CN115364120B - 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用 - Google Patents

一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115364120B
CN115364120B CN202211212470.5A CN202211212470A CN115364120B CN 115364120 B CN115364120 B CN 115364120B CN 202211212470 A CN202211212470 A CN 202211212470A CN 115364120 B CN115364120 B CN 115364120B
Authority
CN
China
Prior art keywords
exo
msc
mcao
cultured
exosome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211212470.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115364120A (zh
Inventor
辛涛
王珊
韩敏
苏斐
刘子豪
杨鸿儒
张灿伟
赵华阳
李玉明
尚皓
王秉诚
张子豪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Priority to CN202211212470.5A priority Critical patent/CN115364120B/zh
Publication of CN115364120A publication Critical patent/CN115364120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115364120B publication Critical patent/CN115364120B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种水凝胶3D培养MSC来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用。本发明首次研究并证实采用3D‑Exo具有缓解MCAO并发症，改善预后等作用。具体的，3D‑Exo能够有效改善MCAO后神经功能缺损等症状，因此3D‑Exo是一种潜在的治疗方法，可以减轻MCAO后脑损伤区域局部微环境，促进神经功能的恢复，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种水凝胶3D培养MSC来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种水凝胶3D培养MSC来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脑卒中是严重威胁人类健康的疾病，占全球第三位死因，占脑卒中总数的75-80％。脑缺血后，强烈的神经炎性反应是造成继发性脑损伤的主要原因，在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,I/R)中起着不可或缺的作用。小胶质细胞作为中枢神经***(central nervous system,CNS)中唯一的先天免疫细胞，在脑损伤后反应最早，在调节脑损伤诱导的炎性环境中发挥着不可或缺的作用。
间充质干细胞来源外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-Exo)可促进脑损伤后神经血管重构和神经功能的恢复，具有极大的应用前景。另外，MSC-Exo具有良好的循环稳定性、生物相容性、生物屏障通透性、低毒性和低免疫原性，这些特性主要依赖于封装在外泌体内的多种生物活性物质(蛋白质、miRNAs)发挥细胞间的调控作用。然而，发明人发现，如何大幅提高MSC-Exo的产生效率仍是困扰科研人员的难题。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供作为一种水凝胶3D培养MSC来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用。本发明通过利用GelMA光固化水凝胶3D培养MSC，提取3D-Exo并用于小鼠I/R的治疗，经研究证明，3D-Exo可减轻大脑中动脉闭塞(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)后I/R诱导的神经炎症反应、细胞凋亡及胶质瘢痕，有助于缓解MCAO并发症，改善其预后。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供外泌体在制备脑缺血损伤修复产品中的应用。
其中，所述脑缺血损伤具体为脑缺血再灌注损伤，更具体的，在本发明的一个具体实施方式中，所述脑缺血损伤是由大脑中动脉闭塞(MCAO)介导的脑缺血再灌注损伤。
具体的，所述脑缺血损伤修复具体表现为：
(a)减轻MCAO诱导的神经功能缺损；
(b)减轻MCAO导致的脑组织损伤；
(c)减少MCAO诱导的尼氏小体的丢失；
(d)抑制MCAO诱导的细胞凋亡；
(e)促进MCAO导致脑局部脑血流的恢复性增加；
(f)促进MCAO受损脑组织中CD31、TGFβ1的表达；
(g)抑制MCAO后TNF-α、IL-6的表达，促进IL-10的表达；
(h)促进神经修复蛋白的上调表达；
(i)促进神经修复相关miRNAs的上调表达；
(j)促进MCAO后缺血组织的血管生成。
所述外泌体为间充质干细胞来源的外泌体；更具体的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
所述外泌体直径为30-150nm。
其中，外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体；进一步优选的，所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体(3D-MSC-Exo)。采用GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞，可通过可溶性分泌物产生具有增强治疗效力的Exo来调节它们的旁分泌信号，增强了血管生成、神经发生和免疫调节，介导神经功能恢复。此外，通过机械拉伸影响MSC的可溶性因子的分泌，从而显著促进细胞因子的分泌，而3D培养的MSC比2D培养或单一培养的细胞分泌更多的Exo。
本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述外泌体。更具体的，所述外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体；进一步优选的，所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。
所述产品具有如下功效：
(a)减轻MCAO诱导的神经功能缺损；
(b)减轻MCAO导致的脑组织损伤；
(c)减少MCAO诱导的尼氏小体的丢失；
(d)抑制MCAO诱导的细胞凋亡；
(e)促进MCAO导致脑局部脑血流的恢复性增加；
(f)促进MCAO受损脑组织中CD31、TGFβ1的表达；
(g)抑制MCAO后TNF-α、IL-6的表达，促进IL-10的表达；
(h)促进神经修复蛋白的上调表达；
(i)促进神经修复相关miRNAs的上调表达；
(j)促进MCAO后缺血组织的血管生成；
(k)用于MCAO介导的脑缺血再灌注损伤的治疗。
本发明的第三个方面，提供一种脑缺血损伤修复的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制外泌体或上述产品。
上述一个或多个技术方案的有益效果：
上述技术方案首次研究并证实采用GelMA水凝胶3D培养MSC后提取3D-Exo，将3D-Exo静脉注入到MCAO小鼠体内，通过减轻神经炎症反应，增加新生血管数量，具有良好的神经保护作用。因此3D-Exo是一种潜在的治疗MCAO策略，可减轻MCAO后的局部微环境，促进神经功能恢复，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中MSC培养及MSC-Exo鉴定。(A)光学显微镜下2D-和3D-MSC形态学图像。(B)通过钙黄绿素-AM/PI进行活/死细胞染色。死细胞用PI(红色荧光)染色，活细胞用钙黄绿素-AM(绿色荧光)染色。(C)2D-或3D-MSC中SOX2免疫荧光染色。(D)2D-或3D-MSC中Nanog免疫荧光染色。(E)SOX2代表性western blotting条带。(F)SOX2蛋白表达定量分析。(G)Nanog代表性western blotting条带。(H)Nanog蛋白表达量定量分析。数据表示为平均值±标准差(SD)(n＝3)。**p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图2为本发明实施例中MSC-Exo的提取及表征。(A)2D-和3D-Exo提取示意图。(B)MSC-Exo的透射电镜形态。(C)通过NanoSight分析MSC-Exo粒径。(D)MSC-Exo阳性标志物(TSG101、CD63和CD9)和阴性标志物(Calnexin)蛋白表达。
图3为本发明实施例中BV2对MSC-Exo的内吞及其对LPS诱导的体外炎症模型影响。(A)BV2细胞摄取PKH67标记的MSC-Exo共聚焦显微镜图像。(B)TNF-α、IL-10、β-actin代表性western blotting条带。(C)TNF-α蛋白表达定量分析。(D)IL-6蛋白表达定量分析。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图4为本发明实施例中MSC-Exo在体透过BBB效率。(A)MSC-Exo穿透BBB效率代表性免疫荧光图像。DAPI：蓝色，Exo：绿色。(B)2D-或3D-Exo在小鼠体内分布。
图5为本发明实施例中MSC-Exo对MCAO诱导的神经元病理改变和神经功能恢复的影响。(A)每组代表性小鼠脑组织TTC染色冠状切片。(B)各组小鼠脑梗死体积定量分析。(C)MCAO后神经功能缺损评分。(D)MCAO后代表性HE和Nissl染色图像。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*p<0.05，***p<0.001、****p<0.0001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图6为本发明实施例中MSC-Exo在MCAO后对脑组织局部血流量(CBF)影响。(A)基于LSFI在各组中CBF代表性图像。(B)0s、10s、60s后脑局部CBF变化统计分析。
图7为本发明实施例中MCAO后MSC-Exo对血管新生的影响。各组TGFβ1、CD31代表性免疫荧光染色图像。DAPI：蓝色，TGFβ1：绿色，CD31：红色。
图8为本发明实施例中MSC-Exo对MCAO后脑组织神经炎性反应和血管新生影响。(A)TNF-α、IL-10、β-actin代表性western blotting条带。(B)TNF-α蛋白表达定量分析。(C)IL-10蛋白表达定量分析。(D)TGFβ1、CD31、β-actin代表性的western blotting条带。(E)TGFβ1蛋白表达定量分析。(F)CD31蛋白表达定量分析。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001，根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图9为本发明实施例中MSC-Exo蛋白质谱测序及生物信息学分析。(A)差异表达蛋白的GO富集分析直方图。(B)KEGG富集分析前20个差异表达蛋白气泡图。
图10为本发明实施例中MSC-Exo内miRNAs测序及生物信息学分析。(A)miRNAs靶基因GO差异分析。(B)前20位KEGG途径差异表达基因富集分析。
图11为本发明实施例中2D-Exo和3D-Exo之间的蛋白分子差异Pearson相关热图。
图12为本发明实施例中2D-Exo和3D-Exo中差异表达蛋白(DEPs)的聚类分析图。
图13为本发明实施例中2D-Exo和3D-Exo中差异表达miRNAs聚类分析图。
具体实施方式
需要指出的是，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明。
如前所示，如何大幅提高MSC-Exo的产生效率仍是困扰科研人员的难题。且针对间充质干细胞中提取的外泌体对MCAO后导致的生理病理性变化能否发挥作用及相关作用机制尚缺乏研究。
发明人研究发现，与传统的二维(two-dimensional,2D)培养相比，MSC的三维(three-dimensional,3D)培养既可最大限度的模拟细胞在体生长环境，又可显著提高外泌体(3D-Exo)的产生效率。在此，我们使用甲基丙烯酰明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)作为载体3D培养MSC，与2D细胞培养相比，3D细胞培养可使细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相互作用并激活更强的细胞信号网络。水凝胶既能模拟人体组织的水环境，又具有优异的生物相容性、较高的生物降解性，是目前组织工程和3D细胞培养的理想生物材料。GelMA水凝胶内3D环境下培养MSC后提取3D-Exo研究其对脑缺血的治疗作用具有重大意义。体外实验证实MSC-Exo可被小胶质细胞内吞后减轻神经炎性反应。体内实验表明，通过尾静脉注入MCAO小鼠体内的MSC-Exo可高效透过BBB并富集于脑缺血区域发挥作用。MSC-Exo在体内被靶细胞内吞后，通过减轻神经炎性反应、促进血管生成发挥强大的神经保护作用。此外，与2D-Exo相比，3D-Exo表现出更高的神经保护效率。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供外泌体在制备脑缺血损伤修复产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述脑缺血损伤具体为脑缺血再灌注损伤，更具体的，在本发明的一个具体实施方式中，所述脑缺血损伤是由大脑中动脉闭塞(MCAO)介导的脑缺血再灌注损伤。
本发明的又一具体实施方式中，所述脑缺血损伤修复具体表现为：
(a)减轻MCAO诱导的神经功能缺损；
(b)减轻MCAO导致的脑组织损伤；
(c)减少MCAO诱导的尼氏小体的丢失；
(d)抑制MCAO诱导的细胞凋亡；
(e)促进MCAO导致脑局部脑血流的恢复性增加；
(f)促进MCAO受损脑组织中CD31、TGFβ1的表达；
(g)抑制MCAO后TNF-α、IL-6的表达，促进IL-10的表达；
(h)促进神经修复蛋白的上调表达；
(i)促进神经修复相关miRNAs的上调表达；
(j)促进MCAO后缺血组织的血管生成。
所述外泌体为间充质干细胞来源的外泌体；更具体的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
所述外泌体直径为30-150nm。
本发明的又一具体实施方式中，外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体；进一步优选的，所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体(3D-MSC-Exo)。采用GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞，可通过可溶性分泌物产生具有增强治疗效力的Exo来调节它们的旁分泌信号，增强了血管生成、神经发生和免疫调节，介导神经功能恢复。此外，通过机械拉伸影响MSC的可溶性因子的分泌，从而显著促进细胞因子的分泌，而3D培养的MSC比2D培养或单一培养的细胞分泌更多的Exo。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含上述外泌体。更具体的，所述外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体；进一步优选的，所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。
所述产品具有如下功效：
(a)减轻MCAO诱导的神经功能缺损；
(b)减轻MCAO导致的脑组织损伤；
(c)减少MCAO诱导的尼氏小体的丢失；
(d)抑制MCAO诱导的细胞凋亡；
(e)促进MCAO导致脑局部脑血流的恢复性增加；
(f)促进MCAO受损脑组织中CD31、TGFβ1的表达；
(g)抑制MCAO后TNF-α、IL-6的表达，促进IL-10的表达；
(h)促进神经修复蛋白的上调表达；
(i)促进神经修复相关miRNAs的上调表达；
(j)促进MCAO后缺血组织的血管生成；
(k)用于MCAO介导的脑缺血再灌注损伤的治疗。
所述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用，从而可用于构建相关细胞或动物模型。
当所述产品为药物时，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。
所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。
所述药物还可与其他预防和/或治疗脑缺血损伤的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。
本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种脑缺血损伤修复的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制外泌体或上述产品。
本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中用到的所有原料除特殊说明外，均为市购获得。
实施例
1.实验动物：选取成年(6-8周)雄性野生型C57/BL6J小鼠作为实验对象，购自济南朋悦动物有限公司(编号：SYXK-LU2020 0022)，实验前7天在山东第一医科大学第一附属医院SPF级动物房中饲养，以自然光/暗(≈12h-12h)循环。动物实验方案由山东第一医科大学动物护理与使用委员会根据国家卫生研究院动物护理与使用指南中概述的原则批准。研究动物模型的人员按照机构动物护理和使用委员会指南(IACUC)的规定接受***培训。
2.MSC 2D培养：随机处死1只新生SD乳鼠，浸泡于体积分数75％乙醇内消毒12min。无菌条件下分离股骨与两侧胫骨，剪除骨端，用无菌PBS冲洗骨髓腔，70μm细胞滤网过滤后离心。取沉淀，用含l0％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基重悬后接种于细胞培养瓶内，72h后换液去除未贴壁细胞。待细胞长至90％融合时传代。取第3代(P3)后的MSC用于本研究。
3.MSC 3D培养：将冻干的GelMA-60溶于含有光引发剂苯基锂-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐(LAP)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，配成5％浓度的GelMA溶液。收集上述MSC细胞并用5％浓度的GelMA溶液重悬细胞以形成生物墨水，细胞密度约1.5×106/mL，将细胞溶液加入到固化环中。通过定时蓝光光源固化10s后加入完全培养基，在37℃细胞培养箱中培养5min后倒掉培养基，加入全新培养基继续培养。
4.MSC-Exo的收集：取第3-5代MSC，待细胞融合至80％时，无菌PBS冲洗2次后用不含血清的DMEM培养基继续培养48h。当细胞密度达到80％时，收集培养基。4℃、2000g离心5min；离心后取上清，将上清置于另一个离心管中，在4℃、3500g离心15min后继续取上清，将上清置于新的离心管中，4℃、10000g离心30min后取上清，吸取上清后移至超高速离心管中，用移液枪在能精确到0.001g的天平上用1×PBS缓冲液配平，放入超高速离心机中，4℃，120000g超高速离心140min后将上清弃去，用1×PBS缓冲液将沉淀重悬后经0.22um无菌滤器过滤后再次吸入超速离心机配套的离心管中，4℃、120000g超高速离心70min后弃上清得到离心管底部外泌体，用100uL的1×PBS液小心吹打离心管底部，吸入到0.5mL离心管中，使用移液枪轻轻吹打，使其完全溶解，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白法测定外泌体浓度，-80℃保存备用。3D-MSC-Exo的收集方法同上，注意收集上清时，用滤网将水凝胶去除。
5.MSC-Exo电镜鉴定：利用透射电镜鉴定形态，取8μL MSC-Exo悬液滴至载体铜网(220目)上，静置2min，滤纸吸干周围后在铜网上滴入8μL 1％的磷钨酸负染液，室温复染2min，铜网放置白炽灯下烤干约10min。利用透射电镜下分别观察2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo并拍照。
6.MSC-Exo表面标志物鉴定：利用Western blotting检测MSC-Exo表面特异性阳性标志蛋白，将新鲜MSC-Exo加入RIPA裂解后利用BCA法蛋白浓度定量，常规Westernblotting检测CD63、CD9和TSG101的表达。阴性标志物用Calnexin定量。
7.MSC-Exo粒径分析：利用qNano仪器鉴定MSC-Exo粒径，将MSC-Exo用PBS按1:100稀释，取40μL加入到上样槽中，加压至700Pa，每次样本测试结束后，在上样槽中加入已知浓度和大小的标准样品CPC100和样本进行校准比对获得结果。qNano仪器参数如下：0.76V电压，125nA电流，纳米孔臂直接的距离设定为47.12mm。利用软件ICS.3.3.2.2000进行校准处理。
8.活/死细胞染色：使用活/死细胞毒性试剂盒(KeyGEN,China)测定MSC存活能力。将钙黄绿素AM和PI的试剂贮备溶液在室温下平衡30min，以制备所需浓度的工作溶液。用PBS洗涤2D-或3D-MSC，加入足量的工作溶液以确保细胞被覆盖，然后在室温下孵育45min。在共聚焦激光显微镜(德国徕卡TCS SP8)下观察细胞存活和增殖情况。
9.MSC-Exo荧光标记：使用PKH-67荧光细胞接头试剂盒标记MSC-Exo。简言之，将MSC-Exo添加到稀溶液C(CC)中，然后将PKH-67染料添加到CC中并孵育4min。加入BSA终止反应后，用PBS悬浮MSC-Exo，以200，000×g去除游离染料2h，用于后续实验。
10.MSC-Exo和BV2细胞共孵育：BV2细胞接种于含5％灭活胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2培养箱培养。将细胞在含有100ng/mL脂多糖的全培养基中培养24h，并更换为新培养基。然后，向每个孔中加入10ug PKH-67标记的MSC-Exo(2D或3D)继续培养24h，并在荧光共聚焦显微镜下拍照，以观察BV2细胞对MSC-Exo的内吞作用。
11.MSC-Exo蛋白质无标记定量：采用BCA法提取MSC-Exo中的蛋白并定量，对20μg样本进行12％SDS-PAGE。电泳后，取出凝胶，用考马斯亮蓝(R-250)染色。胰蛋白酶降解4h后收集肽片段并定量(OD280)。然后使用纳升流速的纳洗脱***分离样本，并进行120min的质谱分析。多肽及多肽片段的质荷比采集如下：每次全扫描后10个片段模式(MS2扫描)，隔离窗2m/z，二级质谱分辨率17，500，MS1，二级最大IT 45ms，归一化碰撞能量27eV。
12.MSC-Exo中miRNAs测序及生信分析：从MSC-Exo中提取总RNA，使用PAGE分离不同片段大小的RNA。切除18-30nt条带，回收小RNA。通过均匀混合、离心制备3′和5′连接体系，然后在合适的时间和温度下连接。进行RNA制备、逆转录和PCR。PCR产物用PAGE分离，溶于溴化乙锭溶液中完成文库构建。使用Illumina的Hiseq或BGI的MGI平台对得到的49个nt序列进行测序，通过过滤获得可信的靶序列。通过对目标序列的分类标注，获得样本中各成分的信息以及表达水平。未注释小RNA片段上新miRNAs的预测。根据GO注释结果以及官方分类,我们将差异miRNA的靶基因进行功能分类,同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析。将差异miRNAs靶基因进行生物通路分类,同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析。
13.小鼠MCAO模型建立：采用线栓法建立MCAO模型，用异氟醚麻醉后，在颈部做一纵向切口，在显微镜下暴露颈部动脉。颈外动脉结扎后，用动脉夹暂时闭塞颈内动脉和颈总动脉，利用线栓(广州佳灵生物技术有限公司；型号：L1800)***颈外动脉，并轻轻***大脑中动脉。在缺血1.5h后，重新麻醉小鼠后移除颈外动脉内的线栓开始再灌注过程。在sham组中，手术过程同前，但线栓未***颈内动脉，而是留在颈外动脉中1.5h。术后，小鼠单笼饲养，可随意获取水和食物。
14.实验设计：在这项研究中，将小鼠随机分为4组：(1)sham组，(2)MCAO组，(3)MCAO+2D-Exo组，(4)MCAO+3D-Exo组。通过尾静脉注射给予MSC-Exo(每只小鼠100μg，体积为100μL)，连续给药3天。
15.神经损伤评分：在相应的时间点，根据Longa法对小鼠神经功能缺失进行评分。Longa评分采用0-4分制，0分最轻，4分最重。
16.小鼠脑组织标本提取：用异氟烷麻醉小鼠后，将其胸腔敞开并显露心脏，20号穿刺针***左心室并指向升主动脉弓方向，先快速灌注生理盐水250mL，并在右心耳剪一小口，使得稀释的血液由此流出。再缓慢灌注4％多聚甲醛，约20min后小鼠的胸骨及肝脏逐渐变白，且肢体僵硬后，打开整个颅骨，完整取出大脑并浸泡在新鲜的甲醛溶液中，固定48h后送病理科行石蜡包埋及切片，切片厚度为5μm。切片行HE染色，镜下观察MCAO情况。
17.苏木精-伊红(HE)染色：脊髓组织经40g/L多聚甲醛溶液固定24h后，梯度脱水，石蜡包埋固定，利用切片机切片，厚度为5-10μm，切片保持和脊髓长轴垂直。切片常规脱蜡、复水，苏木精染色5min，经0.5％盐酸乙醇分色、水洗蓝化后，伊红染色30s，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下观察脊髓组织形态并拍照。
18.尼氏染色：石蜡切片脱蜡后逐级酒精脱脂后至蒸馏水清洗。入1％焦油紫水溶液中染色，37℃温箱中染色20min后用蒸馏水速洗，95％酒精分色，镜检至神经元尼氏体清晰。无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
19.2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色和脑梗死体积测量:在相应的时间点用致死剂量水合氯醛腹腔注射麻醉后处死大鼠。将鼠脑完整取出后置于-20℃冰箱冷冻20min，然后用刀片从前额自前往后将脑组织逐层切片，层厚约2mm，总共切为6片。然后脑组织切片组浸入到提前预热到37℃的2.0％TTC溶液中，在避光的37℃的水浴锅中孵育30min，观察并拍照。正常的脑组织被染成鲜红色，缺血梗死区脑组织为蜡白色。在4％***中固定24h后，通过Image J软件分析得出脑梗死体积百分比。
20.TUNEL染色：石蜡切片脱蜡后滴加20μg/mL不含DNase的蛋白酶K，37℃放置30min，PBS洗涤3min/次×3次，3％H2O2室温孵育20min，PBS洗涤3min/次×3次，滴加50μLTUNEL检测液，37℃湿盒避光孵育90min，PBS洗涤3min，滴加标记反应终止液，室温湿盒孵育10min，PBS洗3min/次×3次，滴加DAB显色液室温孵育10min，PBS洗3min/次×3次，苏木素复染，PBS洗3min/次×3次，树胶加盖片封片。荧光显微镜及照相***下分析结果并拍照，以细胞核内出现棕黄色颗粒为TUNEL阳性标记细胞，对每张切片取5个视野，分别计数外核层凋亡阳性细胞及细胞总数，以凋亡指数反映细胞凋亡的情况。
21.免疫荧光染色：抗原修复后将组织切片与滴加的BSA孵育30min。TGFβ1及CD31抗体4℃孵育过夜后加入相应的二抗，在室温、黑暗环境下孵育50min。向切片中逐滴加入DAPI，切片干燥后在室温下培养10min。最后，用抗荧光猝灭剂密封切片。
22.Western blotting：从细胞或组织匀浆中提取蛋白质并使用BCA蛋白质测定试剂盒测定。然后在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质样品，然后转移到PVDF膜上。在4℃下与一抗在摇床上孵育过夜。荧光结合的二抗在常温条件下孵育1h，然后用TBST溶液冲洗。PVDF膜用TBST溶液洗涤3次，每次5min。通过增强的化学发光(ECL)试剂观察免疫反应带3-5min，采用ECL发光试剂显色，并经Image J凝胶像***进行显影检测，分析目标条带及内参的灰度值，计算出目标蛋白与内参β-actin的比值，分析相对蛋白量。
23.统计分析：数据分析采用MATLAB/GraphPad Prism软件(版本为8.3)。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析评估组间差异，采用Bonferroni检验进行事后比较。统计学显著性标准设定为p<0.05(*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001、和****p<0.0001)。
实验结果：
1.MSC的2D和3D培养及MSC-Exo鉴定
在本研究中，我们分别在常规培养瓶(2D)和光固化GelMA水凝胶(3D)中培养MSC。如图1A所示，2D培养环境中的MSC在培养瓶底部平铺生长，而在水凝胶3D培养中的MSC胞体较小且连接紧密。通过活/死细胞染色检测水凝胶对MSC的细胞毒性。结果显示：水凝胶培养的MSC生长良好，几乎未见死细胞(图1B)。此外，免疫荧光结果显示：与2D-MSC相比，3D-MSC中细胞干性指标(SOX2和Nanog)荧光强度增加(图1C、1D)。Western blotting结果显示：与2D-MSC组相比，3D-MSC组内SOX2和Nanog蛋白表达分别增加了3.46倍和3.3倍(图1E-1H)。
2.MSC-Exo提取及表征
收集2D-或3D-MSC上清液，采用差速离心法提取MSC-Exo(图2A)。TEM结果显示：MSC-Exo为盘状双层膜结构，直径在30-150nm之间(图2B)。NanoSight分析显示：MSC-Exo平均粒径约为120nm(图2C)。Western blotting结果显示：TSG101和CD9在MSC-Exo中高度富集，而Calnexin(内质网应激蛋白)几乎未检测到(图2D)。
3.BV2对MSC-Exo内吞及其对炎症影响
MSC-Exo被靶细胞内吞后才可发挥调控作用。将2D-或3D-Exo(PKH-67标记)与BV2细胞共孵育验证靶细胞内吞效率。免疫荧光结果显示：PKH-67标记的MSC-Exo可被BV2细胞内吞且3D-Exo被内吞的效率更高(图3A)。MSC-Exo可通过调控脑损伤诱导的免疫炎症微环境发挥神经保护作用。在LPS诱导的BV2炎症模型中，与sham组相比，2D-和3D-Exo组中的TNF-α表达分别降低了0.57倍和0.3倍。而IL-10的表达则分别增加了1.96倍和1.46倍(图3B-3D)。
4.3D-Exo靶向脑缺血区域能力
为评估MSC-Exo穿透BBB后靶向脑缺血区域效率，经尾静脉向MCAO小鼠体内注射100μg PKH-67标记的2D-或3D-Exo，12h后取出脑组织进行免疫荧光检测，结果显示：相比于2D-Exo，3D-Exo在脑缺血区域聚集效率更高(图4A)。为观察MSC-Exo在体内分布，注射MSC-Exo 12h后取出动物脑、心、肝、肺、肾、脾并用荧光成像***检测PKH-67荧光强度。结果表明：与2D-Exo组相比，注射3D-Exo后，其在肝脏和肾脏中聚集显著减少，在缺血脑组织中的富集显著增加，证实3D-Exo可显著增强其对缺血脑区域的靶向能力(图4B)。
5.MSC-Exo对减轻神经功能缺损和神经病理损伤影响
MSC-Exo可降低MCAO后小鼠脑梗死体积，TTC结果显示：与MCAO组相比，2D-和3D-Exo组小鼠脑梗死体积分别降低了0.53倍和0.23倍(图5A、5B)，神经功能评分分别提高了0.64倍和0.41倍(图5C)。与MCAO组比较，3D-Exo治疗显著减轻病理损伤、增加Nissl小体数量(图5D)。
6.MSC-Exo对MCAO后脑局部脑血流影响
利用激光斑点血流成像(LSF)检测小鼠双侧大脑皮层局部脑血流量(CBF)。结果表明：MCAO后，与健康侧(左)相比，损伤侧(右)中局部脑组织中CBF急剧下降。与左侧比较，2D-和3D-Exo组右侧局部脑组织CBF明显增加，3D-Exo组CBF增加较对侧更为明显(图6A)。图6B显示小鼠在0s、30s、60s的CBF统计结果。免疫荧光结果显示：与MCAO组相比，2D-和3D-Exo组中CD31、TGFβ1表达显著升高，3D-Exo组增加则更加明显(图7)。
7.MSC-Exo对脑缺血再灌注损伤后炎症反应影响
为进一步验证3D-Exo对小鼠MCAO后缺血组织的神经炎性反应和血管再生影响，利用western blotting检测脑组织内TNF-α、IL-10、CD31和TGFβ1表达。结果表明：与MCAO组相比，3D-Exo组中TNF-α表达水平降低0.5倍，IL-10水平升高2.53倍(图8A-8C)。3D-Exo组与MCAO组比较，CD31、TGFβ1水平分别升高4.32倍和2.09倍(图8D-8F)。表明3D-Exo在减轻缺血脑组织的神经炎性反应和促进血管生成方面更具高效性。
8.MSC-Exo蛋白质谱测序及生物信息学分析
3D-Exo具有较强的神经保护作用，与其内富含神经修复相关生物保护因子有关。在本研究中，我们使用蛋白质谱测序检测2D-和3D-Exo内的蛋白分子差异。分别取3份样本进行检测，样本间的Pearson相关热图见图11。定量蛋白质组学结果显示：与2D-Exo相比，3D-Exo中有19个蛋白上调，33个蛋白下调。2D-和3D-Exo中差异表达蛋白(DEPs)的聚类分析如图12所示。DEPs的GO分析显示：DEPs在细胞粘附调节和蛋白异二聚体活性中显著富集(图9A)。KEGG分析结果显示：DEPs主要富集在坏死、凋亡等相关信号通路(图9B)。
9.MSC-Exo中mRNAs测序及生物信息学分析
分泌细胞微环境变化可导致MSC-Exo中蛋白和miRNAs变化。我们使用limma R软件包分别对2D和3D-Exo进行转录组测序和差异表达分析。差异表达miRNAs聚类分析见图13。使用RNAhybrid、miRBase和TargetScan对这些差异表达mRNAs的靶基因进行预测。预测靶基因的GO功能富集显示主要富集在神经元-突触连接和ATP活性依赖上(图10A)。利用KEGG富集分析对相关差异调节基因进行分析，鉴定出前20条通路，排名前3条的KEGG通路显著富集在PI3K-Akt信号通路、钙调节信号通路和MAPK信号通路(图10B)。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备脑缺血再灌注损伤修复产品中的应用，所述外泌体靶向脑缺血区域；
所述产品为药物或试验试剂，所述试验试剂供基础研究使用。
CN202211212470.5A 2022-09-29 2022-09-29 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用 Active CN115364120B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211212470.5A CN115364120B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211212470.5A CN115364120B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115364120A CN115364120A (zh) 2022-11-22
CN115364120B true CN115364120B (zh) 2023-04-07

Family

ID=84072885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211212470.5A Active CN115364120B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115364120B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111297898A (zh) * 2020-02-18 2020-06-19 山东大学齐鲁医院 间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用
CN111363720A (zh) * 2020-03-28 2020-07-03 海门生原干细胞科技有限公司 一种治疗脑缺血的骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用
WO2020196986A1 (ko) * 2019-03-26 2020-10-01 인천대학교 산학협력단 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법
CN113940949A (zh) * 2021-10-19 2022-01-18 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2687219A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-22 Universität Duisburg-Essen Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSCs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions
US20220008481A1 (en) * 2015-06-12 2022-01-13 Hudson Institute of Medical Research Method of treatment

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196986A1 (ko) * 2019-03-26 2020-10-01 인천대학교 산학협력단 하이드로겔의 기계적 강도를 이용한 줄기세포 유래 세포외 소포체의 혈관신생 관련 사이토카인 조절 방법
CN111297898A (zh) * 2020-02-18 2020-06-19 山东大学齐鲁医院 间充质干细胞来源的细胞外囊泡在脑缺血再灌注损伤中的应用
CN111363720A (zh) * 2020-03-28 2020-07-03 海门生原干细胞科技有限公司 一种治疗脑缺血的骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用
CN113940949A (zh) * 2021-10-19 2022-01-18 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115364120A (zh) 2022-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7275193B2 (ja) 筋ジストロフィーの処置における心筋球由来細胞およびこのような細胞によって分泌されたエキソソーム
Feng et al. Reversing the surface charge of MSC‐derived small extracellular vesicles by εPL‐PEG‐DSPE for enhanced osteoarthritis treatment
Gu et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes improves spinal cord function after injury in rats by activating autophagy
CN110229214B (zh) 一种外泌体缓释多肽水凝胶及其制备方法和用途
WO2021180237A1 (zh) 含人体细胞衍生的细胞膜外囊泡的雾化吸入制剂、制法及其应用
CN109414459A (zh) 源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途
CN115414397B (zh) 续断源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗骨科疾病药物中的应用
Chai et al. Structural alignment guides oriented migration and differentiation of endogenous neural stem cells for neurogenesis in brain injury treatment
Wu et al. Extracellular vesicles from skin precursor-derived Schwann cells promote axonal outgrowth and regeneration of motoneurons via Akt/mTOR/p70S6K pathway
CN112870228B (zh) 一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用
WO2016127503A1 (zh) 来源于粒细胞样髓源性抑制细胞的exosomes及其应用
CN110123838A (zh) 负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途
CN113940949B (zh) 一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用
Han et al. Three-dimensional-cultured MSC-derived exosome with hydrogel for cerebral ischemia repair
CN113134015A (zh) 细胞外囊泡及其在皮肤产品的用途
Xu et al. Hair regenerative effect of silk fibroin hydrogel with incorporation of FGF-2-liposome and its potential mechanism in mice with testosterone-induced alopecia areata
CN110205294B (zh) 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用
Wang et al. Role of axonal guidance factor netrin-1 in human placental vascular growth
CN110384714A (zh) 亚全能干细胞的外泌体及其在促进血管新生和伤口愈合中的用途
CN115364120B (zh) 一种水凝胶3d培养msc来源外泌体及其在脑缺血修复中的应用
CN111978406B (zh) 功能连接多肽、可特异性结合胶原的外泌体载药体系及其应用
CN110755450A (zh) 间充质干细胞来源的细胞外囊泡在治疗蛛网膜下腔出血中的应用
Jiang et al. Engineered Exosomes loaded with triptolide: an innovative approach to enhance therapeutic efficacy in rheumatoid arthritis
WO2018026784A1 (en) In situ cell delivery using reconstituted photopolymerized chondroitin sulfate glycosaminoglycan hydrogel matrices
Crisanti et al. Novel methods for delivery of cell-based therapies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant