CN115418329A - 一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与应用。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAc07已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25256，保藏机构地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BAc07及其代谢产物对黄瓜叶部病害具有明显生物防治作用，能够有效抑制黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病及由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害，从而达到减少化学保护剂使用、节约大量成本的目的。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与应用。
背景技术
黄瓜为葫芦科一年生农作物，因具有独特的风味和口感受到人们的喜爱，在世界范围内被广泛栽种。黄瓜在我国每年的种植面积达6000万亩以上，约占世界黄瓜栽培面积的60％，栽培面积和产量均居世界首位。黄瓜需求量的增加及栽培面积的不断扩大，也导致了一系列影响黄瓜产量和品质的病害发生。
叶部病害是黄瓜上最严重的病害之一，每年都会造成黄瓜的大幅减产甚至绝收。目前针对黄瓜叶部病害主要采用化学防治的方法，但过量使用化学农药不但容易导致环境污染、危及人类健康，还容易造成病原产生抗药性、农药残留和有害生物再猖獗等“3R”问题。因此，寻求新的高效生物农药替代化学农药成为当前研究的热点。
生物防治是一种借助拮抗微生物或者其次生代谢物质来防治病害的方法，具有对生态环境友好、施用方法便捷、不会产生抗药性等优点，逐渐成为国内外防治作物病害的研究热点。
自然界中存在着许多对植物健康生长有益的功能微生物，其中具有防治植物病害功能的微生物被称为植物生防菌。植物生防菌能够通过对病原的拮抗作用、对作物的诱导作用和对作物生长的促进作用等机制来防治病害的发生。芽孢杆菌属广泛分布于自然界中，并且具有生物多样性和抗逆性，是植物生长环境中重要的微生物种群，这些特性使得其成为理想的生防菌剂候选者，在维护植物健康和生长方面起着重要的作用。
发明内容
针对化学农药施用带来的环境污染、人畜安全等问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂、可湿性粉剂与应用，解淀粉芽孢杆菌BAc07及其代谢产物对黄瓜叶部病害具有明显生物防治作用，能够有效抑制黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病及由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害，从而达到减少化学保护剂使用、节约大量成本的目的，使黄瓜生产效益最大化，对黄瓜的生产栽培具有重大应用价值，为黄瓜的绿色生产打下基础。
第一方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAc07，该菌株已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25256，保藏机构地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供一种包含解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂。
进一步的，所述菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅰ中发酵，得到发酵液Ⅰ；
发酵培养基Ⅰ包括重量百分比的以下原料：玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.2％、CaCl2 0.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、K2HPO4·3H2O 0.3％、KH2PO4 0.15％和FeSO4·7H2O0.005％，余量为水；发酵培养基Ⅰ在pH＝7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；
发酵培养基Ⅰ的培养条件为：28～30℃，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，转速180～200r/min，发酵过程中保持发酵液pH在7.2～7.5范围内，培养36～40h后检测活菌总量，产孢率达到95％，活菌计数浓度不低于1.3×1010cfu/mL，发酵结束；
(2)按照100～120g/L的添加量向发酵液Ⅰ中添加硅藻土，充分混匀，喷雾干燥得到包含解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂。
第三方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂在防治黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病和由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害中的应用。
第四方面，本发明提供一种包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂。
进一步的，所述制剂的制备方法包括如下步骤：
(a)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅱ中发酵，得到发酵液Ⅱ；
发酵培养基Ⅱ包括重量百分比的以下原料：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl1.0％，余量为水；发酵培养基Ⅱ在pH＝7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；
发酵培养基Ⅱ的培养条件为：28～30℃，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，摇床转速160r/min，发酵培养48～60h，发酵结束；
(b)过滤发酵液Ⅱ，收集上清，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，经超低温真空冷冻浓缩干燥，得到包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂。
第五方面，本发明提供一种包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂在防治黄瓜花叶病病害中的应用。
第六方面，本发明提供一种可湿性粉剂，所述可湿性粉剂包括包含解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂和包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂。
进一步的，所述可湿性粉剂还包括草炭土、羧甲基纤维素钠、壳聚糖和木质素硫酸钠，菌剂、草炭土、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、木质素硫酸钠和制剂的质量比为92～94.5：1.5～2.5：1.5～2.0：1.0～1.5：1.0～1.5：0.5。
进一步的，所述可湿性粉剂的制备方法包括如下步骤：
①活化解淀粉芽孢杆菌BAc07，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，29～31℃条件下震荡培养至对数期，获得用于发酵的种子液；
②室温条件下，将种子液分别接种至发酵培养基Ⅰ﹑发酵培养基Ⅱ中发酵，保证各发酵培养体系中解淀粉芽孢杆菌BAc07菌体初始浓度达到1.0×107cfu/mL，得到发酵液Ⅰ和发酵液Ⅱ；
③按照100～120g/L的添加量向发酵液Ⅰ中添加硅藻土，充分混匀，进行喷雾干燥，得到菌剂；
④过滤发酵液Ⅱ，收集上清，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，经超低温真空冷冻浓缩干燥，得到制剂；
⑤取菌剂、草炭土、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、木质素硫酸钠和制剂充分混合、粉碎，即得。
进一步的，所述分湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌BAc07的活菌数不低于1.1×1011cfu/g，室温条件下放置半年后活菌数不低于5.5×1010cfu/g，代谢产物的浓度不低于0.5wt％。
第七方面，本发明提供一种上述可湿性粉剂在防治黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病和由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂、制剂和可湿性粉剂与市场常规化学农药(如甲霜灵和病毒A)相比，对黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病及霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害防治效果良好，为探究该应用方向的微生物源农药的研发提供了新的思路。同时，本发明菌剂、制剂和可湿性粉剂的制备方法简单，田间施用方便。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
具体实施方式中所使用的解淀粉芽孢杆菌BAc07已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25256，保藏机构地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1包含解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂的制备
(1)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌BAc07接种至固体LB培养基进行活化，在29～31℃条件下倒置培养过夜，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，29～31℃条件下震荡培养至对数期，获得浓度达到1.0×108cfu/mL的种子液；
(2)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅰ中发酵，保证发酵培养体系中解淀粉芽孢杆菌BAc07菌体初始浓度达到1.0×107cfu/mL，得到发酵液Ⅰ；
发酵培养基Ⅰ包括重量百分比的以下原料：玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.2％、CaCl2 0.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、K2HPO4·3H2O 0.3％、KH2PO4 0.15％和FeSO4·7H2O 0.005％，余量为水；发酵培养基Ⅰ在pH＝7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；
发酵培养基Ⅰ的培养条件为：28～30℃，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，转速180r/min，发酵过程中保持发酵液pH在7.2～7.5范围内，培养36h后检测活菌总量，产孢率达到95％，活菌计数浓度不低于1.3×1010cfu/mL，发酵结束；
(3)按照100g/L的添加量向发酵液Ⅰ中添加硅藻土，充分混匀，喷雾干燥，得到菌剂。
实施例2包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂的制备
(a)将-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌BAc07接种至固体LB培养基进行活化，在29～31℃条件下倒置培养过夜，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，29～31℃条件下震荡培养至对数期，获得浓度达到1.0×108cfu/mL的种子液；
(b)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅱ中发酵，保证发酵培养体系中解淀粉芽孢杆菌BAc07菌体初始浓度达到1.0×107cfu/mL，得到发酵液Ⅱ；
发酵培养基Ⅱ包括重量百分比的以下原料：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl1.0％，余量为水；发酵培养基Ⅱ在pH＝7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；
发酵培养基Ⅱ的培养条件为：28～30℃，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，摇床转速160r/min，发酵培养48h，发酵结束；
(c)发酵液Ⅱ经Φ＝45μm过滤网处理后，收集上清，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，经超低温真空冷冻浓缩干燥，得到制剂。
实施例3可湿性粉剂的制备
取93.5份实施例1菌剂、2.0份草炭土、2.0份羧甲基纤维素钠、1.0份壳聚糖、1.0份木质素硫酸钠和0.5份实施例2制剂充混合，通过气流粉碎机将混合物粉碎至Φ＝45μm以下，即得。
所得可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌BAc07活菌数不低于1.1×1011cfu/g，室温条件下放置半年后，活菌数不低于5.5×1010cfu/g；可湿性粉剂中代谢产物的浓度不低于0.5wt％。
试验例1解淀粉芽孢杆菌BAc07对霜霉属卵菌、假霜霉属卵菌和灰霉菌的抑制研究
28℃下，在PDA培养基中倒置培养霜霉属卵菌、假霜霉属卵菌(黄瓜霜霉病病原菌)和灰霉菌(黄瓜灰霉病病原菌)3d，待菌丝生长，备用。挑取解淀粉芽孢杆菌BAc07单菌落接种至LB液体培养基，获得培养液，用LB液体培养基调整培养液浓度至2.0×109cfu/mL。设6组处理：清水处理组﹑培养液上清(培养液离心获得的上清)组﹑菌体悬浮液(培养液离心获得的菌体经等体积的LB液体培养基重新悬浮获得)组﹑10倍稀释培养液组﹑50倍稀释培养液组和100倍稀释培养液组。将新鲜黄瓜叶片置于各处理组(每组5mL)，叶片背面朝上，接种Φ＝5mm的病原菌菌块，5d后观察统计结果。
结果如表1所示，在含有解淀粉芽孢杆菌BAc07菌体的样品中，接种霜霉属卵菌、假霜霉属卵菌和灰霉菌的叶片接种点没有扩大，随着处理时间的增长叶片仍保持健康；5d后，具体悬浮组﹑10倍稀释培养液组和50倍稀释培养液组的叶片接种点处形成枯斑，观察不到菌丝；100倍稀释培养液组的叶片接种点处形成枯斑，观察到少许菌丝的存在，有0.3～0.5mm的菌点。
表1解淀粉芽孢杆菌BAc07对霜霉属卵菌、假霜霉属卵菌和灰霉菌的抑制作用
Figure BDA0003798614330000071
试验例2解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物对烟草花叶病毒(TMV)的抑制研究
准确称取实施例2中制得的制剂0.50g，并加入100mL无菌水，超声震荡充分溶解，最终配置成浓度为5000mg/L的母液；取上述母液用无菌水分别稀释为10×、100×和500×稀释液(浓度分别为500mg/L﹑50mg/L和10mg/L)。
采用半叶枯斑法测定代谢产物对烟草花叶病毒的抗性。选择生长旺盛、健康的真叶期三生烟，右半叶接种含有TMV、二氧化硅和不同浓度代谢产物稀释液(TMV和代谢产物稀释液体积比为1∶1)的混合物100μL，左半叶接种含有等浓度TMV、二氧化硅和无菌水组成的混合物对照，完成接种后用清水冲洗干净，每棵烟草处理1片叶子，每处理6株，重复3次，3～5d后观察统计左右半叶的枯斑数目，并计算抑制率。抑制率计算公式如下：
抑制率＝(对照平均枯斑数－处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数×100％。
同时，以病毒A可湿性粉剂作为阳性对照，选择生长旺盛、健康的真叶期三生烟，右半叶接种含有TMV、二氧化硅和600倍稀释的病毒A可湿性粉剂的混合物100μL，左半叶接种含有等浓度TMV、二氧化硅和无菌水组成的混合物对照，完成接种后用清水冲洗干净，每棵烟草处理1片叶子，每处理6株，重复3次，3～5d后观察统计左右半叶的枯斑数目，并计算阳性对照的抑制率。
结果如表2所示，解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物母液、10×稀释液对烟草花叶病毒的抑制率接近100％；100×稀释液对烟草花叶病毒的抑制率达到95％以上；500×稀释液对烟草花叶病毒的抑制率超过85％。这表明解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物对烟草花叶病毒有很好的抑制效果。另外，由表2可知，解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物抑制效果较常见化学药剂相仿或略优，并且安全性高。
表2解淀粉芽孢杆菌BAc07对烟草花叶病毒的抑制作用
Figure BDA0003798614330000081
试验例3可湿性粉剂在黄瓜叶部病害防治中的应用
试验分为解淀粉芽孢杆菌BAc07处理组和对照组，试验按农业部药检所田间试验准则设计，试验地点为济南市涝坡鲁青园艺设施田地，试验地土壤为深褐土，土壤肥力中上，具有灌溉条件，该设施农田常年种植黄瓜，并于2019～2021年生产种植过程中爆发过黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病/黄瓜花叶病及由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害；供试作物为黄瓜“园丰元6号”；试验时为2022年1月，试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行。
黄瓜种植各设置6个处理：实施例3可湿性粉剂的100倍稀释液、200倍稀释液和500倍稀释液(依次为处理组I、II、III)，50％甲霜灵750倍稀释液，病毒A可湿性粉剂600倍稀释液以及清水对照。
各处理每间隔7天喷施一次团棵期黄瓜茎叶部，连续施用3次。每处理0.04亩，各3次重复，共18个小区面积2.16亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取15d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。
黄瓜叶部病害发病现象如下：
霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害主要危害团棵期株苗，植株感染后叶片背面气孔处零散生长白色菌丝。随着病情的发展病叶背面布满菌丝，正面病处褪绿，严重时叶片枯死掉落，并感染新生叶片；黄瓜霜霉病感染叶片后，病叶患病处出现黄褐色病斑，后蔓延至全叶，进而影响叶片的光合作用；黄瓜灰霉病主要危害黄瓜叶片，病叶患病处长有灰色菌丝，后蔓延至整叶，甚至整株，甚至坏死；黄瓜花叶病主要危害叶片，感染病源烟草花叶病毒后，病叶出现褪绿、花叶、皱缩，但植株其余仍保持青绿色，故称花叶病。
其中黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病和由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害的病级分级标准参考E.K.Ligoxigakis.and D.J.Vaiounakis的分级标准，具体如下：
0级：全株未发病；1级：叶片出现零星病斑﹑植株保持青绿以及挺立；2级：叶部病斑局部扩大出现枯斑﹑植株保持挺立；3级：病叶向新叶蔓延﹑植株出现***坏死病斑；4级：植株死亡。
黄瓜花叶病病情严重度分级指标参考中华人民共和国行业标准(NY/T1464-2007)病害分级标准中的分级标准，以整株为单位进行分级，具体如下：
0级：无病株；1级：明脉，轻花叶；3级：心叶及中部叶片花叶；5级：心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩或植株轻度矮化；7级：重花叶，多数叶片畸形、皱缩或植株矮化；9级：重花叶，叶片明显畸形，植株严重矮化，甚至死亡。
发病率、病情指数、相对防效的计算公式如下：
发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％；
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×最高病级)；
相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％。
利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表3所示。相较清水对照组，叶部喷施实施例3可湿性粉剂的黄瓜发病率均明显下降。施用100倍稀释液喷施时，对黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病及由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害的防治效果最佳，施用500倍稀释液喷施时，其相对防效优于化学保护剂甲霜灵的相对防效；施用100倍稀释液喷施时对黄瓜花叶病的防效最佳，相对防效优于化学保护剂病毒A可湿性粉剂，施用500倍稀释液喷施时，其相对防效接近病毒A的相对防效。这说明本发明可湿性粉剂能够明显抑制黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病及由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害等病害发病，为后续的黄瓜旺长期、花果期的生长提供保护，保障结实。
表3可湿性粉剂对黄瓜叶部病害的防治效果
Figure BDA0003798614330000101
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAc07，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌BAc07已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25256，保藏机构地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种包含如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅰ中发酵，得到发酵液Ⅰ；
发酵培养基Ⅰ包括重量百分比的以下原料：玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.2％、CaCl2 0.2％、MgSO4·7H2O 0.1％、K2HPO4·3H2O 0.3％、KH2PO4 0.15％和FeSO4·7H2O0.005％，余量为水；
(2)按照100～120g/L的添加量向发酵液Ⅰ中添加硅藻土，充分混匀，喷雾干燥得到包含解淀粉芽孢杆菌BAc07的菌剂。
4.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌BAc07及其菌剂在防治黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病和由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害中的应用。
5.一种包含如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂。
6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述制剂的制备方法包括如下步骤：
(a)室温条件下，将解淀粉芽孢杆菌BAc07种子液接种至发酵培养基Ⅱ中发酵，得到发酵液Ⅱ；
发酵培养基Ⅱ包括重量百分比的以下原料：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 1.0％，余量为水；
(b)过滤发酵液Ⅱ，收集上清，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，经超低温真空冷冻浓缩干燥，得到包含解淀粉芽孢杆菌BAc07代谢产物的制剂。
7.一种如权利要求5所述的制剂在防治黄瓜花叶病中的应用。
8.一种可湿性粉剂，其特征在于，包含如权利要求3所述的菌剂和如权利要求6所述的制剂。
9.如权利要求8所述的可湿性粉剂，其特征在于，还包括草炭土、羧甲基纤维素钠、壳聚糖和木质素硫酸钠，菌剂、草炭土、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、木质素硫酸钠和制剂的质量比为92～94.5：1.5～2.5：1.5～2.0：1.0～1.5：1.0～1.5：0.5。
10.一种如权利要求8所述的可湿性粉剂在防治黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜花叶病和由霜霉属卵菌引发的黄瓜叶部病害中的应用。
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