CN115444894B - 早期干预肝纤维化的组合物及其制备方法、制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了早期干预肝纤维化的组合物及其制备方法、制剂，其中组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油0.3‑0.5份、破壁灵芝孢子粉0.3‑3份、葡萄籽粉0.5‑1份、葡萄籽原粉20‑50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5‑30微米粒径的干燥颗粒物。本发明通过优化药物组合物的构成，在综合利用灵芝孢子油在早期干预肝纤维化，具有更高的施用灵活性和干预高效性。
Description
技术领域
本发明是关于医药技术领域，特别是关于一种早期干预肝纤维化的组合物及其制备方法、制剂。
背景技术
肝脏是人体内脏里最大的器官，解剖学上位于人体中的腹部位置，在右侧横膈膜之下，位于胆囊之前端，且于右边肾脏的前方，胃的上方。肝脏是人体消化***中最大的消化腺，在身体里面起着去氧化，储存肝糖，参与蛋白质的代谢等作用，肝脏也分泌胆汁参与消化活动。此外，从各种途径进入人体的外源化学物和人体代谢产生的有毒有害物质最终都在肝内转化或贮留，各种有害的毒性物质均可引起急性、慢性肝损伤，引起肝细胞坏死和凋亡、炎症、纤维化等病理改变。
引起肝纤维化的原因主要有：
1）病毒性肝炎。据研究发现慢性病毒性肝炎一般都伴有程度不等的肝纤维化，乙型与丙型病毒性肝炎是引起肝硬化最常见的病因。因为病毒的持续性存在，反复或持续的炎症浸润可导致肝实质发生炎症、坏死等病理变化，致使肝脏持续不断的纤维增生而逐渐形成肝纤维化。
2）酒精肝。酒精肝成为继病毒性肝炎后导致肝纤维化的第二大病因。酗酒可导致酒精肝病情的发展，因其中间代谢产物乙醛不仅直接损伤肝脏，还可对肝脏产生氧化应激和脂质过氧化损伤，进而诱发肝脏代谢紊乱，促进炎症免疫反应和肝纤维化的发生，若长此以往下去，可导致酒精性肝硬化的发生。
3）脂肪肝。随着生活节奏的加快、生活方式的改变以及高脂肪、高热量的饮食增加，脂肪肝在东西方国家均有增加趋势。由于各种原因引起的脂肪在肝内过度蓄积，造成肝脏的持续性损伤，导致肝细胞的脂肪变性、脂质代谢的紊乱，使肝脏对炎症反应和各种肝损伤因素的易感性增高，进而促进肝脏纤维化的发生及发展。
4）自身免疫性疾病。在临床上像肝细胞受累的自身免疫性肝炎或胆管细胞受累的原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎，这类患者其自身的免疫***会攻击肝脏，而引起感染，导致肝纤维化或肝硬化的发生。
基于上述致病机制等的研究，在当前日益改善的生活条件下，肝纤维化导致的一系列疾病已经成为影响身体健康的重要因素。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新的早期干预肝纤维化的组合物及其制备方法、制剂。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了早期干预肝纤维化的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3-0.5份、破壁灵芝孢子粉0.3-3份、葡萄籽粉（指葡萄籽提取物萄多酚）0.5-1份、葡萄籽原粉20-50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5-30微米粒径的干燥颗粒物。组合物中还可以包括番茄红素0.1-0.3份，这里番茄红素作为抗氧化干预剂，在药剂施用过程中，可以调整肌体环境中的氧化水平，从而进一步地控制如酒精、氧自由基等的影响。
在本发明的一个或多个实施方式中，葡萄籽原粉为在脱脂后还经过酶解处理的。
在本发明的一个或多个实施方式中，酶解所采用的酶为木瓜蛋白酶。
在本发明的一个或多个实施方式中，酶解时木瓜蛋白酶的用量占葡萄籽原粉质量的0.1-0.5%。
在本发明的一个或多个实施方式中，酶解为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的40-60%的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至50-60℃，保温40-60min。本方案可以再对葡萄籽粉粉碎的颗粒物进行酶解处理，一方面充分利用葡萄籽中蛋白质成分，提升营养价值的同时，还可以进一步在改善葡萄籽颗粒的孔穴结构，从而进一步优化对灵芝孢子油乳化体系的吸附性，并且利于酶解得到的氨基酸成分的在体系中分布特别是向乳化微球中转移的可行性和高效性。当然这里的酶解程度应当适当控制为不完全的程度，以免葡萄籽颗粒因脱脂/酶解过于完全而孔穴结构过于松散，乳化微球等有效成分聚集体过于深度而影响释放吸收。
在本发明的一个或多个实施方式中，原料还包括0.03-0.05份的纯水。
在本发明的一个或多个实施方式中，纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液。本方案中通过引入微量的纯水成分，在与灵芝孢子油充分乳化的过程中，理由乳化形成的微球颗粒吸附和聚集灵芝多糖、多肽、蛋白质、氨基酸、葡萄糖、微量元素等成分，并且在微球的分层界面对灵芝酸等成分进行聚集，从而在乳化体系中实现有效成分的局部汇聚和有效分散。并且正是通过这一乳化微球结构的实现，在对葡萄籽原粉吸附过程中，由于乳化微球结构的存在可以富集与葡萄籽原粉所提供的孔穴结构的浅表层，却不影响葡萄籽原粉对于脂肪酸辅剂的深层吸收，从而葡萄籽原粉颗粒上形成了有效成分的梯度分布，在用药过程中，相对于表层的较深层有效成分的释放滞后性，可以在一定程度上延长组合物有效成分的释放峰值时间。
在本发明的一个或多个实施方式中，早期干预肝纤维化的组合物的制备方法，包括如下步骤：准备灵芝孢子油；准备葡萄籽原粉，将葡萄籽干品粉碎得到的颗粒物与适量强碱溶液混合后，加热脱脂，干燥即可得到具有微孔结构的葡萄籽原粉；灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合吸附后，再与其余原料充分混合即可。
优选的，本发明方案中对葡萄籽颗粒物的脱脂是指部分脱脂，也就是通过脱脂作业去除葡萄籽干品粉碎后的颗粒物中50-80%的脂质，这就可以在应用过程中进一步地参与到对灵芝孢子油的附着控制，形成一个更为高效的载体，通过以颗粒物中残留脂基改善与孢子油的吸附性，从而提升对孢子油的吸附效率和吸附稳定性，尤其是针对灵芝孢子油中脂肪酸辅剂的吸附，从而降低灵芝酸等有效成分被吸收的同时，大量脂肪酸辅剂的摄入可能性，从而实现对肝纤维化的进一步干预控制。
在本发明的一个或多个实施方式中，制剂，包括早期干预肝纤维化的组合物。
在本发明的一个或多个实施方式中，制剂选自胶囊制剂、液剂、粉剂、片剂、颗粒剂、丸剂。也就是该组合物可以满足用于口服、注射等应用形式的制剂要求，如软胶囊制剂、缓释胶囊制剂、注射粉剂、口服粉剂、口服颗粒剂/散剂、口服丸剂等。
肝纤维化是继发于各种慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应，也是所有慢性肝病的共同病理过程，其终末阶段将发展为肝硬化、门脉高压、肝衰竭及肝癌。肝炎、肝硬化、肝癌被称作“肝病三步曲”。研究表明，早期肝纤维化具有逆转性，因此早期干预肝纤维化的进展对预防肝癌的发生尤为重要。如何有效地防治肝纤维化，阻断其进展，已经成为国内外研究的热点。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的早期干预肝纤维化的组合物及其制备方法、制剂以四氯化碳（CCl4）和高脂饲料联合诱导的大鼠肝纤维化模型，考察灵芝孢子油、灵芝孢子粉对肝纤维化的防治作用，探讨其可能的作用机制，为灵芝孢子相关产品作为肝癌预防的潜在药物开发提供理论依据。本发明通过采用优化的灵芝孢子油/灵芝孢子粉的复合制剂可更好的改善40% CCl4联合高脂饲料致肝纤维化模型大鼠生存状态，提高大鼠存活率的作用；可以显著的降低肝纤维化相关指标ECM（HA、LN、Col-IV、Hyp）的水平，降低肝组织中的胶原面积占比及面密度值，促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路信号转导，进而发挥抑制肝纤维化的作用；具有保护肝脏和潜在的防治肝癌作用。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的各组大鼠肝脏病理HE染色（200×）结果；
图2是根据本发明一实施方式的各组大鼠肝脏病理Masson染色（200×）结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本领域技术人员知道，肝纤维化的形成是由于上述原因引起的肝细胞损伤、坏死、凋亡及肝组织的炎症反应，激活Kupffer细胞分泌多种细胞因子，随同肝细胞、血小板、窦内皮细胞等分泌的细胞因子、脂质过氧化产物等化学递质共同作用于肝星状细胞（HSC），使之激活转变为肌成纤维细胞，发生表型及功能改变，并通过旁分泌及自分泌机制，使肌纤维母细胞（MFB）增殖，合成大量胶原蛋白和蛋白多糖等细胞外基质（ECM）。肝纤维化持续发展的中心环节在于肝细胞损伤时对周围非实质细胞的不断刺激，导致ECM的大量合成与沉淀，发展下去会导致肝组织结构的破坏与改建。
肝纤维化发生机制是一个复杂的病理过程，涉及病理组织学、细胞学、细胞因子及其分子水平的调节。
1）Gressner等人提出的HSC激活的“三部级联反应”模式反应
HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%。其主要功能是贮存和代谢维生素A，合成和分泌少量ECM，以及一定的产生胶原酶的能力。
正常肝脏中，HSC处于静息状态，增生活性很低。在肝损伤和各种慢性肝病发生时HSC被激活，其表型由静息型转化为激活型，胞体增大，胞突伸展，胞质中脂滴消失，维生素A含量减少，胞质内粗面内质网、高尔基体发达，呈现出旺盛的蛋白质合成能力。此后，细胞增生频率增加，并且向肝损伤部位迁徙，表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等，此时，HSC成为MFB，收缩性增强，这被称为启动。
激活后的HSC细胞表达多种细胞因子及受体，如转化生长因子（TGF-α、TGF-β1）、成纤维生长因子（FGF）、血小板衍生因子（PDGF）和胰岛素生长因子（IGF-1）等，其通过旁分泌和自分泌促进激活型HSC快速转化为MFB，同时激活静止的肌纤维母细胞大量增殖，合成ECM。
目前认为，HSC是肝纤维化时ECM的最主要来源细胞，HSC的活化是肝纤维化发生的关键，是肝纤维化发生中的决定性事件。
2）Kupffer细胞（Kupffer cells，KC）细胞
KC也是启动HSC激活的重要因素。肝脏受损时KC被激活，可释放大量细胞因子，包括TGF-α、TGF-β1、PDGF、TNF-α以及IL-1、IL-6等，均是启动纤维化的重要因素。
3）肝细胞（HC）
在肝纤维化形成过程中HC的主要作用是启动HSC的激活。激活机制有：正常HC胞膜对HSC的增殖有接触性抑制作用，HC受损时其胞膜的破坏导致其对HSC的接触抑制作用丧失，从而激活HSC；释放出某些有丝***因子如TGF-α、IGF-1、FGF及其相应的结合蛋白等促进HSC的增殖；产生脂质过氧化产物如自由基、反应性醛等可激活HSC；与KC协调作用激活HSC；损伤的肝细胞膜表面精氨酸酶减少，可通过减少对周围微环境中精氨酸的分解激活HSC。
4）MMP-9/TIMP-1信号通路
参与ECM降解的酶是基质金属蛋白酶（MMPs），MMPs的表达受金属蛋白酶抑制剂（TIMP）和纤溶酶原活化剂尿激酶（uPA）的影响。激活型HSC会下调MMP的表达，增加TIMP的合成，从而减少ECM成分的降解，促使ECM在肝内沉积，加快肝纤维化进展。
实施例01
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3份、破壁灵芝孢子粉0.3份、葡萄籽粉0.5份、葡萄籽原粉35份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的15微米粒径的干燥颗粒物。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
取本实施例样品作为实验组药物进行有效性验证（包括而不限于本实施例的本发明技术方案均可以采用该方案进行测试），其效能测定方法为：雄性SPF级SD大鼠按照体重随机分为6组，空白对照组、模型对照组、阳性药物组、灵芝孢子油组、破壁灵芝孢子粉组及灵芝孢子油/灵芝孢子粉组（本实施例的实验组），每组10只。除空白对照组外，其余各组均建立40% CCl4联合高脂饲料致肝纤维化模型。造模同时给药，造模至6周，给药至8周。观察各组大鼠状态，记录饮食量、饮水量、体重变化等情况；微板法及ELSA法检测血浆中透明质酸（HA）、层黏蛋白（LN）、IV型胶原（Col IV）、羟脯氨酸（Hyp）水平；ELISA法检测肝脏组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、MMPs组织抑制物-1（TIMP-1）的蛋白表达水平。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠60只，雄性，体重150-170 g，购自中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK（京）2017-0005。饲养于北京理工大学SPF级实验动物中心，在12小时昼夜循环，温度22±2℃，湿度50±5%的房间里，各组动物均自由进食饮水。
1.2 鼠料
购买普通生长饲料，供正常对照组大鼠喂养；购买50Kcal%的高脂饲料，供造模大鼠喂养。2种饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲料生产许可证号：京饲证（2019）06076。
1.3 实验药品及试剂
灵芝孢子油、破壁灵芝孢子粉、复方鳖甲软肝片、四氯化碳、玉米油、水合氯醛、多聚甲醛固定液、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测试盒、透明质酸（HA）测试盒、层粘蛋白（LN）测试盒、IV型胶原蛋白（Col IV）测试盒、基质金属蛋白酶（MMP-9）测试盒、基质金属蛋白酶-1抑制因子（TIMP-1）测试盒等。
1.4 实验仪器设备及耗材
FA2004电子天平、JY6001电子天平、水浴锅、烘箱、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪、紫外可见分光光度计、手术器械套组、微量移液器、大鼠灌胃器、大鼠固定器、抗凝EP管、离心管、移液器配套枪头、烧杯、量筒、手套、称量纸、铝箔纸、滤纸等。
2 实验方法
2.1 大鼠造模及给药
60只SPF级SD大鼠，适应性饲养1-2周后，按照体重随机分为6组，空白对照组（对照组1）、模型对照组（对照组2）、阳性药物组（对照组3）、灵芝孢子油组（对照组4）、破壁灵芝孢子粉组（对照组5）、实验组（灵芝孢子油/灵芝孢子粉组），每组10只。除空白对照组外，其余各组灌胃给予40 %四氯化碳-玉米油混合液，每周2次，连续6周，每次灌胃量为0.3 mL/100g，首次加倍（0.5 mL/100g），同时使用高脂饲料进行饲养，建立大鼠肝纤维化模型。
造模的同时，各组给予下表4所示的相应药物进行灌胃（模型组灌胃溶剂对照），1次/日，灌胃剂量为1.0 mL/100g，连续给药8周。空白对照组大鼠不进行造模，灌胃采用等体积纯水替代，使用常规维持饲料进行饲养。具体给药信息见表4。
表4 各组大鼠分组及给药情况表
| 序号 | 组别 | 药品信息 | 给药剂量（mg/kg） |
| 1 | 正常对照组 | 纯水 | — |
| 2 | 模型对照组 | 空白溶剂（玉米油） | — |
| 3 | 阳性药物组 | 复方鳖甲软肝片 | 540 |
| 4 | 灵芝孢子油组 | 灵芝孢子油 | 2700 |
| 5 | 破壁灵子孢子粉组 | 破壁灵芝孢子粉 | 2700 |
| 6 | 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 实施例01组合物 | 2700 |
注：各组药品灌胃使用玉米油作为溶剂。
2.2 一般状态观察及称重
给药期间，密切观察每只大鼠的精神状态、毛色状态、***情况。
每周测定1次各组大鼠体重，每周测定2次各组大鼠饮水量、进食量。
2.3 大鼠处死取材
末次给药后禁食12 h，自由饮水，大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，应用负压采血管（肝素抗凝管）腹主动脉取血，室温静置2~3 h，以3000转/分离心10min，移液器分离血浆，血浆分装多份并置于-20℃冰箱保存备生化指标检测。
解剖取部分左肝叶、心脏、胰腺、脾脏、一个肾脏置于4%多聚甲醛中固定，24 h后更换新的多聚甲醛。铝箔纸包裹剩余肝脏、一个肾脏，标记组别编号，置于-80℃冰箱中长期保存。
2.4肝组织病理检测
取已固定好的大鼠部分左叶肝脏，修整组织，进行石蜡包埋，制作肝组织石蜡切片。
进行HE染色，观察大鼠肝脏组织结构变化。肝脏细胞形态是否完整，细胞质是否出现水肿、脂肪变性，肝小叶结构是否清晰，炎细胞是否聚集，肝血窦结构是否正常，是否出现粉红色的胶原纤维。
进行Masson染色。染色后，肝组织细胞核呈蓝褐色，细胞质呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，结果直接反映肝纤维化程度。
本部分实验委托南京塔克隆生物医药科技有限公司完成。
2.5血液指标测定
ELISA法检测血浆中透明质酸（HA）、层黏蛋白（LN）、IV型胶原（Col IV）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），及肝组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、MMPs组织抑制物-1（TIMP-1）的水平。相关实验步骤详见对应试剂盒说明书。
2.6 统计分析
应用SPSS 22.0将数据结果进行统计学分析，实验数据以±s表示，各组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，p<0.05表示差异具有统计学意义。
3 实验结果
3.1 一般状态观察及称重
3.1.1饮水量与进食量
平均日饮水量与日进食量间接反映大鼠的精神状态。表5与表6为各组大鼠的平均日饮水量与进食量结果。模型对照组平均日饮水量、进食量整体低于空白对照组，而灵芝孢子油/灵芝孢子粉组则较模型对照组有所升高。
结果表明，灵芝孢子油/灵芝孢子粉的复合制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量。
表5 各组大鼠平均日饮水量结果（g）
| 组别 | 1周 | 2周 | 3周 | 4周 | 5周 | 6周 | 7周 |
| 空白对照组 | 31.43 | 40.82 | 41.33 | 34.98 | 37.57 | 37.50 | 43.41 |
| 模型对照组 | 29.67 | 37.93 | 32.35 | 34.86 | 28.72 | 29.19 | 30.68 |
| 阳性药物组 | 30.81 | 40.03 | 28.46 | 33.71 | 33.00 | 34.58 | 33.09 |
| 灵芝孢子油组 | 29.64 | 40.26 | 30.37 | 33.65 | 32.60 | 36.58 | 32.64 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 32.45 | 40.03 | 32.12 | 34.21 | 35.80 | 38.14 | 31.04 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 41.32 | 51.90 | 40.04 | 40.99 | 41.11 | 49.30 | 40.27 |
表6 各组大鼠平均日进食量结果（g）
| 组别 | 1周 | 2周 | 3周 | 4周 | 5周 | 6周 | 7周 |
| 空白对照组 | 29.39 | 30.99 | 31.35 | 29.63 | 27.77 | 26.66 | 27.82 |
| 模型对照组 | 17.33 | 25.98 | 19.37 | 24.34 | 23.13 | 25.79 | 23.99 |
| 阳性药物组 | 17.68 | 26.56 | 18.39 | 23.52 | 21.85 | 26.82 | 26.07 |
| 灵芝孢子油组 | 17.26 | 26.40 | 17.78 | 26.14 | 24.83 | 29.82 | 27.50 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 19.77 | 27.72 | 20.78 | 26.70 | 27.27 | 30.90 | 29.53 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 20.34 | 29.18 | 20.53 | 25.55 | 25.23 | 31.12 | 31.24 |
3.1.2 体重变化
各组大鼠给药前、后体重结果见表7，给药前各组间体重无显著差异。实验结束，模型对照组大鼠体重水平最低，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组大鼠体重较高，已接近空白对照组大鼠体重（p＞0.05）。结合饮水量与进食量结果分析，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组显著改善了模型大鼠的生存状态。
表7 给药前、后各组大鼠体重结果（± s，g）
| 组别 | 给药前体重 | P值（VS空白组） | 实验结束体重 | P值（VS空白组） |
| 空白对照组 | 188.5±10.1 | 427.8±49.9 | ||
| 模型对照组 | 188.4±12.1 | 0.982 | 395.0±46.0 | 0.126 |
| 阳性药物组 | 189.7±9.2 | 0.739 | 421.0±32.0 | 0.742 |
| 灵芝孢子油组 | 187.5±9.4 | 0.798 | 397.5 ± 42.6 | 0.134 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 188.8±7.1 | 0.922 | 389.9±48.9 | 0.069 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 190.7±7.5 | 0.557 | 424.4±46.6 | 0.868 |
综合结果表明，灵芝孢子油/灵芝孢子粉的复合制剂可以改善实验大鼠的生存状态，对40% CCl4联合高脂饲料造大鼠肝纤维化模型具有明显的保护作用。
3.1.3存活率
表8为各组大鼠的存活情况。结果显示，空白对照组喂养期间无死亡；模型对照组及各给药组个别大鼠死亡，其中灵芝孢子油/灵芝孢子粉组最优，存活率为100%，较模型对照组提高42.8%。
表8 大鼠存活情况表
3.2 肝组织病理检测
各组大鼠HE染色与Masson染色结果见图1至图2。
HE染色结果显示，空白对照组大鼠肝组织结构正常，静脉周围见少量的胶原纤维，未见明显胶原纤维增生。模型对照组大鼠肝组织汇管区及中央静脉周围见明显的胶原纤维增生，伴有炎性细胞浸润，不同静脉间互相连接，形成纤维桥接；汇管区周围胆管增生，并可见胆管轻度扩张；明显的肝细胞脂肪变性，胞质内可见大小不一的圆形空泡；较多的肝细胞水肿，胞质疏松淡染。
Masson染色下可见模型对照组大鼠肝组织不同静脉间增生的胶原纤维互相连接，形成假小叶。各给药组大鼠肝组织结构较模型对照组不同程度改善，其中灵芝孢子油/灵芝孢子粉组改善效果最为显著。将Masson染色结果使用Image-Pro Plus 6.0分析软件分析，测定胶原纤维累积光密度值（IOD）、组织像素面积（Area），计算得到胶原面积占比（见表9）与面密度（见表10）。
表9 各组大鼠Masson染色分析结果（一）（± s）
| 组别 | 胶原面积占比（%） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 0.78±0.70 | ||
| 模型对照组 | 9.12±4.03 | < 0.001 | |
| 阳性药物组 | 5.66±3.08 | 0.001 | 0.016 |
| 灵芝孢子油组 | 4.99±2.80 | 0.004 | 0.004 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 5.36±3.93 | 0.002 | 0.009 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 4.19±1.45 | 0.018 | 0.001 |
表10 各组大鼠Masson染色分析结果（二）（± s）
| 组别 | 面密度（IOD/Area） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 0.0036±0.0032 | ||
| 模型对照组 | 0.0445±0.0137 | < 0.001 | |
| 阳性药物组 | 0.0252±0.0154 | 0.004 | 0.009 |
| 灵芝孢子油组 | 0.0265±0.0147 | 0.002 | 0.015 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 0.0270±0.0204 | 0.002 | 0.017 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 0.0247±0.0142 | 0.005 | 0.007 |
胶原面积占比及面密度结果显示，模型对照组极显著高于空白对照组（p<0.01）。而与模型对照组相比，各给药组不同程度降低了胶原面积占比值，其中灵芝孢子油/灵芝孢子粉组与模型对照组间存在显著性差异（p<0.01）。
综合结果表明，灵芝孢子制剂具有降低造模大鼠肝组织纤维化的作用，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组作用效果最优。
3.3 血液中肝纤维化相关指标检测
肝纤维化持续发展的中心环节在于肝细胞损伤时对周围非实质细胞的不断刺激，导致HA、LN、Col IV、Hyp等ECM的大量合成与沉淀，发展下去会导致肝组织结构的破坏与改建。
HA 是一种大分子氨基多糖，由肝***合成，在体内参与基质的构成，主要由肝窦内皮细胞摄取和分解；肝细胞受损时肝间质增生，HSC合成 HA 增加而肝窦内皮细胞受损导致HA 摄取和分解减少，加上通过侧支进入体循环，均使血中 HA 水平升高，且其升高程度与此时的肝纤维化程度部分相关，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况。
大鼠血浆HA检测结果（见表14）显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠血浆中HA的含量升高极显著（p<0.01）；而与模型对照组比较，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组HA的含量降低14.9%，差异具有显著性（p<0.05），且与空白对照组间未存在显著差异（p>0.05）。
表14 各组大鼠血浆透明质酸（HA）结果（± s）
| 组别 | HA（ng/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 260.91±47.64 | ||
| 模型对照组 | 330.10±60.39 | 0.004 | |
| 阳性药物组 | 288.81±40.33 | 0.219 | 0.092 |
| 灵芝孢子油组 | 322.04±54.98 | 0.013 | 0.753 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 319.92±61.20 | 0.011 | 0.675 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 280.86±45.50 | 0.378 | 0.045 |
LN是基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，慢性活动性肝炎和肝硬变及原发性肝癌时会明显增高。血浆中LN的含量可反映肝纤维化的进展与严重程度，同时LN与肿瘤浸润、转移也具有相关性。
LN检测结果（见表15）显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠血浆中LN的含量升高极显著（p<0.01）；而与模型对照组比较，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组LN的含量降低6.8%，差异具有显著性（p<0.05），且与空白对照组间未存在显著差异（p>0.05）。
表15 各组大鼠血浆层黏蛋白（LN）结果（± s）
| 组别 | LN（pg/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 650.79±61.78 | ||
| 模型对照组 | 724.30±57.04 | 0.003 | |
| 阳性药物组 | 680.23±50.61 | 0.214 | 0.085 |
| 灵芝孢子油组 | 691.57±44.28 | 0.108 | 0.224 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 703.51±50.46 | 0.028 | 0.412 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 674.90±39.66 | 0.298 | 0.049 |
Col IV在肝纤维化时最早出现，当纤维组织增生活跃，纤维组织生成过程中有大量胶原沉积，各种胶原均有所增加，但其中最为重要的就是构成基底膜的Col IV的增加，因此，Col IV是肝纤的早期标志之一，其浓度与肝纤维化程度相关。同时，也是观察肝硬化的重要指标之一。
Col IV检测结果（见表16）显示，模型对照组与空白对照组比较，大鼠血浆中ColIV的含量升高极显著（p<0.01）；与模型对照组比较，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组Col IV的含量降低9.3%，差异具有极显著性（p<0.01），且与空白对照组间未存在显著差异（p>0.05）。
表16 各组大鼠血浆IV型胶原（Col IV）结果（± s）
| 组别 | Col IV（pg/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 135.47±10.01 | ||
| 模型对照组 | 156.97±12.14 | < 0.001 | |
| 阳性药物组 | 150.33±7.04 | 0.002 | 0.183 |
| 灵芝孢子油组 | 142.91±12.64 | 0.134 | 0.009 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 146.72±10.62 | 0.017 | 0.041 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 142.42±9.92 | 0.132 | 0.004 |
Hyp作为基本的组织纤维化检测指标，在胶原蛋白中含量最高，是胶原代谢的重要产物，血液中HYP含量取决于胶原合成和分解的速度。
Hyp检测结果（见表17）显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠血浆中Hyp的含量升高极显著（p<0.01）；而与模型对照组比较，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组Hyp的含量降低23.1%，差异具有显著性（p<0.01），且与空白对照组间不存在显著差异（p>0.05）。
表17 各组大鼠血浆羟脯氨酸（Hyp）结果（± s）
| 组别 | Hyp（μg/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 25.71±2.69 | ||
| 模型对照组 | 33.44±5.38 | < 0.001 | |
| 阳性药物组 | 27.62±6.19 | 0.263 | 0.002 |
| 灵芝孢子油组 | 28.57±1.76 | 0.117 | 0.013 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 28.66±5.19 | 0.115 | 0.019 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 25.71±4.71 | 1.000 | < 0.001 |
综合结果表明，灵芝孢子制剂具有明显的抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的作用，其中灵芝孢子油/灵芝孢子粉的复合制剂的抗纤维化作用最优。
3.4 作用机制探究
肝纤维化的形成主要是因肝脏纤维***过度沉积，ECM合成和降解动态失衡造成的。ECM主要包括胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖等。基质金属蛋白酶MMP-9具有降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障等作用；而属蛋白酶抑制剂TIMP-1则具有抑制MMP-9的表达的作用，因此MMP-9/TIMP-1信号转导失调是促进肝纤维化及肝癌发展的重要原因。
本研究中，各组大鼠肝组织中MMP-9和TIMP-1蛋白水平测定结果见表20与表21。
测定结果显示，与空白对照组比较，模型对照组肝组织中MMP-9蛋白水平明显降低（p<0.05）；而各给药组结果则均较模型对照组有不同程度升高，其中灵芝孢子油/灵芝孢子粉组升高最为显著（p<0.01），其MMP-9蛋白水平提高11.0%。与空白对照组比较，模型对照组的TIMP-1蛋白水平明显升高（p<0.05）；各给药组结果均较模型对照组不同程度降低。
综合结果表明，灵芝孢子+粉的复合制剂具有促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，进而发挥抑制肝纤维化、保护肝脏的作用。
表20 各组大鼠肝脏基质金属蛋白酶-9（MMP-9）测定结果（± s）
| 组别 | MMP-9（ng/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 127.22±9.84 | ||
| 模型对照组 | 117.19±6.56 | 0.013 | |
| 阳性药物组 | 122.61±9.33 | 0.230 | 0.189 |
| 灵芝孢子油组 | 125.36±7.05 | 0.661 | 0.073 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 123.81±10.33 | 0.374 | 0.110 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 130.03±6.44 | 0.463 | 0.002 |
表21 各组大鼠肝脏基质MMPs组织抑制物-1（TIMP-1）测定结果（± s）
| 组别 | TIMP-1（ng/mL） | P值（VS空白组） | P值（VS模型组） |
| 空白对照组 | 40.41±6.16 | ||
| 模型对照组 | 45.62±6.88 | 0.024 | |
| 阳性药物组 | 40.50±4.22 | 0.967 | 0.033 |
| 灵芝孢子油组 | 42.37±4.59 | 0.404 | 0.195 |
| 破壁灵芝孢子粉组 | 45.28±4.13 | 0.029 | 0.885 |
| 灵芝孢子油/灵芝孢子粉组 | 44.72±5.48 | 0.053 | 0.702 |
本实施例验证结论：
1）灵芝孢子制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量，其中灵芝孢子油+粉组最优，存活率为100%。
2）灵芝孢子制剂各剂量组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油+粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）灵芝孢子制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中灵芝孢子油+粉组抗纤维化作用效果最优，分别降低14.9%、6.8%、9.3%、23.1%，差异均具有显著性（p<0.01或p<0.05）。
4）灵芝孢子制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，灵芝孢子油+粉组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平提高了11.0%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
实施例02
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.4份、破壁灵芝孢子粉1份、葡萄籽粉0.7份、葡萄籽原粉20份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5微米粒径的干燥颗粒物。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例03
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.5份、破壁灵芝孢子粉3份、葡萄籽粉1份、葡萄籽原粉40份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的20微米粒径的干燥颗粒物。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例04
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.35份、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过同等实验条件下验证表明，实施例02-04与实施例01具有基本一致的早期干预肝纤维化效果，重复性和一致性良好。
实施例11
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3份、破壁灵芝孢子粉0.3份、葡萄籽粉0.5份、葡萄籽原粉35份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的15微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉为脱除50%脂质的葡萄籽干品粉碎后的颗粒物。其脱脂操作采用本领域常规技术，这里可以为：破碎后的葡萄籽颗粒物加入适量的石油醚中浸泡1d进行脱脂处理，石油醚与葡萄籽的体积质量比为：5ml：1g，而后去除溶剂和干燥即可。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过与实施例01同等条件下实验验证，本实施例验证结论：
1）灵芝孢子制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量，其中灵芝孢子油+粉组最优，存活率为100%。
2）灵芝孢子制剂各剂量组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油+粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）灵芝孢子制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中灵芝孢子油+粉组抗纤维化作用效果最优，分别降低15.4%、7.3%、9.8%、23.5%，差异均具有显著性（p<0.01或p<0.05）。
4）灵芝孢子制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，灵芝孢子油+粉组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平提高了13.0%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
实施例12
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.4份、破壁灵芝孢子粉1份、葡萄籽粉0.7份、葡萄籽原粉20份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉为脱除60%脂质的葡萄籽干品粉碎后的颗粒物。其脱脂操作采用本领域常规技术，这里可以为：破碎后的葡萄籽颗粒物加入适量的石油醚中浸泡1.5d进行脱脂处理，石油醚与葡萄籽的体积质量比为：6ml：1g，而后去除溶剂和干燥即可。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例13
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.5份、破壁灵芝孢子粉3份、葡萄籽粉1份、葡萄籽原粉40份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的20微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉为脱除70%脂质的葡萄籽干品粉碎后的颗粒物。其脱脂操作采用本领域常规技术，这里可以为：破碎后的葡萄籽颗粒物加入适量的石油醚中浸泡2d进行脱脂处理，石油醚与葡萄籽的体积质量比为：8ml：1g，而后去除溶剂和干燥即可。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例14
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.35份、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉为脱除80%脂质的葡萄籽干品粉碎后的颗粒物。其脱脂操作采用本领域常规技术，这里可以为：破碎后的葡萄籽颗粒物加入适量的石油醚中浸泡3d进行脱脂处理，石油醚与葡萄籽的体积质量比为：8ml：1g，而后去除溶剂和干燥即可。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过同等实验条件下验证表明，实施例12-14与实施例11具有基本一致的早期干预肝纤维化效果，重复性和一致性良好。
实施例21
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3份、破壁灵芝孢子粉0.3份、葡萄籽粉0.5份、葡萄籽原粉35份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的15微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例11处理。
葡萄籽原粉为在脱脂后还经过占所述葡萄籽原粉质量的0.1%的木瓜蛋白酶解处理的，其中酶解过程为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的40%的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至50℃，保温40min。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过与实施例01同等条件下实验验证，本实施例验证结论：
1）灵芝孢子制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量，其中灵芝孢子油+粉组最优，存活率为100%。
2）灵芝孢子制剂各剂量组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油+粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）灵芝孢子制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中灵芝孢子油+粉组抗纤维化作用效果最优，分别降低16.2%、7.9%、11%、25.1%，差异均具有显著性（p<0.01或p<0.05）。
4）灵芝孢子制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，灵芝孢子油+粉组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平提高了14.5%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
实施例22
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.4份、破壁灵芝孢子粉1份、葡萄籽粉0.7份、葡萄籽原粉20份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例12处理。
葡萄籽原粉为在脱脂后还经过占所述葡萄籽原粉质量的0.3%的木瓜蛋白酶解处理的，其中酶解过程为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的50%的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至55℃，保温50min。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例23
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.5份、破壁灵芝孢子粉3份、葡萄籽粉1份、葡萄籽原粉40份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的20微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例13处理
葡萄籽原粉为在脱脂后还经过占所述葡萄籽原粉质量的0.4%的木瓜蛋白酶解处理的，其中酶解过程为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的60%的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至60℃，保温60min。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例24
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.35份、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例14处理
葡萄籽原粉为在脱脂后还经过占所述葡萄籽原粉质量的0.5%的木瓜蛋白酶解处理的，其中酶解过程为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的45%的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至53℃，保温56min。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过同等实验条件下验证表明，实施例22-24与实施例21具有基本一致的早期干预肝纤维化效果，重复性和一致性良好。
实施例31
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3份、0.03份的纯水、破壁灵芝孢子粉0.3份、葡萄籽粉0.5份、葡萄籽原粉35份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的15微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在40℃下剧烈搅拌（包括而不限于下述方案中的剧烈搅拌无特定限定，指视桨型等而定，相较于常规的低速搅拌，液相体系发生剧烈碰撞能够形成乳液即可，下同）至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例11处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例21。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过与实施例01同等条件下实验验证，本实施例验证结论：
1）灵芝孢子制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量，其中灵芝孢子油+粉组最优，存活率为100%。
2）灵芝孢子制剂各剂量组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油+粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）灵芝孢子制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中灵芝孢子油+粉组抗纤维化作用效果最优，分别降低16.5%、8.0%、11.3%、25.8%，差异均具有显著性（p<0.01或p<0.05）。
4）灵芝孢子制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，灵芝孢子油+粉组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平提高了15.8%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
实施例32
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.4份、0.04份的纯水、破壁灵芝孢子粉1份、葡萄籽粉0.7份、葡萄籽原粉20份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在50℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例12处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例22。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例33
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.5份、0.05份的纯水、破壁灵芝孢子粉3份、葡萄籽粉1份、葡萄籽原粉40份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的20微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在60℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例13处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例23。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例34
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.35份、0.045份的纯水、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在45℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例14处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例24。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过同等实验条件下验证表明，实施例32-34与实施例31具有基本一致的早期干预肝纤维化效果，重复性和一致性良好。
实施例41
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.3份、0.03份的纯水、破壁灵芝孢子粉0.3份、葡萄籽粉0.5份、番茄红素0.1份、葡萄籽原粉35份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的15微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在40℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例11处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例21。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过与实施例01同等条件下实验验证，本实施例验证结论：
1）灵芝孢子制剂改善了实验大鼠的精神状态，大鼠活动量增加进而增加了饮水量、进食量，其中灵芝孢子油+粉组最优，存活率为100%。
2）灵芝孢子制剂各剂量组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油+粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）灵芝孢子制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中灵芝孢子油+粉组抗纤维化作用效果最优，分别降低16.4%、8.1%、11.23%、25.78%，差异均具有显著性（p<0.01或p<0.05）。
4）灵芝孢子制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，灵芝孢子油+粉组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平提高了16.0%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
实施例42
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.4份、0.04份的纯水、破壁灵芝孢子粉1份、葡萄籽粉0.7份、番茄红素0.2份、葡萄籽原粉20份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的5微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在50℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例12处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例22。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例43
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.5份、0.05份的纯水、破壁灵芝孢子粉3份、葡萄籽粉1份、番茄红素0.3份、葡萄籽原粉40份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的20微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在60℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例13处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例23。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
实施例44
本实施例的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油 0.35份、0.045份的纯水、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、番茄红素0.25份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物。纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在45℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液。
其中，葡萄籽原粉的脱脂同实施例14处理。脱脂葡萄籽原粉的酶解处理同实施例24。
组合物的制备方法主要为灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合（可以为低速拌合均匀静置）吸附后，再与其余原料充分混合即可。
经过同等实验条件下验证表明，实施例42-44与实施例41具有基本一致的早期干预肝纤维化效果，重复性和一致性良好。
综上所述，本发明所请求的技术手段通过包括而不限于上述实施方式所展示的可以看到：
1）本发明组合制剂改善了实验大鼠的精神状态，实验组大鼠受到组合制剂有效干预作用下，相对于对照组活动量显著增加进，而增加了饮水量、进食量。并且实验组大鼠生存能力在实验条件下得到显著优化，存活率均为100%。
2）本发明组合制剂实验组大鼠的肝组织结构较模型对照组有不同程度的改善。其中，灵芝孢子油/灵芝孢子粉组的胶原面积占比及面密度显著低于模型对照组（p<0.01）。
3）本发明组合制剂可降低肝纤维化相关指标ECM水平，抑制40% CCl4联合高脂饲料造模大鼠肝纤维化的进程。与模型对照组比较，血浆中HA、LN、Col IV、Hyp水平均有不同程度降低，其中优化的灵芝孢子油/灵芝孢子粉组抗纤维化作用效果最优，体现了高效的肝纤维化早期干预效果。
4）本发明组合制剂可促进MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达，调控MMP-9/TIMP-1通路，与模型对照组比较，实验组大鼠肝组织中的MMP-9表达水平显著提供，整体至少提高了11.0%，且差异具有极显著性（p<0.01）。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (4)
1.一种早期干预肝纤维化的组合物，其原料组成包括，以重量份数计：灵芝孢子油0.35份、0.045份的纯水、破壁灵芝孢子粉2份、葡萄籽粉0.8份、番茄红素0.25份、葡萄籽原粉50份，其中葡萄籽原粉为葡萄籽粉碎经脱脂得到的30微米粒径的干燥颗粒物；其中纯水乳化分散于灵芝孢子油中形成乳化液，乳化过程为将纯水与灵芝孢子油混合后在45℃下剧烈搅拌至形成稳定的乳液；
葡萄籽原粉为脱除80％脂质的葡萄籽干品粉碎后的颗粒物：破碎后的葡萄籽颗粒物加入适量的石油醚中浸泡3d进行脱脂处理，石油醚与葡萄籽的体积质量比为：8ml：1g，而后去除溶剂和干燥即可；在脱脂后还经过占所述葡萄籽原粉质量的0.5％的木瓜蛋白酶解处理的，其中酶解过程为：木瓜蛋白酶与葡萄籽原粉质量的45％的纯净水混合均匀后，再与葡萄籽原粉拌匀，而后压实至无析出水，升温至53℃，保温56min；
制备方法为上述乳化后的灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合低速拌合均匀静置吸附后，再与其余原料充分混合即可，所述组合物为药物组合物。
2.如权利要求1所述的早期干预肝纤维化的组合物的制备方法，包括如下步骤：
准备灵芝孢子油；
准备葡萄籽原粉，将葡萄籽干品粉碎得到的颗粒物与适量强碱溶液混合后，加热脱脂，干燥即可得到具有微孔结构的葡萄籽原粉；
上述乳化后的灵芝孢子油与葡萄籽原粉充分混合吸附后，再与其余原料充分混合即可。
3.制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的早期干预肝纤维化的组合物，所述制剂为药物组合物制剂。
4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述制剂选自胶囊制剂、液剂、粉剂、片剂、颗粒剂、丸剂。
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