CN115386556A - 一株串联表达非洲猪瘟病毒p30、p54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用 - Google Patents

一株串联表达非洲猪瘟病毒p30、p54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用，本研究以PRV JS‑2012‑ΔgI/gE株为基础，利用同源重组的方法，将现今国内流行的非洲猪瘟病毒的主要抗原蛋白(P30、P54蛋白)的基因序列，***到载体PRV JS‑2012‑ΔgI/gE疫苗株中，构建出含非洲猪瘟病毒P30、P54基因序列的重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株rPRV JS‑2012‑ΔgI/gE+P3054。经PCR及间接免疫荧光验证，***的非洲猪瘟病毒P30、P54基因在载体病毒PRV JS‑2012‑ΔgI/gE中均能稳定且高效表达。生物学特性进一步表明：重组病毒rPRV JS‑2012‑ΔgI/gE+P3054与亲本病毒PRV JS‑2012‑ΔgI/gE基本相似。

Description

一株串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基 因工程疫苗及其应用
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体地说，涉及一种重组的伪狂犬病病毒rPRV、以及使用该rPRV病毒制备的非洲猪瘟疫苗，更具体的，本发明涉及串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗PRV JS-2012-△gE/gI+P3054的构建，及其具体的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV) 引起的一种急性、烈性、接触性传染病。该病在我国于2018年8月首次报道发病，随后迅速传播，在短时间内，我国32个省、市、自治区均发生ASF疫情，给我国养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失。ASF疫情使我国生猪存栏量和出栏量下降20％-50％，许多猪场因ASF疫情完全覆没，严重削弱了我国猪肉的有效供给，导致我国生猪和猪肉价格均出现翻番。作为世界头号养猪大国和猪肉消费国，ASF在我国的流行引起全世界的极大关注。控制ASF疫情，是目前我国兽医工作者的头号工作任务，而猪场作为兽医科技工作者的主战场，亟需高效的 ASF防控技术和有效的ASF防控措施。
ASFV是一种有囊膜、线性双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。其病毒粒子结构较为复杂，由内至外分五层组成：含病毒基因组的类核(nucleoid)、内核心壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(capsid)和外囊膜(outerenvelope)。ASFV基因组全长为170-194kbp，由中央保守区和两端可变区组成，编码151-167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。由于病毒基编码的多基因家族(multigenefamilies,MGF)能够获得或丢失ORFs和病毒基因中或基因间存在的短串联重复序列(shorttandem repeats)出现重复数的变异，不同病毒分离株的基因组长度存在差异。目前，ASFV基因组编码蛋白的数量与功能还不完全清楚。
ASFV易感哺乳动物仅限于猪，不同大小的各种猪，包括家猪、野猪和疣猪。除猪外，ASFV还能感染软蜱，且软蜱在ASFV的传播中发挥重要作用。软蜱和疣猪都是ASFV的自然贮存宿主，维持病毒在自然界中长期存在。病毒在软蜱体内能存活数年，并能垂直传播给子代。疣猪对ASFV具有一定抗性，其感染后不产生临床症状，但能产生长时间的病毒血症，是病毒重要的携带者和传染源。疣猪不能水平或垂直传播ASFV，必需由软蜱介导。但在家猪和野猪群中，ASFV则呈现高度接触性传播，通过猪只间的直接接触或接触感染猪的***物及其污染物、感染猪的肉与血液制品及残余物实现病毒的传播。家猪和野猪对ASFV的易感性相似，感染潜伏期通常为4-19天，不同毒力毒株感染呈现出不同的临床症状：强毒株感染引致最急性和急性型病例，死亡率达100％；中等毒力毒株则致亚急性型病例，死亡率为 30-70％。慢性型由弱毒株感染引起，病程可持续5至12个月，不引起猪体内出血，主要表现为皮肤坏死溃疡、关节发炎肿胀、淋巴节增生等症状，生长迟缓甚至消瘦。慢性型患猪在持续感染的过程中，具有传染性，能使接触的易感动物感染。感染潜伏期的猪也具有传染性，在出现临床症状前可能会排毒数小时。康复猪也可能长期带毒，并能传播病毒。ASF对养猪业危害巨大，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。目前，ASF并无有效的疫苗和药物可用于预防和治疗。
疫苗是防控病毒和细菌性传染病的常用技术和高效手段。多种人类传染病和动物疫病，通过疫苗的使用得到有效控制甚至根除。然而，由于ASFV生物学特性复杂，在病毒侵入和诱导免疫保护反应等诸多方面仍未获清晰认知，在近半个世纪的ASF疫苗研究过程中，不同研究小组利用了多种技术方法，但并未研制出安全有效的ASF疫苗。尽管灭活疫苗能诱导产生抗ASFV抗体，但免疫猪并不能抵抗强毒株攻击。即使利用现代佐剂制备ASF灭活疫苗，仍然对同源强毒株的攻毒没有保护作用。
经过长期研究，多种ASFV毒力基因，如K196R、B119L、EP402R、DP148R、DP71L、DP96R和MGF360/505等被鉴定。随着分子生物学的不断发展，病毒基因组的遗传操作愈发容易，通过基因工程手段构建ASFV基因缺失弱毒株也越来越便捷。但是弱毒株仍存在安全上的疑虑，主要表现为三方面：一是副反应问题。一些弱毒株接种后对宿主存在损伤，临床表现为发热、关节炎和慢性损伤；二是弱毒株接种存在散毒风险。一些弱毒株接种后产生低水平病毒血症，并可排出体外，感染其它接触的易感动物；三是毒力返强。ASFV虽然是DNA 病毒，但基因组中存在高变区，易于发生变异。同时弱毒株需要用原代细胞进行培养，不利于产业化的生产，所以弱毒株对非洲猪瘟疫苗而言目前也是不可取的。
DNA疫苗和病毒活载体疫苗表现出较好的安全性，但是其免疫效率还有待提高。其中，亚单位疫苗虽然能产生中和抗体，但同源强毒攻毒后，只能迟缓临床症状的发生，并不能抵抗病毒感染。DNA疫苗缺乏一些良好的病毒抗原。病毒活载体疫苗能诱导特异的抗体免疫和细胞免疫反应但免疫猪后能否发挥抗ASFV作用，有待探讨。
伴随着DNA重组技术、反向遗传操作、基因编辑等技术的蓬勃发展，疫苗的研究方向正逐渐地向基因工程疫苗过渡，其中重组活载体疫苗也越来越引发人们的关注。目前用于研制病毒活载体疫苗研究所涉及到的病毒疫苗的载体主要包括痘病毒、疱疹病毒以及腺病毒等。腺病毒为复制缺陷型病毒，而痘病毒的基因组大，其基因组表达产物较多，二者表达的外源蛋白难以刺激机体产生较强的免疫反应。疱疹病毒的基因组较大，具有多个复制非必需区可以***多个外源基因，疱疹病毒所构建的活载体疫苗可以诱导特异性粘膜免疫。目前，作为兽用活载体疫苗研究所涉及到的疱疹病毒主要包括伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)以及鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)等。猪并非鸭瘟病毒的宿主，重组鸭瘟病毒免疫猪体后对ASFV感染的免疫保护效果还不确定。
由于PRV基因组较为庞大，故PRV具有许多非必需基因和非编码区，在这些区域中***外源基因序列并不影响PRV自身的复制这也使得PRV活载体疫苗是病毒基因工程疫苗研究的热点。同时比对国内申请专利发现：浙江海隆生物科技有限公司构建了,表达非洲猪瘟病毒P72、B602L、CD2V基因的重组伪狂犬病毒(PRV-BAC-P72-B602L-CD2V-ΔTK-ΔgG株)，即缺失PRV病毒的TK基因和gG基因，在TK基因缺失位置***非洲猪瘟病毒的P72和B602L 基因，在gG基因缺失处***非洲猪瘟病毒的CD2V基因。该重组病毒存在缺陷，首先，对于PRV来说缺失TK基因会使得病毒的毒力极著下降，对疫苗而言，病毒毒力和免疫效力成正相关，病毒毒力太弱进入机体后复制受限使得其激发的免疫原性不强，而载体疫苗主要是依靠重组病毒进入机体后进行复制，使得***的外源基因随着病毒的复制得以表达，来产生免疫保护作用，若重组病毒进入体内不复制或复制水平低，其对外源基因的保护效果肯定不好。我们都知道PRV病毒对小鼠致死性非常强，只有将TK基因敲除后才对小鼠才安全，而猪对PRV的耐受力要强的多，对猪安全的病毒对小鼠可能仍具有较强的致死性(Wu Tong, GuoxinLi,Chao Liang,et.al.A live,attenuated pseudorabies virus strain JS-2012deleted for gE/gI protects against both classical and emergingstrains.Antiviral Research 130(2016)110-117.曹艳云，伪狂犬病毒变异株JS-2012和基因缺失株JS-2012-ΔgI/gE感染小鼠的组织分布和致病性试验，扬州大学，2016)，而对小鼠安全的病毒则对猪几乎完全没有致病性，该案例中虽然他们将重组病毒免疫小鼠后能产生特异性抗体，但由于重组病毒对猪而言毒力太弱，猪免疫后能否产生针对外源蛋白的特异性抗体仍未知。其次，该重组病毒的gE基因未缺失，对于PRV来说gE基因不缺失会造成猪场的PRVgE抗体阳性，使得猪场PRV净化无法进行，不适用于我国临床。第三，该重组病毒所用的PRV病毒载体为伪狂犬病病毒株(PRV HL)，该毒株目前仍未见进行疫苗研发，不具备作为活载体疫苗的研发和使用的条件。江西农业大学构建了表达非洲猪瘟病毒CD2V、P72或P30、P54基因的重组伪狂犬病毒(PRV TK-/gI-/gE-- CD2v+/p72+株或PRV TK-/gI-/gE--P54+/P30+株)，即缺失PRV病毒的TK基因和gI/gE基因，在TK基因缺失位置***非洲猪瘟病毒的CD2V或P54基因，在gI/gE基因缺失处***非洲猪瘟病毒的P72或P30基因。上述两种重组病毒同样存在缺陷，首先，和浙江海隆生物科技有限公司对于所构建的重组病毒毒力太弱，不利于外源蛋白在猪体内的表达，能否为免疫猪群提供保护效果可想而知。其次，该重组病毒的部分外源基因是插在gI/gE基因缺失处，而大家都知道PRV的gI/gE基因不稳定，随着病毒的传代容易发生缺失突变(Chao Liang,Wu Tong,Hao Zheng,Fei Liu,JiqiangWu,GuoxinLi,En-min Zhou,Guangzhi Tong,A high-temperature passaging attenuatedPseudorabies vaccine protects piglets completely against emerging PRVvariant.Research in Veterinary Science 112(2017)109–115.)，而该案例中研究者将外源基因***在这个位置，显然不是正确的选择(童光志、郑浩、童武、李国新、周艳君、于海、单同领、高飞、姜一峰、虞凌雪，表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用，2022年02月08日，中国，ZL201810627238.5)。第三，同样该重组病毒所用的PRV病毒载体毒株也未见有开发疫苗信息。
而本专利中我们选取的PRV病毒活载体为2016年童武等人利用同源重组的技术，以变异毒株JS-2012为骨架，成功构建了伪狂犬双基因缺失病毒JS-2012-ΔgE/gI(童光志、童武、郑浩、刘飞、梁超、周艳君、单同领、于海、姜一峰、高飞，伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用.2018年09月07日，中国，ZL201410002656.7。Wu Tong,Guoxin Li,ChaoLiang,Fei Liu,Qing Tian,Yanyun Cao,Lin Li,Xuchen Zheng,Hao Zheng,GuangzhiTong.A live,attenuated pseudorabies virus strain JS-2012deleted for gE/gIprotects against both classical and emerging strains.Antiviral Research 130(2016)110-117.)，研究表明该双基因缺失毒株对仔猪具有良好的安全性和有效性，目前该疫苗正等待新兽药证书核发中(临床试验批准号：2015051、2017069、20190012)。且前期我们也以猪伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒疫苗株(JS-2012-ΔgE/gI株)为载体表达猪瘟病毒E2蛋白的重组病毒rPRV JS-2012-△gI/gE+E2。该重组病毒接种猪，不引起任何副反应，也不造成组织损伤。单次接种，免疫猪即能完全抵抗CSFV强毒(shimen)的攻毒。甚至对于存在PRV母源抗体的仔猪，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫也能取得良好的免疫保护效果，完全保护仔猪抵抗强毒攻击(童光志、郑浩、童武、李国新、周艳君、于海、单同领、高飞、姜一峰、虞凌雪，表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用， 2022年02月08日，中国，ZL201810627238.5。Wu Tong,Hao Zheng,Guo-xin Li,Fei Liu,Qing Tian,Yanyun Cao,Lin Li,Xuchen Zheng,Hao Zheng,Guangzhi Tong.Recombinantpseudorabies virus expressing E2 of classical swine fever virus(CSFV)protectsagainst both virulent pseudorabies virus and CSFV.Antiviral Research 173(2020)104652)。前期的研究发现，虽然rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后能起到很好的免疫保护效果，但是rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后，CSFV的E2抗体水平却不是很理想，在本次研究中，我们选取非洲猪瘟病毒外源基因时，我们对其序列做了一定的密码子优化，从动物试验结果看，重组病毒进行免疫后，免疫仔猪均产生针对P30、P54的特异性抗体明显升高，从诱导的抗体水平上看 JS-2012-△gI/gE+P3054免疫后的P30、P54抗体水平要明显优于rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫后，E2抗体水平。
发明内容
为了构建重组减毒毒株以便制备用于治疗和预防非洲猪瘟的活载体疫苗，我们对伪狂犬病病毒 (PRV)作为非洲猪瘟病毒的活载体进行了深入研究。在我们前期研究中，构建了猪伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)的基因缺失弱毒疫苗株为载体表达猪瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的重组病毒rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2。该重组病毒接种猪，不引起任何副反应，也不造成组织损伤。单次接种，免疫猪即能完全抵抗CSFV强毒(shimen)的攻毒。甚至对于存在PRV母源抗体的仔猪，rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2免疫也能取得良好的免疫保护效果，完全保护仔猪抵抗强毒攻击。这远优于以新城疫病毒、腺病毒和痘病毒作载体表达E2蛋白的重组病毒所产生的抗CSFV的免疫效果。这些结果表明，PRV基因缺失弱毒疫苗株能在猪体内有效表达并呈递外源蛋白，诱导强烈的免疫反应，是一种高效的猪用疫苗活病毒载体。前期的研究发现，虽然rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后能起到很好的免疫保护效果，但是rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后，CSFV的 E2抗体水平却不是很理想，在本次研究中，我们选取非洲猪瘟病毒外源基因时，我们对其序列做了一定的密码子优化，从动物试验结果看，重组病毒进行免疫后，免疫仔猪产生针对P30、P54的特异性抗体明显升高，从诱导的抗体水平上看PRV JS-2012-△gE/gI+P3054免疫后的P30、P54抗体水平要明显优于rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫后，E2抗体水平。
在此基础上，本发明提供一株串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒基因工程疫苗中表达外源的非洲猪瘟病毒P30、P54基因，缺失伪狂犬病病毒中的gI和gE基因；
进一步的，本发明所述的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗为伪狂犬病毒PRV JS-2012-△gE/gI +P3054；所述重组伪狂犬病毒基因工程疫苗(伪狂犬病毒PRV JS-2012-△gE/gI+P3054)，于2022年4 月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，其保藏号为CCTCC No:V202230。
进一步的，在本发明的另一方面，还提供了一种重组伪狂犬病毒基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(5)构建重组载体，设计引物扩增同源重组的左、右重组臂，酶切CMV启动子-EGFP基因片段、 SV40 polyA信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子-EGFP基因-SV40 polyA信号序列-右重组臂依序组装于获得了重组转移载体。
(6)提取伪狂犬病毒JS-2012-ΔgI/gE株总DNA，将该总DNA与步骤(1)的重组载体共转染细胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；
(7)构建携带P30、P54的重组载体，所述重组载体为利用P3054蛋白替换了步骤(1)重组载体中的 EGFP基因；
(8)提取步骤(2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤(3)的携带P3054的重组载体共转染细胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为重组伪狂犬病毒基因工程疫苗PRV JS-2012-△gE/gI+P3054。
在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗PRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054株。
所述疫苗组合物适于滴鼻、注射接种。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组伪狂犬病毒基因工程疫苗PRV JS-2012-ΔgE/gI +P3054株在制备预防或治疗伪狂犬病及非洲猪瘟的疫苗中的应用。
本发明的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗JS-2012-ΔgE/gI+P3054株，接种15日龄仔猪，不出现临床症状，同时免疫猪均能产生针对非洲猪瘟病毒P30、P54蛋白的特异性抗体，该重组病毒安全可靠，有望能作为有效防治伪狂犬病及非洲猪瘟的疫苗候选株。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒***P30、P54基因的PCR鉴定结果图，其中，“M”指 DNA Marker DL2000，“1”rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒，“2”亲本病毒JS-2012-ΔgI/gE，“3”阳性对照。
图2rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒***位置的PCR鉴定结果图，其中，“M”指DNA Marker DL5000，“1”rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒，“2”亲本毒JS-2012-ΔgI/gE株，“3”指阳性对照。
图3rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒和亲本毒的一步生长曲线。
图4rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒和亲本毒的蚀斑形态观察。
图5rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒不同代次传代病***P30、P54基因的PCR鉴定结果图，其中，“M”指DNA Marker DL2000，“1-20”rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒第1-20代传代病毒，“21”阳性对照，“22”指阴性对照。
图6rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒不同代次传代病***位置的PCR鉴定结果图，其中，“M”指DNA Marker DL5000，“1-20”rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒第1-20代传代病毒，“21”亲本毒 PRV JS-2012-ΔgE/gI株(阳性对照)，“22”指阴性对照，“M”指DNAMarker DL2000。图7rPRV JS-2012- ΔgE/gI+P3054不同代次病毒用P30多抗做IFA的实验结果
图8rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054不同代次病毒用P54单抗做IFA的实验结果
图9rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054不同代次病毒P30、P54基因的测序结果
图10rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒接种哺乳仔猪后的体温情况
图11rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒接种哺乳仔猪后的眼观剖解病变
图12rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒免疫哺乳仔猪后P30蛋白抗体的动态变化
图13rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054病毒免疫哺乳仔猪后P54蛋白抗体的动态变化
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社， 2004)中所述的方法进行。
病毒株、细胞及载体
PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒，BHK-21细胞，Vero细胞均由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。质粒pBIE-GFP由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室先前构建。质粒与菌株：pEGFP-N1、pEGFP-C3和pBluescript SK(+)购自上海基音生物技术有限公司。
MEM和DMEN,Invitrogen公司产品；ScaI、SmaI、SacI、NheI、AseI、XbaI、EcorV、XhoI、AflII、和T4 DNA连接酶,NEB公司产品；Fugene HD转染试剂,promega公司产品；DNA片段小量快速回收试剂盒，Omega公司；2×GC BufferⅡ，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq， DL-15000,DL-2000DNA Marker购自TakaRa；其它化学试剂均是进口或国产分析纯；大肠杆菌DH5α感受态；购自购自北京天根。
实施例1重组伪狂犬病毒基因工程疫苗JS-2012-ΔgE/gI+P3054株的构建
引物设计
根据PRV JS-2012株的全基因组序列，用Oligo 6.0软件设计了多条引物(见表1)，JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR与JS+EGFP-RF/JS+EGFP-RR，用于来扩增同源重组左臂与右臂，分别在左重组臂的前后两端加SacⅠ和AseⅠ酶切位点，在右重组臂的前端加了EcoRⅤ和AflⅡ酶切位点，后端加了XhoⅠ酶切位点。P30鉴定up/P30鉴定down、P54鉴定up/P54鉴定 down和JS gG鉴定up/JS gG鉴定down分别用于扩增外源基因大小和***位置的大小。
表1引物序列
Figure BDA0003628400750000081
含EGFP绿色荧光蛋白的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的构建
用引物JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR与JS+EGFP-RF/JS+EGFP-RR，通过PCR的方法扩增出位于PRV JS-2012基因组中119652至121157位碱基和121168至122680位碱基的两条片段，用作同源重组的左、右重组臂。同时，通过内切酶酶切，从pEGFP-C3质粒中切出CMV启动子-EGFP基因片段，从 pEGFP-N1质粒中切出SV40 polyA信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子-EGFP基因-SV40 polyA信号序列-右重组臂依序组装于pBluescript SK(+)载体中，获得了重组转移载体pBG-GFP。
以PRV JS-2012-ΔgI/gE感染BHK-21细胞，待70％-80％的细胞病变，收集病变细胞，以酚-氯仿法从感染细胞中提取PRV JS-2012-ΔgI/gE的总DNA。将PRV JS-2012-ΔgI/gE总 DNA与pBG-GFP共转染至BHK-21细胞，将收的重组病毒做空斑纯化，经过4轮空斑纯化后，所获得的病毒接种vero细胞，产生的空斑均能表达EGFP。提示含EGFP绿色荧光蛋白的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒构建成功，并将该病毒命名为rPRV JS-2012-ΔgI/gE+EGFP。
含EGFP绿色荧光蛋白PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的EGFP标记基因的替换
用NheI、XbaI双酶切切掉上述重组载体pBG-GFP质粒的EGFP基因，并回收剩下的大片段，再将P3054基因与回收的大片段连接成新的重组质粒，并将其命名为pBG-P3054。
参照上述方法提取含EGFP绿色荧光蛋白的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的总DNA。将提取的总DNA与pBG-P3054共转染至BHK-21细胞中，拯救不含EGFP绿色荧光标记且含P3054基因的 PRV JS-2012-ΔgI/gE重组病毒。通过荧光显微镜观察该重组病毒初步构建成功。
提取串联表达P3054基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的DNA,用P30鉴定up/P54鉴定down 引物进行PCR鉴定。PCR反应体系为20μL：10×LA-Taq BufferⅡ2ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；P30鉴定up 0.5ul(10pmol/ul)；P54鉴定down 0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH2 O 12.5ul；病毒的DNA 2ul。反应条件均为:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；最后于72℃延伸10min。PCR产物以1％的琼脂糖电泳，凝胶成像仪中观察。PCR结果显示，P30鉴定up/P54鉴定down引物扩增出的片段大小外源基因序列大小相符(图1)。
用JS gG鉴定up/JS gG鉴定down引物进行PCR鉴定。PCR反应体系为20μL：2×GCBuffer II10ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；JS gG鉴定up 0.5ul(10pmol/ul)；JS gG鉴定down 0.5ul(10pmol/ul)； LA-Taq 0.5ul；ddH2 O 4.5ul；病毒的DNA 2ul。反应条件均为:94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火 30s，72℃延伸4min，循环35次；最后于72℃延伸10min。PCR产物以1％的琼脂糖电泳，凝胶成像仪中观察。PCR结果显示，JS gG鉴定up/JSgG鉴定down引物扩增虽呈阳性，且片段大小大于亲本毒 PRV JS-2012-ΔgI/gE与预期结果相符(图2)。上述结果表明，串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒构建成功，并将该病毒命名为rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054。
实施例2串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的鉴定及病毒滴度测定
将该串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒接种Vero细胞，待80％细胞出现CPE 时，收获病毒。参照文献(殷震等，动物病毒学，科学出版社，1997),用96孔组织培养板方法测定该病毒的滴度。将该病毒用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀释后，将稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的Vero单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(以含2％FBS的DMEM接种),置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID50。结果显示，rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054毒在Vero细胞上的滴度为108.5TCID50/ml。
实施例3串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的生物学特性分析以串联表达P30、 P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒和其亲本毒都以1MOI的毒量接种Vero细胞，分别在接毒后不同的时间点(4、8、12、16、20、24、28、32、36h)收取细胞上清液，分别进行病毒的TCID50测定，根据测定结果绘制成曲线。结果显示rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054毒和亲本毒JS-2012-ΔgI/gE的生长趋势基本一致(见图3)。
将串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒和亲本毒都以10，1，0.1TCID50/mL病毒分别感染6孔板中的每一孔细胞，于37℃，5％CO2吸附2h，分别加入等体积的琼脂糖和2*MEM，充分混合至温度适合时每孔加入混合液2mL；4℃放置板子致覆盖层完全凝固，然后将之倒扣，放置37℃， 5％CO2培养4d；经甲醛固定，结晶紫染色后在合适的病毒感染量时即可见典型的空斑形成。rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054毒在Vero细胞上所形成的蚀斑形态与其亲本毒JS-2012-ΔgI/gE无明显差异(见图4)。
串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的遗传稳定性验证
串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒在Vero细胞上盲传20代，并分别提取每代病毒的基因组，进行外源基因扩增和***鉴定。取F1、F5、F10、F15、F20代病毒接种Vero细胞提取每代病毒的基因组，用P30鉴定up/P54鉴定down和JS gG鉴定up/JS gG鉴定down引物分别进行外源基因扩增和***鉴定。结果显示：各个代次病毒均扩增出了外源基因(图5)，且***位置大小均与预期结果相符(图6)。IFA结果显示：F1、F5、F10、F15、F20代病毒中的外源基因P30、P54均高效表达(图 7，图8)。测序结果显示：F1、F5、F10、F15、F20代病毒中的P30、P54基因均无突变(图9)。
串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒的安全性及有效性分析
为了测定上述rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054对仔猪的安全性及有效性,将串联表达P30、P54基因的PRV JS-2012-ΔgI/gE病毒以105.0TCID50/头，分别免疫15日龄的仔猪5头，同时设5头同日龄的仔猪为空白对照。免疫后10天内每天进行体温测定，并每天观察试验猪的临床症状，35天后剖杀所有试验猪，观察各组织的病理变化。同时分别在免疫后的7、14、21、28、35天采血进行非洲猪瘟病毒P30、 P54蛋白抗体检测。实验结果表明：重组病毒rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054接种仔猪后未出现任何不良的临床反应(见表2)，仔猪的体温均与空白对照组相似，未出现发热情况(图10)，各脏器的眼观病理变化与空白对照组相似，未出现明显眼观病理变化(图11)，由此可见重组病毒rPRV JS-2012-ΔgE/gI +P3054对哺乳仔猪非常安全。同时抗体检测结果发现：重组病毒rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054在接种仔猪14天后可产生针对非洲猪瘟病毒P30、P54蛋白的特异性抗体(图12，图13)，有望对非洲猪瘟病毒提供免疫保护。
表2rPRV JS-2012-ΔgE/gI+P3054接种仔猪后不同时间的临床记录
Figure BDA0003628400750000111
a为体温大于或等于40.5℃的天数。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
〈110〉 中国农业科学院上海兽医研究所
〈120〉一株串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗及其应用
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉JS+EGFP-LF
CGAGCTCGCGACCGACGCCCAGCCCGTGAACC
〈210〉 2
〈211〉 37
〈212〉 DNA
〈213〉JS+EGFP-LR
CATTAATAACTAGGACCGCTGGGCGTGGATCGCACCC
〈210〉 3
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉JS+EGFP-RF
CAGCTTAAGGGTCGGCGCCCCAGGTTCCCATAC
〈210〉 4
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉JS+EGFP-RR
CCGCTCGAGCAGCTCCACGCGCCCGCTGTAGTT
〈210〉 5
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉P30鉴定 up
ATGGATTTTATTTTAAATATATC
〈210〉 6
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉P54鉴定 down
TTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTT
〈210〉 7
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉JS gG鉴定up
AGGAGGTGACCGAGGAGGAGGC
〈210〉 8
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉JS gG鉴定down
CGCTGGCAGGTGAGTGTATGGG

Claims (6)

1.一株串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因重组伪狂犬病毒基因工程疫苗，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒基因工程疫苗中串联表达外源的非洲猪瘟病毒P30、P54基因，缺失伪狂犬病病毒中的gI和gE基因。
2.如权利要求1所述的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗，所述重组伪狂犬病毒基因工程疫苗为JS-2012-ΔgI/gE+P3054株。
3.如权利要求1所述的串联表达非洲猪瘟病毒P30、P54基因的重组伪狂犬病毒株，所述病毒株(JS-2012-ΔgI/gE+P3054株)，于2022年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，其保藏号为CCTCC No:V202230。
4.一种重组伪狂犬病毒基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建重组载体，设计引物扩增同源重组的左、右重组臂，酶切CMV启动子-EGFP基因片段、SV40 polyA信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子-EGFP基因-SV40 polyA信号序列-右重组臂依序组装于获得了重组转移载体；
(2)提取伪狂犬病毒JS-2012-ΔgI/gE株总DNA，将该总DNA与步骤(1)的重组载体共转染细胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；
(3)构建携带P30、P54的重组载体，所述重组载体为利用融合的P3054蛋白替换了步骤(1)重组载体中的EGFP基因；
(4)提取步骤(2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤(3)的携带P30、P54的重组载体共转染细胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为重组伪狂犬病毒基因工程疫苗JS-2012-ΔgI/gE+P3054株。
5.一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗JS-2012-ΔgI/gE+P3054株。
6.一种如权利要求1所述的重组伪狂犬病毒基因工程疫苗JS-2012-ΔgI/gE+P3054株在制备预防或治疗伪狂犬病及猪瘟的疫苗中的应用。
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