CN115385935B - 一种有机染料化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发光化合物技术领域，具体涉及一种有机染料化合物及其制备方法和应用。该有机染料化合物荧光发射峰处于在近红外二区(1000～1700nm)之间，波长长、散射低、在生物组织中具有穿透深度大的优势，可以实现在无创条件下生物体内深处的生理过程进行成像；并且相比于多光子成像，使用宽场成像，成像速度快，可以实现对生物体内一些快速生理过程的实时记录，操作、观测方便。

Description

一种有机染料化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于发光化合物技术领域。更具体地，涉及一种有机染料化合物及其制备方法和应用。
背景技术
理解大脑高速信息处理过程中单个神经元及其连接的功能是脑科学研究的一个终极目标。其需要在细胞以及亚细胞尺度上，以毫秒级时间分辨率对神经元动作电位进行快速记录。由于能够实时高通量地记录神经元活动，荧光成像在众多活体成像模式中脱颖而出，成为神经科学研究的重要技术手段。近年来，本领域技术人员研究出了大量对于神经信号(如膜电位、Ca2+、谷氨酸盐等)响应的荧光探针。如中国专利申请公开了一种基于聚集诱导效应的钙离子荧光探针，该探针可适用pH范围较宽、水溶性好、灵敏度较高，荧光发射主要集中在450～600nm，可应用于环境和生物样品中Ca2+的选择性检测。但是，该荧光探针或现有技术的其他荧光探针发射荧光主要集中在可见区(400～700nm)，生物组织的穿透性差，造成现阶段神经信号的荧光成像必须依赖开窗或介入手段才能观测，并且局限于浅表，无法满足脑科学研究对人类自身大脑更深层次的探索需求。
因此，迫切需要提供一种能满足人类对更深层次脑部科学探索需求，穿透性好，操作、观测方便的荧光探针。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有荧光探针穿透性差、观测麻烦的缺陷和不足，提供一种能满足人类对更深层次脑部科学探索需求，穿透性好，操作、观测方便的荧光探针。
本发明的目的是提供一种有机染料化合物。
本发明另一目的是提供所述有机染料化合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述有机染料化合物的应用。
本发明另一目的是提供一种有机染料。
本发明另一目的是提供所述有机染料、荧光探针的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种有机染料化合物，所述有机染料化合物具有式I结构：
Figure BDA0003848037830000021
其中，R1选自式A或式B，R2选自式A或式C：
Figure BDA0003848037830000022
其中，R5为H、Li、Na、K或乙酰氧甲基，R6为式D结构，n＝0～12；
R3、R4各自独立地选自H或式D，n＝0～12；或R3、R4连接成环与噻吩结合为乙烯二氧基噻吩。
优选地，R3、R4同时为H，或R3为式D，n＝0～12，R4为H；或R3、R4连接成环与噻吩结合为乙烯二氧基噻吩。
更优选地，所述有机染料化合物具有以下任一结构式：
Figure BDA0003848037830000023
Figure BDA0003848037830000031
其中，R5为H、Li、Na、K或乙酰氧甲基，n＝0、3、12。
另外的，本发明还提供了所述有机染料化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将式II化合物与式III化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物IV；
Figure BDA0003848037830000032
S2、将式IV化合物与式V化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物VI；
Figure BDA0003848037830000033
S3、将式II化合物与式V化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物VII；
Figure BDA0003848037830000041
S4、将式IV化合物与式VIII化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应，脱保护得到中间产物IX；
Figure BDA0003848037830000042
S5、将式IX化合物与式X化合物在脱水剂存在的条件下反应，再在还原剂存在条件下还原，得到中间产物XI；
Figure BDA0003848037830000043
S6、将式VI、VII或XI化合物在碱金属氢氧化物存在的条件下水解，再与乙酸溴甲酯在有机碱性试剂存在的条件下反应，得所述有机染料化合物；
其中，R1～R6的定义与上述任一定义一致，R7为甲基、乙基或叔丁基，R8为叔丁氧羰基、苄氧羰基或9-芴基甲氧羰基。
进一步地，步骤S5中，所述还原剂为NaBH4。
更进一步地，步骤S1～S4中，所述钯催化剂为Pd(PPh3)4、Pd(PPh3)2Cl2、Pd(OAc)2或Pd(dppf)2Cl2；所述碱金属碳酸盐为Na2CO3、K2CO3或Cs2CO3；各步骤反应均为加热至回流进行反应，反应时间12～24h。
进一步地，步骤S5中，所述脱水剂为Na2SO4或分子筛，脱水反应在室温下进行，反应时间在0.5～6h；所述还原剂为NaBH4，还原反应在室温下进行，反应时间在0.5～2h。
更进一步地，步骤S6中，所述碱金属氢氧化物为LiOH、NaOH或KOH，反应需在0～5℃下进行0.5～6h，之后恢复至室温反应12～24h。
进一步地，步骤S6中，所述有机碱性试剂为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，反应在室温下进行，反应时间12～24h。
在本发明的一些实施方式中，所述式III、VIII化合物是可以商业获取的，式II、V、X化合物是本领域技术人员根据已有技术可以制备的。在一个示例性的方法中，式II、V、X化合物可以参照文献制备，例如，式II化合物的合成方法参见：Eva Bundgaard,etal.Macromolecules 2006,39,2823；式V化合物的合成方法参见：Pinar Batat,etal.Photochem.Photobiol.Sci.2012,11,1666；式X化合物的合成方法参见：SherylRoberts,et al.J.Am.Chem.Soc.2018,140,2718.
另外的，本发明还要求保护所述有机染料化合物在制备荧光探针、有机染料中的应用。
对所得有机染料化合物检测，发现其吸收峰在700～900nm之间，荧光发射峰在1050～1070nm之间，处于在近红外二区(1000～1700nm)之间，波长长、散射低、在生物组织中具有穿透深度大的优势，可以实现在无创条件下生物体内深处的生理过程进行成像。
因此，本发明还要求保护一种荧光探针，其含有所述有机染料化合物。
本发明还要求保护一种有机染料，其含有所述有机染料化合物。
并且，相比于多光子成像，所得有机染料化合物荧光发射处于在近红外二区(1000～1700nm)之间，使用宽场成像，成像速度快，可以实现对生物体内一些快速生理过程的实时记录，如记录神经元细胞内Ca2+浓度的变化(钙流)。
因此，本发明还要求保护所述荧光探针或所述有机染料在Ca2+检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的有机染料化合物荧光发射峰处于在近红外二区(1000～1700nm)之间，波长长、散射低、在生物组织中具有穿透深度大的优势，可以实现在无创条件下生物体内深处的生理过程进行成像；并且相比于多光子成像，使用宽场成像，成像速度快，可以实现对生物体内一些快速生理过程的实时记录，操作、观测方便。
附图说明
图1为本发明实施例1化合物1的吸收光谱和荧光发射光谱。
图2为本发明实施例1化合物1分子探针对Ca2+的响应能力荧光强度图。
图3为本发明实施例1化合物2的细胞毒性和光毒性检测结果图。
图4为本发明实施例1化合物2近红外探针对神经元细胞内Ca2+浓度变化记录的结果统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明以式I化合物作为母核结构，制备得到化合物1～13，具体结构参考表1。
Figure BDA0003848037830000061
表1化合物1～13结构
Figure BDA0003848037830000062
Figure BDA0003848037830000071
其中，A～D所表示结构为：
Figure BDA0003848037830000072
对应地，化合物命名为(参照中国化学会有机化合物命名审定委员会发布的《有机化合物命名原则》2017年版命名)：
化合物1：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物2：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸乙酰氧甲酯.
化合物3：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸.
化合物4：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸锂。
化合物5：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钠。
化合物6：1-(2-氨基-5-(4-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氨基甲基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物7：4,8-双(3,4-乙烯二氧基-5-(3-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-氨基苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑-N,N,N’,N’,N”,N”,N”’,N”’-八乙酸钾。
化合物8：1-(2-氨基-5-(5-(8-(5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物9：1-(2-氨基-5-(3-甲氧基三乙二醇基-5-(8-(3-甲氧基三乙二醇基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物10：1-(2-氨基-5-(3-甲氧基-5-(8-(3-甲氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物11：1-(2-氨基-5-(3-甲氧基十二甘醇基-5-(8-(3-甲氧基十二甘醇基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸。
化合物12：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双甲氧基苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
化合物13：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基十二甘醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾。
实施例1化合物1、3、4、5、8～13的合成
S1：4,8-双(3,4-乙烯二氧基-5-溴噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)(0.57g,0.9mmol,3eq)、2-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(0.16g,0.3mmol,1eq)、Pd(PPh3)4(35mg,30μmol,0.1eq)和K2CO3(0.41g,3mmol,10eq)加入反应瓶中，N2抽排三次，将脱气后的混合溶剂(甲苯:乙醇:水＝8:1:1v/v/v，60mL)通过注射器加入反应瓶，反应加热至回流过夜；硅胶柱色谱分离(正己烷/CH2Cl2)，得到0.16g暗绿色粘稠液体产物：2-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)-3,4-乙烯二氧基-5-溴噻吩，产率55％。
Figure BDA0003848037830000091
1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.20(t,1H,J＝8.3Hz,Ph-H),6.65(dd,2H,J1＝8.4Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),4.55-4.52(m,4H,-OCH2-),4.42-4.39(m,4H,-OCH2-),4.09(t,4H,J＝6.2Hz,-OCH2-),3.69(t,4H,J＝5.0Hz,-OCH2-),3.56-3.51(m,16H,-OCH2-),3.42(s,6H,-OCH3).13C-NMR(CDCl3,δppm):157.31(CAr),156.12(CAr),152.61(CAr),149.03(CAr),146.14(CAr),141.99(CAr),138.42(CAr),128.71(CAr),125.67(CAr),124.56(CAr),116.87(CAr),113.21(CAr),112.84(CAr),108.88(CAr),105.49(CAr),85.01(Cthiophene-Br),72.04(-OCH2-),70.84(-OCH2-),70.66(-OCH2-),70.59(-OCH2-),70.27(-OCH2-),65.17(-OCH2-),64.73(-OCH2-),64.63(-OCH2-),64.16(-OCH2-),59.15(-OCH3).HRMS(ESI)calcd for:C38H42BrN4O12S4 +([M+H]+):953.0857；found:953.0885.
S2：2-(3-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-氨基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯(126mg,0.19mmol,1.2eq)、2-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)-3,4-乙烯二氧基-5-溴噻吩(153mg,0.16mmol,1eq)和Pd(PPh3)4(18mg,16μmol,0.1eq)溶于新蒸四氢呋喃(THF,15mL)，室温搅拌30min；另配制K2CO3水溶液(0.5mL,1M)，N2鼓泡脱气20min，加入反应体系，65℃加热反应过夜；冷却至室温，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离(乙酸乙酯EtOAc/CH2Cl2＝1:19)，得到暗绿色固体142mg：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯，产率63％。
Figure BDA0003848037830000101
1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.70(dd,1H,J1＝7.9Hz,J2＝1.2Hz,Ph-H),7.60(d,1H,J＝1.2Hz,Ph-H),7.20(t,1H,J＝8.3Hz,Ph-H),6.92(ddd,1H,J1＝9.4Hz,J2＝5.7Hz,J3＝2Hz,Ph-H),6.89(dd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.85(dd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.81(td,1H,J1＝7.6Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.73(d,1H,J＝8.4Hz,Ph-H),6.55(dd,2H,J1＝8.3Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),4.67(t,2H,J＝7.1Hz,-OCH2-),4.55-4.52(m,4H,-OCH2-),4.42-4.39(m,4H,-OCH2-),4.25(t,2H,J＝7.1Hz,-OCH2-),4.21(s,4H,-NCH2-),4.16(s,4H,-NCH2-),4.04(t,4H,J＝6.3Hz,-OCH2-),3.77(t,4H,J＝8Hz,-OCH2-),3.59(s,6H,-OCH3),3.56-3.51(m,22H,-OCH2-,-OCH3),3.40(s,6H,-OCH3).13C-NMR(CDCl3,δppm):172.04(C＝O),170.86(C＝O),157.34(CAr),156.06(CAr),152.60(CAr),150.47(CAr),149.56(CAr),149.05(CAr),146.15(CAr),141.94(CAr),139.09(CAr),138.40(CAr),137.81(CAr),128.69(CAr),125.64(CAr),124.58(CAr),122.48(CAr),122.34(CAr),121.21(CAr),119.10(CAr),116.81(CAr),116.64(CAr),115.01(CAr),114.16(CAr),113.21(CAr),112.89(CAr),112.75(CAr),111.73(CAr),108.88(CAr),105.50(CAr),72.08(-OCH2-),70.93(-OCH2-),70.84(-OCH2-),70.68(-OCH2-),70.64(-OCH2-),70.25(-OCH2-),69.17(-OCH2-),66.70(-OCH2-),65.22(-OCH2-),64.78(-OCH2-),64.69(-OCH2-),64.24(-OCH2-),59.20(-OCH3),53.86(-NCH2-),53.36(-NCH2-),52.04(-OCH3),51.73(-OCH3).HRMS(ESI)calcd for:C64H73N6O22S4 +([M+H]+):1405.3653；found:1405.3685.
S6：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯(140mg,0.1mmol,1eq)溶于THF(4mL)，冰水浴冷却，另将LiOH(24mg,1mmol,10eq)溶于1mL水，加入反应体系，在0-5℃继续搅拌反应1h，恢复至室温反应24h；蒸干溶剂，粗产物用EtOAc荡洗，溶于水中，使用KHSO4(1M)酸化至pH＝3，EtOAc(4mL)萃取三次，合并有机相，Na2SO4干燥，蒸干溶剂即得化合物3；取该产物溶于水中，加入等当量KOH混合溶解，冻干，即得134mg化合物1，产率89％；换用LiOH或NaOH进行中和，可分别得到化合物4和化合物5。
Figure BDA0003848037830000111
化合物1、3、4、5具有相同的核磁和质谱结果：
1H-NMR(600MHz,MeOD,δppm):7.84(dd,1H,J1＝7.9Hz,J2＝1.2Hz,Ph-H),7.71(td,1H,J1＝7.7Hz,J2＝2.0Hz,Ph-H),7.60(dd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),7.55(dd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),7.49(d,1H,J＝8.5Hz,Ph-H),7.20(t,1H,J＝8.3Hz,Ph-H),6.95(d,1H,J＝7.7Hz,Ph-H),6.71(td,1H,J1＝7.6Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.65(dd,2H,J1＝8.4Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),4.55-4.52(m,4H,-OCH2-),4.42-4.37(m,6H,-OCH2-),4.30(t,2H,J＝7.1Hz,-OCH2-),4.17(s,4H,-NCH2-),4.09(t,4H,J＝6.2Hz,-OCH2-),3.98(s,4H,-NCH2-),3.69(t,4H,J＝5.0Hz,-OCH2-),3.56-3.51(m,16H,-OCH2-),3.42(s,6H,-OCH3).13C-NMR(MeOD,δppm):176.59(C＝O),175.04(C＝O),164.65(CAr),163.46(CAr),157.30(CAr),156.09(CAr),152.59(CAr),149.01(CAr),146.09(CAr),141.93(CAr),138.74(CAr),138.47(CAr),138.07(CAr),133.48(CAr),131.42(CAr),131.12(CAr),129.86(CAr),128.68(CAr),128.03(CAr),127.48(CAr),126.58(CAr),125.72(CAr),124.56(CAr),122.59(CAr),121.27(CAr),116.88(CAr),115.06(CAr),113.17(CAr),112.86(CAr),108.84(CAr),105.54(CAr),71.99(-OCH2-),70.90(-OCH2-),70.81(-OCH2-),70.64(-OCH2-),70.26(-OCH2-),67.04(-OCH2-),65.15(-OCH2-),64.79(-OCH2-),64.64(-OCH2-),64.13(-OCH2-),59.13(-OCH3),57.47(-OCH2-),56.99(-NCH2-),53.48(-NCH2-).HRMS(ESI)calcd for:C60H65N6O22S4 +([M+H]+):1349.3027；found:1349.3035.
化合物8～13的合成方法参考化合物1的制备，所得产物的电喷雾高分辨质谱(ESIHRMS)结果参见表2。
表2化合物8～13的电喷雾高分辨质谱(ESI HRMS)
化合物 [M+H]+ 化合物 [M+H]+
8 1233.2921 11 2349.9424
9 1557.4705 12 1085.1458
10 1293.3132 13 2141.7749
实施例2化合物2的合成
化合物2的合成中S1、S2、S6步骤与实施例1相同，然后继续进行以下步骤：
S7：1-(2-氨基-5-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸钾(化合物1,120mg,80μmol,1eq)溶于乙腈(3mL)，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,70μL,0.4mmol,5eq)和乙酸溴甲酯(47μL,0.5mmol,6eq)，室温搅拌反应过夜；蒸干溶剂，分散于CH2Cl2中，抽滤，滤液蒸干，粗产物使用硅胶柱色谱分离(石油醚PE/EtOAc＝2:1)即可得到暗绿色固体产物26mg(化合物2)，产率20％。
Figure BDA0003848037830000121
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6,δppm):7.58(dd,1H,J1＝7.4Hz,J2＝1.2Hz,Ph-H),7.29(d,1H,J＝2.2Hz,Ph-H),7.20(t,1H,J＝8.3Hz,Ph-H),6.98(td,1H,J1＝7.7Hz,J2＝2.0Hz,Ph-H),6.80(dd,1H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.74-6.69(m,2H,Ph-H),6.65(dd,2H,J1＝8.4Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.60(d,1H,J＝7.7Hz,Ph-H),5.06(t,2H,J＝5.2Hz,-OCH2-),4.57-4.53(m,6H,-OCH2-),4.42-4.40(m,4H,-OCH2-),4.36(s,4H,-OCH2O-),4.17(s,4H,-NCH2-),4.09(t,4H,J＝6.2Hz,-OCH2-),3.98(s,4H,-NCH2-),3.92(s,4H,-OCH2O-),3.69(t,4H,J＝5.0Hz),3.56-3.51(m,16H,-OCH2-),2.13(s,6H,-CH3),1.75(s,6H,-CH3).HRMS(ESI)calcd for:C72H81N6O30S4 +([M+H]+):1637.3872；found:1637.3825.
实施例3化合物6的的合成
化合物6的合成中S1步骤与实施例1相同，然后继续进行以下步骤：
S4：2-(4-叔丁氧羰基氨基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(60.6mg,0.19mmol,1.2eq)、2-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)-3,4-乙烯二氧基-5-溴噻吩(153mg,0.16mmol,1eq)和Pd(PPh3)4(18mg,16μmol,0.1eq)溶于新蒸四氢呋喃(THF,15mL)，室温搅拌30min；另配制K2CO3水溶液(0.5mL,1M)，N2鼓泡脱气20min，加入反应体系，65℃加热反应过夜；冷却至室温，蒸干溶剂，粗产物溶于CH2Cl2(0.5mL)，加入CF3COOH(TFA,178μL,2.4mmol,15eq)酸化，室温搅拌反应1h；反应液倒入饱和NaHCO3溶液(10mL)中，CH2Cl2(2.5mL)萃取三次，合并有机相，KOH溶液(1.5mL,1M)洗三次，MgSO4干燥，硅胶柱色谱分离(正己烷/EtOAc＝1:1)得到产物94mg：4-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯胺，产率61％。
Figure BDA0003848037830000131
1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.51(d,2H,J＝8.6Hz,Ph-H),7.21(t,1H,J＝8.3Hz,Ph-H),6.78(d,2H,J＝8.6Hz,Ph-H),6.55(d,2H,J＝8.4Hz,Ph-H),4.52-4.55(m,4H,-OCH2-),4.39-4.41(m,4H,-OCH2-),4.03(t,4H,J＝6.2Hz,-OCH2-),3.77(t,4H,J＝8Hz,-OCH2-),3.50-3.58(m,18H,-NH2,-OCH2-),3.41(s,6H,-OCH3).13C-NMR(CDCl3,δppm):157.37(CAr),156.07(CAr),152.66(CAr),149.12(CAr),146.21(CAr),146.07(CAr),142.01(CAr),138.39(CAr),131.92(CAr),128.68(CAr),128.43(CAr),125.66(CAr),124.60(CAr),116.84(CAr),115.52(CAr),114.91(CAr),113.13(CAr),112.88(CAr),108.85(CAr),105.50(CAr),72.00(-OCH2-),70.89(-OCH2-),70.81(-OCH2-),70.62(-OCH2-),70.19(-OCH2-),65.14(-OCH2-),64.76(-OCH2-),64.62(-OCH2-),64.17(-OCH2-),59.22(-OCH3).HRMS(ESI)calcdfor:C44H48N5O12S4 +([M+H]+):966.2183；found:966.2372.
S5：3-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-氨基苯甲醛-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯(56mg,0.1mmol,1eq)和4-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯胺(97mg,0.1mmol,1eq)溶于无水CH2Cl2(2mL)，加入活化分子筛
Figure BDA0003848037830000142
室温反应1h，抽滤，蒸干溶剂；加入甲醇(2mL)溶解，冰水浴冷却，加入NaBH4(4mg,0.1mmol,1eq)，继续室温反应1h后加水猝灭反应；反应液用CH2Cl2萃取，有机相依次用水和饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，抽滤，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离(PE/EtOAc＝10:1)得到127mg产物：1-(2-氨基-5-(4-(3,4-乙烯二氧基-5-(8-(3,4-乙烯二氧基-5-(2,5-双(甲氧基三乙二醇基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)-4-基)噻吩-2-基)苯氨基甲基)苯氧基)-2-(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯，产率84％。
Figure BDA0003848037830000141
1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.71(d,1H,J＝7.9Hz,Ph-H),7.58(d,2H,J＝8.5Hz,Ph-H),7.29(s,1H,Ph-H),7.21(t,1H,J＝8.4Hz,Ph-H),7.10(dd,1H,J1＝7.4Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),6.90-6.92(m,2H,Ph-H),6.79-6.82(m,2H,Ph-H),6.55-6.59(m,3H,Ph-H),5.24(t,1H,J＝5.2Hz,-NH-),4.67(t,2H,J＝7.0Hz,-OCH2-),4.53-4.56(m,4H,-OCH2-),4.41(t,4H,J＝6.1Hz,-OCH2-),4.25(t,2H,J＝7.0Hz,-OCH2-),4.20-4.21(m,6H,-NCH2-),4.16(s,4H,-NCH2-),4.03(t,4H,J＝6.3Hz,-OCH2-),3.78(t,4H,J＝7.9Hz,-OCH2-),3.60(s,6H,-OCH3),3.51-3.56(m,22H,-OCH2-,-OCH3),3.40(s,6H,-OCH3).13C-NMR(CDCl3,δppm):172.09(C＝O),170.90(C＝O),157.38(CAr),156.11(CAr),152.66(CAr),150.50(CAr),149.77(CAr),149.62(CAr),149.10(CAr),146.21(CAr),142.00(CAr),139.11(CAr),138.38(CAr),137.88(CAr),131.98(CAr),130.03(CAr),129.07(CAr),128.72(CAr),125.72(CAr),124.62(CAr),122.32(CAr),121.25(CAr),119.18(CAr),116.89(CAr),116.66(CAr),114.92(CAr),114.42(CAr),114.07(CAr),113.12(CAr),112.79(CAr),112.73(CAr),111.70(CAr),108.82(CAr),105.45(CAr),72.00(-OCH2-),70.89(-OCH2-),70.78(-OCH2-),70.66(-OCH2-),70.62(-OCH2-),70.24(-OCH2-),69.19(-OCH2-),66.66(-OCH2-),65.24(-OCH2-),64.76(-OCH2-),64.65(-OCH2-),64.18(-OCH2-),59.21(-OCH3),53.80(-NCH2-),53.28(-NCH2-),52.05(-OCH3),51.73(-OCH3),48.32(-NH-CH2-).HRMS(ESI)calcd for:C71H80N7O22S4 +([M+H]+):1510.4240；found:1510.5321.
S6：参考实施例1，制备得到化合物6，产率87％。
1H-NMR(600MHz,MeOD,δppm):7.83(dd,1H,J1＝7.8Hz,J2＝1.2Hz,Ph-H),7.70(td,1H,J1＝7.8Hz,J2＝1.9Hz,Ph-H),7.57-7.62(m,3H,Ph-H),7.54(dd,1H,J1＝7.6Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),7.48(d,1H,J＝8.4Hz,Ph-H),7.19(t,1H,J＝8.4Hz,Ph-H),6.94(d,1H,J＝7.6Hz,Ph-H),6.81(dd,1H,J1＝8.6Hz,J2＝1.3Hz,Ph-H),6.72(t,1H,J＝7.5Hz,Ph-H),6.66(dd,2H,J1＝8.4Hz,J2＝1.4Hz,Ph-H),5.24(br,1H,-NH-),4.54(t,4H,J＝6.1Hz,-OCH2-),4.41(t,4H,J＝5.9Hz,-OCH2-),4.37(t,2H,J＝5.3Hz,-OCH2-),4.31(t,2H,J＝7.2Hz,-OCH2-),4.17-4.20(m,6H,-NCH2-),4.09(t,4H,J＝6.3Hz,-OCH2-),3.98(s,4H,-NCH2-),3.70(t,4H,J＝5.0Hz,-OCH2-),3.49-3.57(m,16H,-OCH2-),3.41(s,6H,-OCH3).13C-NMR(MeOD,δppm):176.68(C＝O),175.00(C＝O),164.70(CAr),163.41(CAr),157.26(CAr),156.08(CAr),152.63(CAr),149.76(CAr),149.04(CAr),146.06(CAr),141.92(CAr),138.70(CAr),138.45(CAr),138.09(CAr),137.70(CAr),133.52(CAr),131.97(CAr),130.02(CAr),129.89(CAr),128.72(CAr),128.05(CAr),127.49(CAr),126.53(CAr),125.71(CAr),124.57(CAr),122.62(CAr),121.31(CAr),116.84(CAr),115.05(CAr),114.40(CAr),113.22(CAr),112.81(CAr),108.82(CAr),105.58(CAr),71.95(-OCH2-),70.91(-OCH2-),70.85(-OCH2-),70.61(-OCH2-),70.58(-OCH2-),70.23(-OCH2-),66.99(-OCH2-),65.12(-OCH2-),64.74(-OCH2-),64.63(-OCH2-),64.12(-OCH2-),59.12(-OCH3),57.46(-OCH2-),57.00(-NCH2-),53.46(-NCH2-),48.35(-NH-CH2-).HRMS(ESI)calcd for:C67H72N7O22S4 +([M+H]+):1453.8235；found:1453.8921.实施例4化合物7的合成
S3：2-(3-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-氨基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-N,N,N’,N’-四乙酸甲酯(252mg,0.38mmol,2.4eq)、4,8-双(3,4-乙烯二氧基-5-溴噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑)(101mg,0.16mmol,1eq)和Pd(PPh3)4(36mg,32μmol,0.2eq)溶于新蒸四氢呋喃(THF,15mL)，室温搅拌30min。另配制K2CO3水溶液(0.5mL,1M)，N2鼓泡脱气20min，加入反应体系，65℃加热反应过夜。冷却至室温，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离(乙酸乙酯EtOAc/CH2Cl2＝1:19)，得到产物103mg：4,8-双(3,4-乙烯二氧基-5-(3-(2-(2-氨基苯氧基)乙氧基)-4-氨基苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-C:4,5-C']双([1,2,5]噻二唑-N,N,N’,N’,N”,N”,N”’,N”’-八乙酸甲酯，产率42％。
Figure BDA0003848037830000161
1H-NMR(600MHz,CDCl3,δppm):7.70(d,2H,J＝8Hz,Ph-H),7.61(s,2H,Ph-H),6.81-6.93(m,8H,Ph-H),6.72(d,2H,J＝8.4Hz,Ph-H),4.66(t,4H,J＝7.2Hz,-OCH2-),4.54(t,4H,J＝6.1Hz,-OCH2-),4.40(t,4H,J＝6Hz,-OCH2-),4.25(t,4H,J＝7.1Hz,-OCH2-),4.22(s,8H,-NCH2-),4.16(s,8H,-NCH2-),3.60(s,12H,-OCH3),3.55(s,12H,-OCH3).13C-NMR(CDCl3,δppm):172.01(C＝O),170.84(C＝O),152.64(CAr),150.52(CAr),149.58(CAr),142.00(CAr),139.15(CAr),138.39(CAr),137.81(CAr),125.66(CAr),122.47(CAr),122.35(CAr),121.19(CAr),119.17(CAr),116.66(CAr),114.07(CAr),113.18(CAr),112.68(CAr),111.69(CAr),108.87(CAr),69.10(-OCH2-),66.71(-OCH2-),64.71(-OCH2-),64.67(-OCH2-),53.86(-NCH2-),53.34(-NCH2-),52.04(-OCH3),51.70(-OCH3).HRMS(ESI)calcd for:C70H71N8O24S4 +([M+H]+):1535.3465；found:1535.3435.
S6：参考实施例1，制备得到化合物7，产率87％。
1H-NMR(600MHz,MeOD,δppm):7.85(dd,2H,J1＝7.9Hz,J2＝1.1Hz,Ph-H),7.72(ddd,2H,J1＝7.8Hz,J2＝5.6Hz,J3＝2.1Hz,Ph-H),7.61(dd,2H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),7.54(dd,2H,J1＝7.6Hz,J2＝1.6Hz,Ph-H),7.49(d,2H,J＝8.6Hz,Ph-H),6.94(d,2H,J＝7.8Hz,Ph-H),6.72(td,2H,J1＝7.5Hz,J2＝1.5Hz,Ph-H),4.54(t,4H,J＝6.1Hz,-OCH2-),4.41(t,4H,J＝6Hz,-OCH2-),4.38(t,4H,J＝5.3Hz,-OCH2-),4.31(t,4H,J＝7Hz,-OCH2-),4.17(s,8H,-NCH2-),3.99(s,8H,-NCH2-).13C-NMR(MeOD,δppm):176.65(C＝O),175.02(C＝O),164.64(CAr),163.49(CAr),152.60(CAr),141.92(CAr),138.79(CAr),138.49(CAr),138.11(CAr),133.43(CAr),131.09(CAr),129.83(CAr),128.07(CAr),127.50(CAr),126.54(CAr),125.72(CAr),122.62(CAr),121.29(CAr),113.21(CAr),108.84(CAr),67.08(-OCH2-),64.83(-OCH2-),64.66(-OCH2-),57.52(-OCH2-),56.94(-NCH2-),53.47(-NCH2-).HRMS(ESI)calcdfor:C62H55N8O24S4 +([M+H]+):1422.1451；found:1422.1435.试验例1化合物的光学性能测试
将实施例1中得到的化合物1溶于PBS缓冲液中，得到浓度为66.6μM的溶液，测量其吸收光谱和在808nm激光激发下的荧光发射光谱如附图1所示。可见，在水溶液中，化合物1在789nm处有最大吸收，摩尔吸光系数7.03×103M-1cm-1，荧光发射峰在1056nm，绝对荧光量子产率为0.90±0.03％。
化合物6～13用相同方法进行测定，结果参见表3。其中，化合物3～5是1的不同盐或酸，溶于水后阳离子电离，其光学性能与1相同；化合物2乙酰氧甲基化后产物不发光，进入细胞之后乙酰氧甲基被酯酶水解之后荧光恢复，因此化合物2只在细胞内有荧光，见试验例4。
表3化合物水溶液的光学性能表征数据
Figure BDA0003848037830000171
Figure BDA0003848037830000181
可见，本申请化合物吸收峰在700～900nm之间，荧光发射峰在1050～1070nm之间，在近红外二区(1000～1700nm)之间，具有较好的散射率和穿透性，可以实现在无创条件下生物体内深处的生理过程进行成像。
试验例2化合物的荧光强度对Ca2+浓度的响应力
将化合物1、6～13溶液(10μM)加入含有不同浓度自由Ca2+的校准溶液中([Ca2+]free＝0-39μM)，测量其荧光强度的变化，由此可以计算化合物与Ca2+形成的配合物的解离平衡常数Kd。
化合物1在不同浓度自由Ca2+的校准溶液中的荧光发射光谱参见图2，可见，当Ca2+浓度从0升至39μM，化合物1的荧光强度增加(ΔF/F)了5倍，计算得到的解离平衡常数Kd＝0.47μM。
其他化合物对Ca2+浓度的响应情况统计如表4。
表4化合物对Ca2+浓度的响应解离平衡常数
Figure BDA0003848037830000182
可见，本申请化合物的荧光强度均会对随Ca2+浓度增加而提高，因此可用于Ca2+浓度变化的检测。
试验例3化合物的细胞毒性和光毒性检测
使用化合物2的水溶液(1～1000μM)与神经元共孵育对神经元进行标记，培养24h后使用CCK8检测神经元的细胞存活率。另使用808nm激光照射(0.33W cm-2)标记化合物2的神经元5min，培养24h后使用CCK8检测神经元的细胞存活率。
神经元存活率检测结果如图3所示，可见，本申请化合物2具有较低的细胞毒性和光毒性，可用于神经元的标记和成像。
试验例4化合物分子探针对神经元细胞内Ca2+浓度变化的检测
使用化合物2的水溶液(20μM)与神经元共孵育对神经元进行标记，使用倒置荧光显微镜对标记化合物2的神经元进行成像，激发光为808nm激光，接收波长为1000～1300nm，检测到神经元自发脉冲引起的细胞内Ca2+浓度变化参见图4。
由图可见，本申请化合物可用于神经元细胞内Ca2+浓度变化(钙流)的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种有机染料化合物，其特征在于，所述有机染料化合物具有式I结构：
Figure QLYQS_1
其中，R1选自式A或式B，R2选自式A或式C：
Figure QLYQS_2
其中，R5为H、Li、Na、K或乙酰氧甲基，R6为式D结构，n=0~12；
R3、R4各自独立地选自H或式D，n=0~12；或R3、R4连接成环与噻吩结合为乙烯二氧基噻吩。
2.根据权利要求1所述有机染料化合物，其特征在于，R3、R4同时为H，或R3为式D，n=0~12，R4为H；或R3、R4连接成环与噻吩结合为乙烯二氧基噻吩。
3.一种有机染料化合物，其特征在于，其特征在于，所述有机染料化合物具有以下任一结构式：
Figure QLYQS_3
Figure QLYQS_4
其中，R5为H、Li、Na、K或乙酰氧甲基，n=0、3、12。
4.权利要求1或2所述有机染料化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将式II化合物与式III化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物IV；
Figure QLYQS_5
S2、将式IV化合物与式V化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物VI；
Figure QLYQS_6
S3、将式II化合物与式V化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应得到中间产物VII；
Figure QLYQS_7
S4、将式IV化合物与式VIII化合物在钯催化剂、碱金属碳酸盐存在的条件下进行反应，脱保护得到中间产物IX；
Figure QLYQS_8
S5、将式IX化合物与式X化合物在脱水剂存在的条件下反应，再在还原剂存在条件下还原，得到中间产物XI；
Figure QLYQS_9
S6、将式VI、VII或XI化合物在碱金属氢氧化物存在的条件下水解，再与乙酸溴甲酯在有机碱性试剂存在的条件下反应，得所述有机染料化合物；
其中，R1~R6的定义与权利要求1或2定义一致，R7为甲基、乙基或叔丁基，R8为叔丁氧羰基、苄氧羰基或9-芴基甲氧羰基。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S6中，所述有机碱性试剂为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述还原剂为NaBH4。
7.权利要求1~3任一所述有机染料化合物在制备荧光探针、有机染料中的应用。
8.一种荧光探针，其特征在于，含有权利要求1~3任一所述有机染料化合物。
9.一种有机染料，其特征在于，含有权利要求1~3任一所述有机染料化合物。
10.权利要求8所述荧光探针或权利要求9所述有机染料在Ca2+检测中的应用。
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