CN115356174A - 肝素校准品及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物试剂领域，尤其涉及肝素校准品及其制备方法与应用。本发明在正常猪血浆中添加普通肝素或低分子量肝素中的一种、缓冲剂及冻干保护剂，得到肝素校准品，用于抗Xa测定试剂的校准。本发明的肝素校准品对抗Xa试剂校准后，即可测试普通肝素的抗Xa活性又可测试低分子量肝素的抗Xa活性；本发明的肝素校准品使用的猪血浆相比人血浆和牛血浆来说来源稳定广泛，价格低；本发明的校准品准确性高、性能稳定，保存时间长，市售产品稳定性仅有15个月，而本发明的肝素校准品稳定性可达2年之久，具有较广阔的临床应用前景。

Description

肝素校准品及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物试剂领域，尤其涉及肝素校准品及其制备方法与应用。

背景技术

凝血因子X是一种依赖维生素K的凝血因子，处于内源性凝血途径和外源性凝血途径的共同通路，经过内源性、外源性凝血途径激活，凝血因子X转变为活化的凝血因子X(Xa)。Xa在Ca²⁺存在的条件下，于磷脂膜表面与活化的凝血因子V(Va)形成凝血酶原酶复合物，凝血酶原酶复合物激活凝血酶原使之转为具有酶解活性的凝血酶。凝血酶生成后，催化纤维蛋白原向纤维单体的转变，最终形成稳定的纤维蛋白凝块，即凝血过程完成。

目前临床上抗凝治疗使用的抗凝药物多以肝素类抗凝剂为主。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷，N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，是应用最广泛的抗凝剂之一。肝素可增强抗凝血酶(AT-III)的生物活性，同时抑制Xa，发挥抗凝作用。肝素结构中存在抗凝血酶结合序列，与抗凝血酶结合后导致其构象改变，从而增加活性位点的暴露，Xa占据该活性位点形成无凝血活性的抗凝血酶-凝血因子复合物，因此抑制Xa，发挥抗凝作用。

基于一步发色底物法原理的抗Xa测定试剂盒，在内源性抗凝血酶存在的条件下，肝素与抗凝血酶结合，形成肝素-抗凝血酶复合物，该复合物抑制Xa，同时Xa水解其特异性的发色底物，释放出发色物质，通过检测发色底物吸光值可反映出肝素的含量。基于以上基础原理，本发明计划研制一种与抗Xa测定试剂盒，发色底物法，相配套的肝素校准品，通过将普通肝素或低分子肝素中的一种与缓冲物质及冻干保护剂一起加入到血浆中，再将所得的血浆混合物进行冷冻干燥，由此获得准确性高、性能稳定，保存时间长的肝素校准品，即可测试普通肝素的抗Xa活性，又可测试低分子量肝素的抗Xa活性，目前国内无这种肝素校准品，相关研究公布了一种肝素抗凝检测试剂的校准品及质控品及其制备方法，其是分别制备得到普通肝素校准品和低分子量肝素校准品，然后分别测试相应种类的肝素，其稳定性也仅有15个月，时间较短。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肝素校准品及其制备方法与应用。

本发明提供了肝素校准品，其原料包括肝素、缓冲剂、冻干保护剂和血浆：

所述缓冲剂和血浆的体积比为1～5：39～45；

所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液、Hepes缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；一些实施例中，所述缓冲液为2M的Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液与血浆的体积比为1:39，血浆中Tris终浓度为50mM，所述缓冲液的pH值为7.0～8.5；一些具体实施例中，所述缓冲液优选pH8.4的Tris-HCl缓冲液，其中Tris在血浆中终浓度为50mM。

本发明所述的肝素校准品中，所述冻干保护剂的含量为5％(w/v)～15％(w/v)。

一些实施例中，所述冻干保护剂包括山梨醇、丝氨酸和蔗糖，其中山梨醇、丝氨酸和蔗糖的质量比为(5～6)：(1～2):(3～4)。另一些实施例中，所述冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、丝氨酸、甘氨酸中的一种或几种，所述肝素校准品中，冻干保护剂的总含量为5％(w/v)～15％(w/v)；一些具体实施例中，所述的肝素校准品中的冻干保护剂为10％山梨醇、或为10％丝氨酸、或为10％蔗糖或为10％甘氨酸；另一些具体实施例中，所述的肝素校准品中的冻干保护剂为5％甘露醇+2％丝氨酸+3％蔗糖，或为5％山梨醇+2％丝氨酸+3％海藻糖，或为5％山梨醇+2％甘氨酸+3％蔗糖，或为6％山梨醇+1％丝氨酸+3％蔗糖，或为5％山梨醇+1％丝氨酸+4％蔗糖。一个具体实施例中，所述缓冲液与血浆的体积比为1:39；其中冻干保护剂的含量为10％(w/v)，所述冻干保护剂中，山梨醇、丝氨酸和蔗糖的质量比为5:2:3。

本发明所述的肝素校准品中：

所述血浆为含3.2％(w/v)～3.8％(w/v)的柠檬酸三钠的血浆；

所述血浆包括人血浆、猪血浆、牛血浆、羊血浆。一些实施例中，所述的肝素校准品中使用的血浆为含3.2％柠檬酸三钠的人血浆、猪血浆或牛血浆，优选猪血浆。

本发明所述的肝素校准品中，所述肝素包括普通肝素和/或低分子量肝素，优选低分子量肝素。一些实施例中，所述肝素为低分子量肝素。另一些实施例中，所述肝素为普通肝素。

本发明的肝素校准品中的低分子量肝素的浓度为3～5个浓度水平，优选3个水平，一些实施例中，所述低分子量肝素的浓度为3个浓度水平，所述三个浓度水平的范围分别为：

肝素校准品1：0.00～0.04IU/mL；

肝素校准品2：0.70～0.90IU/mL；

肝素校准品3：1.70～2.0IU/mL。

本发明还提供了所述肝素校准品的制备方法，所述方法包括将肝素、缓冲剂、冻干保护剂和血浆混合后冻干。一些实施例中，所述方法包括将低分子量肝素、缓冲剂及冻干保护剂与正常血浆混合，得到混合物，然后对混合物进行冷冻干燥。

本发明所述肝素校准品和/或所述制备方法制得的肝素校准品在校准肝素或抗Xa测定试剂校准中的应用。

本发明在正常猪血浆中添加普通肝素或低分子量肝素中的一种、缓冲剂及冻干保护剂，得到肝素校准品，用于抗Xa测定试剂的校准。本发明的肝素校准品对抗Xa试剂校准后，即可测试普通肝素的抗Xa活性又可测试低分子量肝素的抗Xa活性；本发明的肝素校准品使用的猪血浆相比人血浆和牛血浆来说来源稳定广泛，价格低；本发明的校准品准确性高、性能稳定，保存时间长，市售产品稳定性仅有15个月，而本发明的肝素校准品稳定性可达2年之久，具有较广阔的临床应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1示标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了肝素校准品及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：冻干保护剂筛选

取血浆370.5mL，加入9.5mL 2M Tris-HCl(pH 8.4)，混匀后分装成30mL/份，往每份中分别加入不同冻干保护剂，每份再分别加入相应浓度的低分子量肝素配制成3个浓度的肝素校准品(水平1的浓度为0.01IU/mL，水平2的浓度为0.80IU/mL，水平3的浓度为1.89IU/mL)，再分别分装成1mL/瓶，每个浓度水平分3瓶，剩余用于冻干前检测。各冻干保护剂配方下的结果如下表1所示：冻干前后损失＝(冻干后测试结果-冻干前测试结果)/冻干前测试结果。

表1：各冻干保护剂下的测试结果

由表中结果可知，在(5％山梨醇+2％丝氨酸+3％蔗糖)配方下，冻干后外观最佳，且冻干前后损失也最小。

效果验证：本发明配方下校准品的性能：肝素校准品(使用表1中本发明配方冻干后的校准曲线)

1.校准曲线

本实验用了本发明配方下的校准品，试剂为本公司的抗Xa试剂，测了校准品的吸光值，每个水平的校准品测试2次，参数为抗Xa R1 100μL，抗Xa R2 100μL，以浓度为y轴，以吸光值的两次对数为x轴，绘制校准曲线。

校准曲线如图1，y＝-19.792x+9.5258，R²＝0.9993。

2.准确度

使用本发明配方的校准品及抗Xa测定试剂盒(发色底物法)建立校准曲线，测试3个浓度的企业参考品，每个浓度重复检测3次，分别计算偏差，如果企业参考品1的3次测试结果与其靶值的绝对偏差≤0.04IU/mL，企业参考品2和企业参考品3的3次测试结果与其靶值的相对偏差在±15％以内，即为合格。(企业参考品1为含冻干保护剂的血浆，企业参考品2和3为含低分子量肝素和冻干保护剂的血浆，使用时用瓶身标示体积的蒸馏水复溶即可。)表2：准确度测试结果

3.均匀性

随机抽取同一批次的3个浓度的校准品(肝素校准品1的浓度为0.01IU/mL，肝素校准品2的浓度为0.80IU/mL，肝素校准品3的浓度为1.89IU/mL)各10瓶，每瓶检测3次，考虑测量***随时间等因素引起的随机变异，3次测量采用不同的顺序进行，采用1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9的顺序进行测量，按照下列公式(1)～(11)计算F、s_bb、s_r和CV_瓶间；

SS_瓶内＝SS_总和-SS_瓶间 公式(3)

v₁＝a-1 公式(7)

v₂＝N-a 公式(8)

公式中：

SS----方差；

x_i----指定参数第i次测量值或计算结果；

----总平均值；

n_i----样品i重复测量次数；

x_ij----样品i的第j个结果；

MS----均方；

v----自由度；

F----F检验值；

n₀----有效测量次数；

a----抽取样品数量；

N----测试总次数；

s_bb----瓶间标准差；

s_r----瓶内标准差(重复性标准差)；

当F≤1时，以s_r代替s_bb计算CV_瓶间；当F≤F_{0.05(v1，v2)}时，检验结果显示瓶间均匀性无显著差异，计算CV_瓶间应≤5％；当F＞F_{0.05(v1，v2)}、s_bb≤0.3δ时，认为瓶间均匀性良好，计算CV_瓶间应≤5％；当F＞F_{0.05(v1，v2)}、s_bb＞0.3δ时，认为瓶间均匀性较差，δ为目标标准偏差，定为均值的10％。

表3：肝素校准品1均匀性测试结果

表4：肝素校准品2均匀性测试结果

表5：肝素校准品3均匀性测试结果

由表4和表5可知，肝素校准品2和3的瓶间均匀性良好。

结果表明，三个浓度水平下，本发明提供的肝素校准品瓶间差异都较小，可更准确的用于样品的校准。

4.稳定性

稳定性检测的温度为2℃～8℃，存放于医用冷藏箱中。

表6：稳定性测试结果

注：结果的单位为IU/mL，偏差是指绝对偏差(IU/mL)或相对偏差(％)。

由表中稳定性结果可知，肝素校准品可稳定30个月，肝素校准品1的绝对偏差在±0.01IU/mL以内，肝素校准品2和肝素校准品3的相对偏差在±5％以内。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.肝素校准品，其特征在于，其原料包括肝素、缓冲剂、冻干保护剂和血浆：

所述缓冲剂和血浆的体积比为(1～5)：(39～45)；

所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液、Hepes缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；

所述冻干保护剂包括山梨醇、丝氨酸和蔗糖，其中山梨醇、丝氨酸和蔗糖的质量比为(5～6)：(1～2):(3～4)。

2.根据权利要求1所述的肝素校准品，其特征在于：

所述血浆为含3.2％(w/v)～3.8％(w/v)柠檬酸三钠的血浆；

所述血浆包括人血浆、猪血浆、牛血浆或羊血浆。

3.根据权利要求1或2所述的肝素校准品，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7.0～8.5。

4.根据权利要求1～3任一项所述的肝素校准品，其特征在于，所述血浆与缓冲液的体积比为(1～3)：(39～42)。

5.根据权利要求1所述的肝素校准品，其特征在于，所述冻干保护剂的含量为5％(w/v)～15％(w/v)。

6.根据权利要求1～5任一项所述的肝素校准品，其特征在于，所述肝素包括普通肝素和/或低分子量肝素。

7.根据权利要求5所述的肝素校准品，其特征在于，所述低分子量肝素的浓度为3个浓度水平，所述3个浓度水平的范围分别为：

肝素校准品1：0.00～0.04IU/mL；

肝素校准品2：0.70～0.90IU/mL；

肝素校准品3：1.70～2.0IU/mL。

8.根据权利要求7所述的肝素校准品，其特征在于，所述缓冲液为2M的Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液与血浆的体积比为1:39；其中冻干保护剂的含量为10％(w/v)，其中，山梨醇、丝氨酸和蔗糖的质量比为5:2:3。

9.权利要求1所述肝素校准品的制备方法，其特征在于，所述方法包括将肝素、缓冲剂、冻干保护剂和血浆混合后冻干。

10.权利要求1～8任一项所述肝素校准品和/或权利要求9所述制备方法制得的肝素校准品在校准肝素或抗Xa测定试剂校准中的应用。

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