胞存活率,通过Griess法检测细胞上清液中NO产生;结果表明油茶果壳多糖对细胞形态和存活率影响较弱,并且可以刺激RAW264.7细胞NO产生。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1x10^6/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞24h,通过western blotting检测iNOS和COX2蛋白表达,通过ELISA检测细胞上清液中PGE2、TNFα、IL-6和IL-1β含量,通过RT-PCR检测iNOS、COX2、TNFα、IL-6和IL-1βmRNA水平;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞PGE2产生,增强iNOS和COX2蛋白表达,并且促进TNFα释放和mRNA表达。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜,密度为1.5x10^6/孔,体积为4mL/皿;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞1、2、6h,通过western blotting检测ERK、P38和JNK蛋白表达以及磷酸化水平;结果显示油茶果壳多糖可以上调RAW264.7细胞ERK、P38和JNK蛋白磷酸化水平。
培养RAW264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜,密度为1x10^5/孔,体积为3mL/孔;用油茶果壳多糖和LPS处理细胞6h,通过免疫荧光技术分析NF-κB核转位情况;结果显示油茶果壳多糖可以促进RAW264.7细胞NF-κB核转位。
本实施例中的茶果壳多糖具备刺激NO和PGE2产生、增强iNOS和COX2蛋白表达、促进TNFα释放和mRNA表达、上调MAPKs信号蛋白ERK、P38和JNK磷酸化水平,促进NF-κB核转位,并且对细胞形态和存活率影响较弱,有利于作为制备增强RAW264.7细胞免疫反应药物上的应用。
对比例
将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到20%左右,称取油茶果壳1kg进行粉碎、过100目筛,并加入20倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提8h,离心(4000rpm,10min)保留上清液;用旋转蒸发器将上清液减压浓缩,参数设置为60bar、55℃、50rpm,使浓缩液体积约为500mL,用1倍体积乙醇对浓缩液进行沉淀,搅拌均匀,4℃静置12h,离心得沉淀物;将沉淀物用10倍体积蒸馏水溶解,加入25%活性炭,水浴加热至50℃,维持2h,离心并将上清液进行抽滤,滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥,采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为27.9%,得率为16.34%。本发明采用闪式提取器进行粉碎,进行有机溶剂沉淀时,浓缩液与有机溶剂的比值进行了调整,相较于未采用闪式提取器,并且浓缩液与有机溶剂的比值为1:1的方式,获得了更好的提取效果,极大的提升了油茶果壳多糖的得率。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程,并依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将油茶果壳充分干燥,经闪式提取器粉碎、过筛,再用蒸馏水加热浸提,离心保留上清液;
(2)将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩,并用有机溶剂进行沉淀,离心保留沉淀物;
(3)将沉淀物用蒸馏水溶解,加入活性炭进行脱色,离心保留上清液,将上清液抽滤并冷冻干燥,得出油茶果壳多糖。
2.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(1)中,干燥后油茶果壳的水分含量为15%-20%。
3.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(1)中,闪式提取器参数为4000-6000rpm/分钟,提取时间为1-3分钟,过80-100目筛。
4.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(1)中,油茶果壳粉末与蒸馏水的质量体积比为1:20-40,加热时间为8-12h。
5.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(2)中,旋转蒸发器参数设置为40-60bar,55-65℃,50-65rpm。
6.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(2)中,进行减压浓缩后,浓缩液密度应达到1.1-1.3g/cm3。
7.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(2)中,有机溶剂选择甲醇、乙醇或丙酮中的一种,浓缩液与有机溶剂的体积比为1:4-6,进行有机溶剂沉淀时,采用4℃保温,静置12-18h。
8.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(3)中,沉淀与蒸馏水的质量体积比为1:10-30;活性炭与沉淀物的质量比为1:4-9。
9.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法,其特征在于,步骤(3)中,进行活性炭脱色时,采用恒温水浴加热,温度为50-60℃,时间为2-4h。
10.一种权利要求1-9任意一项所提取的油茶果壳多糖的应用,其特征在于,所得油茶果壳多糖用于制备增强RAW264.7细胞免疫反应的药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211236364.0A CN115448992B (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211236364.0A CN115448992B (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115448992A true CN115448992A (zh) | 2022-12-09 |
CN115448992B CN115448992B (zh) | 2024-07-16 |
Family
ID=84309237
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211236364.0A Active CN115448992B (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115448992B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103450316A (zh) * | 2012-05-29 | 2013-12-18 | 上海莱博生物科技有限公司 | 一种同时提取茶皂素、茶籽黄酮苷和茶多糖的方法 |
CN104744554A (zh) * | 2015-03-29 | 2015-07-01 | 安徽中盛食用油科技有限公司 | 一种从油茶粕中联产茶多酚、茶多糖和茶皂素的方法 |
CN108147955A (zh) * | 2018-02-22 | 2018-06-12 | 温州瑞思生物科技有限公司 | 一种从生姜中提取姜黄素的方法 |
-
2022
- 2022-10-10 CN CN202211236364.0A patent/CN115448992B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103450316A (zh) * | 2012-05-29 | 2013-12-18 | 上海莱博生物科技有限公司 | 一种同时提取茶皂素、茶籽黄酮苷和茶多糖的方法 |
CN104744554A (zh) * | 2015-03-29 | 2015-07-01 | 安徽中盛食用油科技有限公司 | 一种从油茶粕中联产茶多酚、茶多糖和茶皂素的方法 |
CN108147955A (zh) * | 2018-02-22 | 2018-06-12 | 温州瑞思生物科技有限公司 | 一种从生姜中提取姜黄素的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CHUANQI XIE等: "The polysaccharide from Camellia oleifera fruit shell enhances immune responses via activating MAPKs and NF-κB signaling pathways in RAW264.7 macrophages" * |
林欣颖等: "油茶果壳多糖的提取工艺及免疫活性研究" * |
沈建福等: "油茶果壳多糖的提取及抗氧化作用研究" * |
黎青等: "油茶酸性多糖OTAPS-1的分离纯化及其免疫调节活性研究" * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115448992B (zh) | 2024-07-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112961260A (zh) | 一种具有显著抗炎活性龙须菜多糖及其制备方法与应用 | |
CN102212144B (zh) | 一种从紫花苜蓿干草中制备纯多糖的方法 | |
CN110128562B (zh) | 一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用 | |
CN114377428A (zh) | 一种应用低共熔溶剂绿色高效提取黄精中的黄酮类化合物的方法 | |
CN114874344B (zh) | 青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其应用 | |
CN112480278A (zh) | 一种白及多糖及其提取方法 | |
CN103183742A (zh) | 一种含有高分子量聚古罗糖醛酸的褐藻胶及其应用 | |
CN106749731A (zh) | 一种小分子三七多糖提取物的制备方法及应用 | |
CN111019984A (zh) | 一种提取燕窝中唾液酸的高效方法 | |
CN107281258B (zh) | 一种豆芋叶黄酮类提取物及其制备方法和应用 | |
CN111499681A (zh) | 一种柠檬苦素的提取方法 | |
CN102146143B (zh) | 人参、西洋参提取渣制备果胶及纤维素的方法和应用 | |
LU505842B1 (en) | Method of preparing an extract of chayote | |
CN115448992A (zh) | 一种油茶果壳多糖提取方法及其应用 | |
CN115057900B (zh) | 一种从黑果腺肋花楸中提取花色苷的方法 | |
CN103266150A (zh) | 利用甜菜粕制备功能性低聚糖的方法 | |
CN116023422A (zh) | 一种从人参渣中提取人参皂苷及提取后残渣利用的方法 | |
CN105753920B (zh) | 一种从荔枝果肉中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 | |
CN113105567B (zh) | 一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途 | |
CN104074086A (zh) | 一种从苦菜中提取纤维素的方法 | |
CN110054704B (zh) | 采用硫酸铵及ctab沉淀结合大孔树脂精制凉粉草多糖的方法 | |
CN111440249A (zh) | 一种茯砖茶多糖的提取方法 | |
CN113057244A (zh) | 一种具有免疫调节作用的压片糖果制备工艺 | |
CN102942634B (zh) | 一种韭菜籽中的多糖提取物及其提取方法 | |
CN112174925A (zh) | 一种微波辅助提取葡萄籽原花青素的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |