CN104306368A - 山奈酚在制备抗hcv感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明提供了山奈酚在制备抗丙型肝炎病毒(HCV)感染药物中的应用。山奈酚，英文名Kaempferol简称KP，是一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果和中药中如银杏、蜂胶、紫椴和国槐等。本发明通过实验证实了山奈酚可在蛋白水平和RNA水平抑制丙型肝炎病毒复制，并呈剂量依赖性；山奈酚可抑制不同基因型HCV复制并且与IFN具有协同作用；山奈酚可以抑制HCV急性和慢性感染，同时明显抑制HCV核心抗原和NS5A抗原诱导的炎症因子RNA表达尤其是抑制环氧化酶2基因表达。

Description

山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，简称HCV)是全球范围内导致慢性病毒性肝炎的重要病原因之一。HCV长期隐匿性感染可能会引发肝纤维化、肝硬化和肝癌等晚期肝病。干扰素和利巴韦林联合用药广泛用于HCV感染的治疗，但这一疗法治疗效果有限，并且具有很多副作用。HCV小分子直接抗病毒药物(DAA)的出现大大提高了治疗效果，并有望最终完全取代干扰素疗法。然而慢性丙型肝炎治疗进入DAA时代并不意味着丙型肝炎问题已经解决，因而还需要探寻不同的治疗策略。
传统中药(Traditional Chinese Medicine，简称TCM)在东南亚地区被广泛用于各种疾病治疗。尤且是在近十年来随着TCM活性成份纯化技术进步，TCM逐渐被西方医学认同。
山奈酚，英文名Kaempferol简称KP，化学式C15H10O6，CAS登录号520-18-3，化学结构式如下所示：
山奈酚是一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜(如茶，花椰菜，甘蓝，羽衣甘蓝，韭菜，菊苣，豆，番茄，草莓和葡萄)和中药中(如银杏，木贼属，椴树属，蜂胶，国槐等)。目前为止已经证实KP具有广泛的生物学活性，如抗氧化、抗炎、抗血管生成和抗微生物活性，包括抗细菌、抗病毒、抗真菌和抗原虫活性。
中国专利CN201110087126.3，申请公布号：CN102218052A，公开了山奈酚作为抗真菌药物增效剂的新用途，山奈酚与氟康唑、酮康唑、咪康唑或两性霉素B等抗真菌药物合用时，不仅能在减少用药量的情况下确保其对真菌的抗菌效果，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，因此可用作抗真菌药物的增效剂。中国专利CN200510023525.8，申请公布号：CN1679602A，公开了山奈酚可用于制备防治抑郁或痴呆药物。
目前尚无有关山奈酚与丙型肝炎病毒相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于研究山奈酚的新的医药用途。
本发明提供了山奈酚在制备抗丙型肝炎病毒(HCV)感染药物中的应用。
本发明通过实验证实，山奈酚(Kaempferol，KP)可在蛋白水平和RNA水平抑制丙型肝炎病毒复制，并呈剂量依赖性。KP可抑制不同基因型HCV复制并且与IFN具有协同作用。KP可以抑制HCV急性和慢性感染，同时明显抑制HCV核心抗原和NS5A抗原诱导的炎症因子RNA表达尤其是抑制环氧化酶2(COX2)基因表达。此外，KP可以抑制HCV抗原诱导COX2激活并且COX2蛋白可以抵制KP对HCV复制的抑制作用。
山奈酚可以作为HCV感染诱导环氧化酶2(Cox2)的抑制剂，继而在Cox2表达介导相关疾病中发挥治疗效果，例如抗肿瘤、抗抑郁等。
本发明所述的山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用，所述的药物为：山奈酚作为唯一活性成份，或包含山奈酚的药物组合物。
优选的，所述的药物为山奈酚与干扰素-а(IFN-а)作为活性成份。
优选的，所述的药物包括治疗有效量的山奈酚。所述药物中山奈酚的含量为0.1-99wt％，较佳地为0.5-90wt％。
所述的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型，例如汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂、透皮吸收剂等剂型。
本发明的有益效果如下：山奈酚作为传统中药，毒副作用小；山奈酚又存在于多种水果、蔬菜和中药中，提纯工艺也相对成熟，来源广泛。本发明为HCV治疗提供了新的手段。
附图说明
图1为山萘酚(KP)剂量依赖性抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制，其中A为KP抑制HCV复制，半数有效浓度(EC50)为1.459μM；B为KP对Huh7.5细胞毒作用(CC50>100μM)。
图2为山萘酚(KP)对丙肝病毒(HCV)生活周期不同阶段作用，其中A为KP对HCV生活周期病毒复制和包装出胞阶段作用；B为KP剂量依赖性抑制HCV复制，且无明显细胞毒性；C为KP对HCV生活周期入胞阶段作用。
图3为山奈酚(KP)在基因水平和蛋白水平对HCV基因的抑制作用，其中A为KP相对DMSO可以明显抑制HCV蛋白表达；B为KP可明显抑制HCVRNA水平；C为从报导基因Gluc表达水平反应KP明显抑制HCV繁殖。
图4为KP剂量时间依赖性抑制持续HCV感染。
图5为山奈酚显著抑制不同基因型HCV RNA复制，其中A为抑制HCV2a，B为抑制HCV1b，C为抑制HCV 1a。
图6为山奈酚与干扰素-а协同抑制HCV，其中A为KP协同IFN-а抑制HCV复制，B为KP协同IFN-а细胞毒实验。
图7为山奈酚(KP)对HCV蛋白诱导细胞环素2(Cox2)作用，其中A为KP剂量依赖性抑制Cox2基因表达；B为Cox2蛋白表达可逆转KP对HCV复制抑制作用。
具体实施方式
现结合附图和实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本实施例所用的山奈酚，应用高压液相色谱法提纯，也可经市售获得。
实施例1：山奈酚剂量依赖性抑制HCV，EC50为1.459μM,CC50为大于100μM：
一、实验方法：
1.实验用细胞株：Huh7.5细胞(人肝癌细胞)。来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2.实验用质粒：Jc1FLAG(p7-nsGluc2A质粒来自美国纽约洛克菲勒大学。
3.实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。NS5A单克隆抗体9E10来自美国洛克菲勒大学。ECM 830电穿孔仪(HarvardApparatus)，移液管(VWR),96孔培养板(VWR)。
4.实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
阳性对照药物：2’-C-methyladenosine(2’CMA)(Carbosynth Berkshire,UK),人CD81 JS-81单克隆抗体(BD Biosciences),Interferon-а(IFN-а)(VWR),和奎宁(PBL)。
5.细胞培养：Huh7.5在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5％CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底90％～95％后，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞备用。
6.HCVcc制备和定量：用10ml冷DPBS洗Huh7.5细胞1次，4℃300g离心5min，调整细胞密度至2.82×107cells/ml。使用ECM 830电穿孔仪在650V,99μs脉冲长度,5次,间隔1.1s的条件下，将nsGauss gLuc HCV RNA电转染Huh7.5细胞，分别在转染后96、120、144和168小时收集细胞培养上清-80℃保存备用。
应用常规有限稀释法定量HCVcc浓度(T Takeuchi，等.Real-time detectionsystem for quantification of hepatitisCvirus genome.Gastroenterology.1999；116:636-642),将Huh7.5细胞以6000细胞/孔接种在96孔板，第二天将HCVcc系列稀释，浓度为10-1to 10-6，并感染Huh7.5细胞，感染72小时后，用NS5A单克隆抗体9E10和PE羊抗鼠二抗标记感染细胞。应用Reed and Muench法(Assis DN,Lim JK:New pharmacotherapy forhepatitis C.Clin Pharmacol Ther 2012,92:294-305.)计算半数组织感染剂量(TCID50)/mL。
7.HCVcc感染实验：Huh-7.5细胞(2.0×104cells/well)接种在96孔板，4-6小时后应用Jc1 Gluc HCVcc(MOI＝0.01)感染Huh-7.5细胞，同时和不同浓度实验药物共孵育(DMSO，1、3、5、10μM),12-14小时后用100μLDMEM培养液洗四次，继续原浓度实验药物同孵育48小时后，应用CellTiterGlo检测上清中Gluc浓度。应用sigmoidal fit function in OriginLab(OriginLab,Northampton,MA)计算EC50和CC50.
8.山萘酚对电转染人Huh7.5细胞细胞毒作用：为了评价山萘酚对电转染Huh7.5细胞的细胞毒作用，按照HCVcc制备和定量所述方法将空白DPBS电转染Huh7.5细胞,转然后细胞接种在96孔板，6小时后加不同剂量山萘酚(0、5、10、20)4060、80和100μM)共孵育48小时后，应用CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。
二、实验结果
通过HCVcc感染实验和细胞毒实验，我们发现山萘酚(KP)剂量依赖性抑制HCVcc复制，并且细胞毒性很低(如图1所示)。EC50为1.459μM,CC50为大于100μM。
实施例2：山奈酚通过抑制HCV复制阶段而发挥抗HCV活性
一、实验方法：
HCV生活周期包括病毒入胞、复制、包装出胞即细胞分泌等阶段，为了探讨山奈酚如何抑制HCV复制,我们分别应用基于荧光素酶检测的HCV复制和感染性病毒产生的抑制实验和HCV假病毒(HCVpp)入胞抑制实验对山萘酚抑制机制进行了研究。
1、实验用细胞株：293T细胞(人肾上皮细胞)和Huh7.5细胞(人肝癌细胞)。来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2、实验用质粒：HIV Gag-Pol(艾滋病病毒膜蛋白编码质粒)、HCV H77/J6(丙型肝炎病毒编码质粒)、VSV(水疱性口炎病毒膜蛋白编码质粒)和Jc1FLAG(p7-nsGluc2A质粒来自美国纽约洛克菲勒大学。pTRIP-Gluc和pcDNA3.1(-)neo来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
3、实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。TransITreagent(Mirus,Madison,WI)。ECM 830电穿孔仪(Harvard Apparatus)，移液管(VWR),96孔和48孔培养板(VWR)。
4、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
阳性对照药物：2’-C-methyladenosine(2’CMA)(Carbosynth Berkshire,UK),人CD81 JS-81单克隆抗体(BD Biosciences)和奎宁(PBL)。
5、细胞培养：Huh7.5或293T细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5％CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底70％～80％后，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞备用。
6、基于荧光素酶检测的HCV复制和感染性病毒产生抑制实验:电转染Jc1FLAG(p7-nsGluc2A)RNA的人Huh7.5细胞以6.0×104/孔接种48孔板，6小时后加实验药物共孵育，其中奎宁(15μM)、2’CMA(2μM)、山萘酚(4.12μM)和DMSO(0.26％)。48小时后收集培养上清-20℃保存，准备检测萤光素酶得出病毒复制水平。同日用100倍稀释的细胞培养上清感染新接种人Huh7.5细胞96孔板(2.0×104/孔)，感染后12-14小时用100μL完全DMEM培养液洗细胞4次，加100μL完全DMEM培养液在37℃，5％CO2孵箱孵育48小时后收集上清进行萤光素酶检测，得出感染性病毒产生水平。
7、山萘酚(KP)对HCV复制阶段剂量依赖性抑制实验和细胞毒实验：电转染Jc1FLAG(p7-nsGluc2A)RNA的人Huh7.5细胞以5.0×104/孔接种96孔板，6小时后加不同浓度山萘酚(DMSO，1、2、3、5、8μM)共孵育；48小时后收集培养上清检测萤光素酶活性。对于细胞毒实验用DPBS取代HCV RNA转染Huh7.5细胞，48小时后去除培养上清，检测细胞活力。
8、HCV假病毒(HCVpp)制备和HCV病毒入胞抑制实验：
HCVpp制备：应用TransIT细胞转染剂将pTRIP-Gluc,HIVgag-pol和HCVH77E1E2或VSV-G RNA或pcDNA3.1按照1：1：4比例转染分别转染1天前传代293T细胞，48小时后收集上清过滤后-80℃保存备用。
HCV入胞阶段抑制实验：接种Huh7.5细胞(2.0×104cells/well)于96孔板，6-8小时后加药物：Js81单克隆抗体(2μg/ml)、山萘酚(4.12μM)和DMSO(0.26％),在37℃5％CO2条件下孵育1小时，然后将HCVpp,Env-pp和VSV-Gpp分别按照1:5,1:5,and1:500比例加入细胞中。12-14小时后，去处理病毒和药物，用100μL/孔完全培养液洗细胞4次，去除未结合的病毒和预留的萤光素酶，重新加100μL/孔完全培养液继续在7℃5％CO2条件下孵育，48小时后收集培养上清检测萤光素酶，应用CellTiter-Glo细胞活力检测试剂检测细胞活力(CTG)。
应用细胞活力值标准化萤光素酶活性％HCVpp入胞＝(样品H77Gluc–样品Env-pp)/(DMSOH77Gluc-DMSOEnv-pp)*100％of VSVGpp入胞＝样品Gluc/DMSOGulc*100
二、实验结果：
通过基于荧光素酶检测的HCV复制和感染性病毒产生抑制实验和HCV病毒入胞抑制实验我们明确山萘酚通过抑制HCV复制过程而抑制HCV病毒复制(图2A)，而对HCV感染入胞阶段(图2C)和病毒包装分泌阶段(图2A)无明显抑制作用。进一步的研究发现，山萘酚对HCV生活周期中病毒复制阶段的抑制作用呈剂量依赖性，同时无明显细胞毒性(图2B).
实施例3：山奈酚可以在基因水平和蛋白水平抑制HCV复制
一、实验方法：
为了明确山萘酚(KP)是否在基因水平和蛋白水平具有相同的HC抑制作用，我们分别应用蛋白免疫印迹法(western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对KP对HCV抑制作用进行了研究。
1、实验用细胞株：Huh7.5细胞(人肝癌细胞)，来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2、实验用质粒：Jc1FLAG(p7-nsGluc2A质粒来自美国纽约洛克菲勒大学。3、实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。Renilla萤光素酶裂解液(Promega)，2ⅹSDS加样缓冲液(Promega)，NS5A单克隆抗体9E10来自美国洛克菲勒大学。山羊抗肌动蛋白抗体(A5441,Sigma)，辣根过氧化物酶标记驴抗小鼠二次抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二次抗体(Jackson Immuno Research)，SDS-PAGE(8％-丙烯酰胺)和PVDF膜(VWR)，ECM 830电穿孔仪(Harvard Apparatus)，ChemiDoc-It(UVP)化学发光成像仪。EZNA Total RNA kit 1(R6834-02,Omega Bio-Tek)，TaqMan定量PCR试剂(qScript One-Step Fast kit；Quanta Biosciences,Gaithersburg,MD)，(移液管(VWR),96孔、24孔和48孔培养板(VWR)。
4、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
阳性对照药物：2’-C-methyladenosine(2’CMA)(Carbosynth Berkshire,UK)
5、细胞培养：Huh7.5细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5％CO2条件下培养，待细胞铺满培养皿底70％～80％后，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞备用。
6、蛋白免疫印迹实验：接种Jc1FLAG(p7-nsGluc2A)RNA电转染人Huh7.5细胞(1.62×105cells/well)于24孔培养板，6小时后加实验药物：2’CMA(2μM)、山萘酚(10μM)和DMSO(0.1％)。72小时后收集培养上清检测萤光素酶活性，应用Renilla萤光素酶检测裂解液裂解细胞，细胞裂解液同2ⅹSDS上样缓冲液混匀，95℃孵育5分钟。8％-丙烯酰胺SDS-凝胶电泳后转至PVDF膜，膜转印后依次应用鼠抗人NS5A抗体(9E10 anti-NS5A 1:1000)，或山羊抗人肌动蛋白抗体(1:1000,A5441,Sigma)以及辣根过氧化物酶标记驴抗小鼠二次抗体或辣根过氧化物酶标记兔抗山羊二次抗体(Jackson ImmunoResearch)共孵育。
7、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)：接种人Huh7.5细胞于24孔板(1.64x105cells/well)，4-6小时后用Glu-HCVcc感染人Huh7.5细胞同时加实验用药2’CMA(2μM)、山萘酚(5μM)和DMSO(0.05％)，72小时后去除培养上清，用EZNA Total RNA kit 1(R6834-02,Omega Bio-Tek)提取细胞总RNA。
HCV RNA,
正向引物:5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’,
反向引物:5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’
和FAM-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-TAMRA；
磷酸甘油酸激酶基因(phosphoglycerate kinase，PGK)为对照基因，
正向引物：5’-TGAAGAGGGAGCCAAGATTGTC-3’；
反向引物:5’-CAGTGACAAAGTCAACAGGCAAGG-3’.
应用TaqMan定量PCR定量cDNA(qScript One-Step Fast kit；Quanta Biosciences,Gaithersburg,MD).
二、实验结果
如图3所示，KP可以在基因水平和蛋白水平抑制HCV复制，而且蛋白表达水平和报导基因萤光素酶表达水平结果相一致。从而提示可以应用报导基因表达水平反应HCV表达水平。
实施例4：KP剂量时间依赖性抑制持续HCV感染
一、实验方法：
为了明确KP是否对HCV慢性感染具有相似的抑制作用，我们参照文献报道(Zhong J,et al.Persistent hepatitis C virus infection in vitro:coevolution ofvirus and host.Journal of virology 2006,80(22):11082-11093.)以持续HCVcc感染Huh7细胞株为模型进行了相关研究
1、实验用细胞株：Huh7细胞(人肝癌细胞)，来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2、实验用质粒：Jc1FLAG(p7-nsGluc2A质粒来自美国纽约洛克菲勒大学。
3、实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。移液管(VWR),96孔培养板(VWR)，培养皿(VWR)。
4、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
阳性对照药物：2’-C-methyladenosine(2’CMA)(Carbosynth Berkshire,UK)
5、HCVcc持续感染Huh7细胞构建：接种4ⅹ106Huh7细胞于150mm培养皿，以HCVcc感染(MOI＝2)，在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5％CO2条件下培养直至细胞铺满培养皿，然后以1：3传代继续同条件培养。14天后持续HCVcc感染细胞株被建立。
6、KP对持续性HCVcc感染细胞病毒抑制实验：接种HCVcc持续感染Huh7细胞于96孔板(4ⅹ104/孔)，6小时后加实验用药到相应孔内(0，10，20μM)，在37℃5％CO2条件下孵育48小时后，用100μL完全培养液洗细胞3次，去除上清中的萤光素酶，在同样浓度药物存在下继续培养24小时后，留取50μL培养上清4℃保存，检测荧光素酶活性。然后1：3传代细胞于新的96孔板，6小时后在同样浓度药物存在下继续培养72小时，剩余的细胞继续培养6小时后检测细胞活力。在实验第9天时重复上述实验步骤。
二、实验结果：
如图4所示，KP对持续性HCVcc感染呈现时间剂量依赖性抑制作用。在药物作用第9天时，培养上清HCV感染水平明显下降，抑制率达到80-90.1％。
实施例5：KP可抑制不同基因型HCV复制
一、实验方法：
为了检测KP对不同HCV基因型抑制作用，我们分别观察了KP对不同基因型HCV复制子的HCV RNA复制水平的作用，包括HCV 1a,HCV1b，HCV2a。
1、实验用细胞株：Huh7.5细胞(人肝癌细胞)，来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2、实验用质粒：H/SG-Neo(L+I)(HCV基因1a复制子)和PYSGR-gluc-JFH(HCV基因型2a编码治疗)来自于美国纽约洛克菲勒大学。pFK I389 Neo/NS3-3'/ET(HCV基因型1b复制子)来源于德国海德堡大学。
3、实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。ECM 830电穿孔仪(Harvard Apparatus)，ChemiDoc-It(UVP)化学发光成像仪。EZNATotal RNA kit 1(R6834-02,Omega Bio-Tek)，TaqMan定量PCR试剂(qScriptOne-Step Fast kit；Quanta Biosciences,Gaithersburg,MD)，移液管(VWR),96孔培养板(VWR)，培养皿(VWR)。
4、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
阳性对照药物：2’-C-methyladenosine(2’CMA)(Carbosynth Berkshire,UK)
5、稳定表达HCV复制子Con1或H77的Huh7.5细胞构建：电转染HCV复制子Con1或H77RNA入Huh7.5细胞，将转染细胞铺于100mm培养皿(～54％)，次日开始G418(1.0mg/ml)筛选，3周后将稳定表达HCV复制子Con1或H77的单克隆细胞扩展。
6、HCV复制子抑制实验：电转染PYSGR-gluc-JFH RNA的Huh7.5细胞以5.0×104cells/孔接种96孔板，HCV复制子Con1或H77表达Huh7.5细胞以8.1×104cells/孔接种24孔板，加入特定浓度实验药物(KP 20μM,2’CMA 2μM,DMSO0.2％),在37℃,5％CO2孵箱内孵育。对HCV JFH复制子，孵育48小时后收集培养上清检测荧光素酶活性，细胞检测细胞活力(CTG).HCV Con1或H77复制子表达Huh7.5细胞在同药物共孵育72小时后应用EZNA总RNA kit 1(R6834-02,Omega Bio-Tek)提取总RNA进行HCV RNA qRT-PCR检测。
7、HCV qRT-PCR检测:具体实验过程同实施例3.
二、实验结果：
如图5所示，KP可明显抑制不同基因型HCV复制。对HCV基因2a抑制率为99.6％，对HCV基因型1b抑制率87.06％，HCV基因型1a抑制率为89.65％。
实施例6：KP与干扰素-а对HCV复制具有协同抑制作用
一、实验方法：
1、实验用细胞株：Huh7.5细胞(人肝癌细胞株)。来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
2、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
3、实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(ThermoScientific HyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLuxGaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)。移液管(VWR),96孔培养板(VWR)，培养皿(VWR)。
4、药物协同作用实验：Gluc HCVcc感染Huh7.5细胞(MOI＝0.01),次日早上完全DMEM培养液洗细胞，去除上清中萤光素酶，以2.0×104cells/well接种96孔板，加入系列稀释KP(5,3,1.5,1.25and 1μM))和IFN-а(10,3,0.6,0.2and0.05U/ml),孵育72小时后收集培养上清检测荧光素酶活性和CTG.
二、实验结果：
如图6所示，KP与IFN-а对HCV复制具有协同抑制作用，且KP同IFN-а协同抑制HCV复制时并没有明显增加IFN-а的细胞毒作用。
实施例7：KP抑制HCV诱导细胞环素酶2(Cox2)表达，且过表达Cox2蛋白可逆转KP对HCV复制的抑制作用
一、实验方法
Cox2同HCV复制相关，抑制COX2蛋白导致HCV复制水平下降，为了明确是否KP可抑制HCV蛋白诱导COX2表达，我们分别对KP对HCV感染诱导COX2启动子激活的作用以及COX2蛋白表达对KP抑制HCV作用的影响进行了观察。
1、实验用细胞株：HCV复制子Con1表达Huh7.5细胞株，Huh7.5细胞株。
2、实验用质粒：pCOX-2-Luc(环氧化酶2启动子质粒)和pCMV-COX-2-Myc(环氧化酶2蛋白表达质粒)来自台湾高雄医科大学。pCDNA3.1，pRL-TK来源于美国德克萨斯州化学工程陈志丽教授研究室。
3、实验试剂、耗材等：DMEM培养液(Invitrigen),DPBS(Thermo ScientificHyClone)，CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒(Promega)，BioLux Gaussia萤光素酶检测试剂盒(New England BioLabs(Ipswich,MA)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)。移液管(VWR),96孔培养板(VWR)，培养皿(VWR)。
4、实验用药：
本发明药物：山萘酚(kaempferol,KP)
阴性对照药物：DMSO(sigma)
5、HCV Core或NS5A蛋白表达Huh7.5cells建立：参照实施例2HCV假病毒(HCVpp)制备方法将pLPns-Core、pLPns-NS5A转染293T细胞制备HCV Core-pp和HCV NS5App。然后，应用HCV Core-pp,HCV NS5A-pp和空白GFP-pp按照2倍、10倍和20倍比例感染Huh7.5细胞，2天后选择有80-90％GFP阳性细胞感染孔进行后续实验。将HCV Core-pp或HCV NS5A-pp感染Huh7.5细胞转到6孔板，6小时后开始加2μg/mL purymycin进行筛选，每2天换液一次，直至100％细胞表达GFP，最后将形成单克隆细胞扩展，保存，准备后续实验。
6、KP对HCV感染诱导COX2启动子作用：接种HCV复制子Con1表达Huh7.5细胞于24孔板(5.4×104/孔)，次日应用T TransIT reagent(Mirus,Madison,WI)将0.5μg pCOX-2-Luc质粒转染，6小时后同不同浓度KP(0、40,80,100μM)。空白Huh7.5细胞转染等量pCOX-2-Luc为基线COX2启动子活性，定义为1。72小时后去除上清，细胞裂解液进行荧光素酶活性检测。
7、Cox2蛋白表达对KP抑制HCV复制影响实验：接种HCV复制子Con1表达Huh7.5细胞于24孔板(5.4×104/孔)，次日应用T TransIT reagent(Mirus,Madison,WI)将不同浓度COX2表达质粒pCMV-COX-2-Myc(0,0.5 and 1μg)或相同浓度对照质粒pCDNA3.1转染细胞，6小时后加40μM KP共孵育72小时后去除上清，细胞裂解液进行荧光素酶活性检测。
二、实验结果：
如图7所示，KP对HCV感染诱导COX2启动子激活具有剂量依赖性抑制作用，而且COX2蛋白过表达可逆转KP对HCV复制的抑制作用，此研究结果提示KP可能通过抑制COX2表达途径发挥HCV抑制作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为山奈酚作为唯一活性成份或包含山奈酚的药物组合物。
3.根据权利要求2所述的山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为山奈酚与IFN-а作为活性成份。
4.根据权利要求2所述的山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物中山奈酚的含量为0.1-99wt％。
5.根据权利要求1至4任一所述的山奈酚在制备抗HCV感染药物中的应用，其特征在于，所述的药物为汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂，或透皮吸收剂。
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