CN115353983B

CN115353983B - 鲁氏接合酵母zr21和汉逊德巴利酵母dh06及利用其制作速成豆豉的方法

Info

Publication number: CN115353983B
Application number: CN202111003988.3A
Authority: CN
Inventors: 索化夷
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN115353983A

Abstract

本发明公开了鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)ZR21和汉逊德巴利(Debaryomyceshansenii)DH06，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号分别为CCTCCNO：M20211016，CCTCCNO：M20211017；还公开了用于制作豆豉的应用以及一种制作毛霉型速成豆豉的方法。本发明通过实验验证采用鲁氏接合酵母ZR21和汉逊德巴利酵母DH06二次发酵能显著增强速成永川豆豉的豉香、酸香强度，降低酱香、豆味、霉味强度。増香后的速成永川豆豉豉香更强；与传统永川豆豉相比，増香后的速成永川豆豉具有生产成本低、周期短的特征，更有利于永川豆豉工业化生产。

Description

鲁氏接合酵母ZR21和汉逊德巴利酵母DH06及利用其制作速成豆豉的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及鲁氏接合酵母ZR21和汉逊德巴利酵母DH06及利用其制作速成豆豉的方法。

背景技术

豆豉是我国历史悠久的传统发酵豆制品，根据制曲过程中微生物的不同分为曲霉型、毛霉型、细菌型和根霉型四种豆豉。传统永川豆豉是毛霉型豆豉的代表，具有豉香浓郁、乌黑油亮、入口化渣的质地，一直深受消费者的喜爱。但是传统永川豆豉是通过接种空气中的微生物自然发酵，受环境、季节等多种因素的影响大，发酵周期长达一年，不利于工业化生产。利用曲霉制曲和低盐高温发酵技术生产的速成永川豆豉能将后发酵时间缩短为30天左右，大大提高了生产效率。但速成永川豆豉工艺缩短发酵周期的同时也会导致豆豉的香气不足。已有研究表明速成永川豆豉与传统永川豆豉的感官特征和挥发性成分组成均存在明显差异，且传统永川豆豉的挥发性物质的种类与含量均高于速成永川豆豉。因此，提高速成永川豆豉风味物质的种类和含量对解决速成永川豆豉香气不足的问题具有重要意义。

与速成永川豆豉相比，传统永川豆豉在制曲和后发酵过程中具有更丰富的微生物物种组成，其中酵母对传统永川豆豉的风味具有重要作用。嗜盐芳香酵母常用于提高酱油的香气品质，例如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)有利于酱油中酯类、醇类及吡嗪类化合物的产生，赋予甜香、麦芽香的香气特征。此外，多种酵母混合发酵更有利于特征风味物质的增加，鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)与毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)混合发酵能够产生更多的醇类、呋喃酮类、酯类等特征风味物质。因此，后发酵过程中缺失酵母是速成永川豆豉香气不足的重要原因，但目前关于嗜盐芳香酵母对豆豉香气影响的研究还很少。

因此，探寻嗜盐芳香酵母对速成永川豆豉香气的影响，并将具有嗜盐芳香酵母开发为发酵制剂具有广阔的前景，值得进行深入探究。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够显著增加速成豆豉香气的鲁氏接合酵母 ZR21和汉逊德巴利酵母DH06。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种嗜盐芳香酵母，所述嗜盐芳香酵母为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)ZR21 或/和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06，所述ZR21在中国典型培养物保藏中心进行保藏(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCC NO：M 20211016，保藏时间为：2021年8月13日；所述DH06在中国典型培养物保藏中心进行保藏(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCCNO： M 20211017，保藏时间为：2021年8月13日。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含上述的嗜盐芳香酵母。

上述的嗜盐芳香酵母或上述的菌剂，在制备豆豉中的应用。

在所述应用中，所述豆豉为曲霉型速成豆豉。

所述应用为提高速成豆豉的香气。

本发明还提供一种制作増香速成豆豉的方法，包括如下步骤：

1)制作速成豆豉；

2)取制作好的速成豆豉，接种前述的嗜盐芳香酵母或前述的菌剂，5-35℃发酵30-45天。

所述步骤1)制作速成豆豉的方法为米曲霉制曲后高温后发酵技术制备速成豆豉。

所述步骤2)中接种酵母时，接种浓度为10²～10¹⁰cfu/kg，即每一种酵母在单位质量豆豉中的菌落数为10²cfu～10¹⁰cfu。优选接种浓度为10⁵～10⁶cfu/kg。

所述步骤2)中，在不同发酵温度条件下，发酵条件不同，具体如下：在5-10℃的条件下，接种浓度为10⁶cfu/kg，发酵20-45d；在20-35℃条件下，接种浓度为10⁵cfu/kg，发酵15-35d。

本发明的有益效果是：通过实验发现：采用嗜盐芳香酵母鲁氏接合酵母ZR21和汉逊德巴利酵母DH06二次发酵能显著增强速成永川豆豉的豉香、酸香强度，降低酱香、豆味、霉味强度。嗜盐芳香酵母提高了速成永川豆豉中异戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基 -3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、异戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈创木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7种OAV≥1的挥发性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异己酸乙酯、辛酸乙酯、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。因此，添加鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06进行二次发酵可有效提高速成永川豆豉的豉香特征。増香后的速成永川豆豉豉香更强；与传统永川豆豉相比，増香后的速成永川豆豉具有生产成本低、周期短的特征，更有利于永川豆豉工业化生产。

附图说明

图1为豆豉样品主成分分析图(PCA)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。

鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06的保藏信息：将鲁氏接合酵母菌株ZR21于2021年8月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2021年8月13日；保藏编号为CCTCC NO：M 20211016；分类命名为：鲁氏接合酵母ZR21 Zygosaccharomyces rouxii ZR21。

将汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)菌株DH06于2021年8月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2021年8月13日；保藏编号为CCTCC NO：M 20211017；分类命名为：汉逊德巴利酵母DH06 Debaryomyces hansenii DH06。

实施例1分离菌株及鉴定

一、菌株分离

到永川豆豉有限公司进行采样，获得传统永川豆豉(毛霉型)。将取回的传统永川豆豉进行10倍梯度稀释，依次稀释至10^-6。选择4个适宜稀释度(稀释度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6) 分别取100μL涂布在8％NaCl麦芽汁固体平板和8％NaClYPD固体平板上，28℃培养72h后，选取形态各异的单菌落采用平板划线法分离菌株。重复上述步骤直至得到纯化菌株。

将其中一株菌株命名为ZR21，另一株命名为DH06。

二、菌株鉴定试验

采用酵母DNA提取试剂盒提取纯化菌株的DNA。采用25μL反应体系对其ITS rDNA进行PCR扩增，反应结束后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。合格后委托华大基因科技有限公司对PCR扩增产物进行双向测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。

ITS rDNA同源性分析结果显示，ZR21的ITS rDNA基因扩增产物的序列如SEQ IDNo.1 所示，与Gene Bank数据库中已知鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii，Accession number：LN849127.1)的同源性达100％。DH06的ITS rDNA基因扩增产物的序列如SEQ ID No.2所示，与Gene Bank数据库中已知汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii，Accession number：EF643588.1)的同源性达100％。

鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21的ITS rDNA如SEQ ID NO.1所示，

汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06的ITS rDNA如SEQ ID NO.2所示。

实施例2速成永川豆豉二次发酵

1实验材料

速成永川豆豉，采用曲霉制曲、45-65℃发酵20天得到。

2实验方法

2.1增香豆豉发酵

将鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21接种在8％NaCl(m/v)麦芽汁培养基中，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06接种于8％NaCl(m/v)YPD培养基中，置于28℃培养3d。在不同温度(35℃、20℃和10℃)、菌种等比例混合、不同接种浓度(10⁵cfu/kg和10⁶cfu/kg，即单位质量豆豉接入菌体数量为10⁵cfu、10⁶cfu)的条件下二次发酵速成永川豆豉30d、45d具体工艺见下表1。

表1嗜盐芳香酵母发酵速成永川豆豉实验设计

注：1、“L11”中字母代表发酵温度，即“L”、“M”和“H”分别代表低温(10℃)、中温(20℃) 和高温(35℃)；第一个数字表示发酵时间，“1”代表30d，“2”代表45d；第二个数字代表接种浓度，“1”代表低浓度接种(10⁵cfu/kg)，“2”代表高浓度接种(10⁶cfu/kg)。2、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06菌种浓度一致，以1﹕1的比例进行混合发酵。

2.2感官分析

2.2.1样品准备

称取10g豆豉样品盛放在30mL一次性带盖透明塑料杯中，三位随机数字编码。

2.2.2感官评价过程

7名经过培训的感官评价人员通过18种市售豆豉和12种嗜盐芳香酵母发酵豆豉建立豆豉香气描述词。首先感官评价人员独立产生豆豉香气描述词。然后感官评价小组合并意思相近词语，删除含义模糊、带有感情色彩词语，形成一致的豆豉香气描述词及其定义。按照 GB/T29604-2013《感官分析建立感官特性参比样的一般导则》的方法，选择适合中国消费者的产品作为参比样，并对参比样的强度达成共识。

感官评价小组根据建立的豆豉香气描述词对12种嗜盐芳香酵母发酵豆豉和速成永川豆豉的香气进行定量描述分析。每次试验评价3～4个豆豉样品，时长约为1.5h。评价一个样品后，评价人员通过嗅闻温热的湿毛巾缓解嗅觉疲劳，休息五分钟后评价下一个样品。使用以0.5cm为增量的15cm非结构化尺度评价各个感官属性的强度，0表示无，15表示强。

2.3挥发性成分的测定

2.3.1顶空固相微萃取(SPME)

称取3g豆豉样品，粉碎后放入15mL固相微萃取样品瓶中，加入30uL标准品1，3- 二氯苯(10.0ug/mL)，加盖密封。在60℃水浴锅中平衡20min，***CAR/DVB/PDMS萃取纤维，萃取30min，将萃取纤维在GC进样口250℃下解吸5min，进行GC-MS分析。

2.3.2挥发性成分测定

色谱条件：Hp-5非极性毛细管柱；柱初温40℃，以2℃/min的速率升到80℃，保持2min，以2.5℃/min的速率升温到140℃，保持1min，以8℃/min的速率升温到250℃；进样口温度250℃，溶剂延迟5min，不分流；载气为氦气；流量为1.0mL/min。

质谱条件：电子轰击离子源电子；电子能量70eV；电压350V；接口温度230℃；扫描范围25～400u。

2.3.3定性定量方法

定性分析：采用NIST library谱库检索比对进行定性。

定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标物为1，3-二氯苯。含量计算公式：

式中C_i为未知化合物含量，ng/g；S_i为未知化合物峰面积；S为内标物峰面积；C为内标物浓度，ug/mL；V为内标物体积，uL；m为样品质量，g。

2.3.4 OAV的计算

式中C_i为挥发性成分的含量，ng/g；OT_i为挥发性成分在参考文献中的香气阈值，mk/kg。

3结果与分析

3.1豆豉香气特征方差分析

对QDA结果进行单因素方差分析和多重比较分析发现(表2)，与速成永川豆豉相比，嗜盐芳香酵母发酵豆豉的豉香、酸香强度显著增强(p<0.05)，酱香、豆味、霉味强度显著降低(p<0.05)，而在高温、低浓度菌种的条件下发酵30d更有利于其香气特征的变化。

表2豆豉样品定量描述分析(QDA)统计结果

豉香

酱香

鲜香

酒香

酸香

豆味

烟味

甜香

霉味

中药味

Control

5.21±0.65^a

7.79±1.93^e

5.21±1.37^def

4.43±0.73^cd

3.64±0.81^ab

4.86±0.83^cd

4.21±0.75^cdef

3.86±0.64^b

6.21±1.15^e

4.71±0.70^cd

M11

7.04±1.13^def

7.29±0.80^de

4.50±0.60^abcd

4.11±0.54^bcd

3.79±0.56^abc

3.54±0.48^ab

4.54±0.48^defg

3.43±0.49^ab

4.29±0.59^abc

4.04±0.55^b

M12

6.21±0.99^bc

6.71±0.90^bcd

4.07±0.59^ab

3.93±0.59^abc

3.43±0.56^a

3.79±0.41^ab

4.86±0.74^g

3.36±0.48^ab

3.96±0.55^a

3.86±0.61^ab

M21

6.36±0.61^bcd

6.93±0.70^cde

4.86±0.99^bcde

3.93±0.82^abc

4.14±0.83^bcd

3.43±0.49^a

3.64±0.61^abc

3.64±0.44^ab

4.21±1.10^ab

3.43±0.49^a

M22

5.96±0.61^bc

5.89±0.66^ab

4.21±0.56^ab

4.61±0.66^de

3.64±0.48^ab

3.61±0.43^ab

4.64±0.52^fg

3.57±0.53^ab

4.68±0.82^abc

4.29±0.31^bc

L11

5.71±0.72^ab

7.00±0.65^cde

4.39±0.85^abcd

3.36±0.48^a

3.68±0.52^ab

4.18±0.59^abc

3.46±0.57^ab

3.50±0.50^ab

4.00±1.07^a

4.14±0.72^b

L12

6.25±0.53^bc

7.21±0.77^de

3.96±0.13^a

3.39±0.60^a

3.68±0.52^ab

4.07±0.73^ab

3.93±0.78^bcd

3.36±0.44^ab

5.00±0.60^cd

4.29±0.52^bc

L21

6.11±0.71^bc

5.96±0.30^ab

3.64±0.79^a

3.79±0.41^ab

4.14±0.61^bcd

3.75±0.49^ab

3.93±0.62^bcd

3.32±0.45^a

4.39±0.47^abc

3.79±0.36^ab

L22

6.61±0.63^cde

5.68±0.55^a

4.32±1.13^abc

3.71±1.41^ab

4.32±0.55^cd

3.71±0.56^ab

4.00±0.65^bcde

3.32±0.45^a

4.36±0.72^abc

4.00±0.38^b

H11

7.64±0.72^f

7.86±1.20^e

6.43±0.84^g

5.21±0.67^e

4.43±0.90^d

5.79±1.01^e

3.79±1.15^bc

4.39±0.71^c

5.54±0.85^d

4.71±0.88^cd

H12

7.21±1.82^ef

7.43±1.80^de

5.14±1.92^cdef

5.21±1.06^e

3.29±0.80^a

5.29±1.79^de

4.57±0.49^efg

3.43±0.65^ab

4.21±0.56^ab

4.71±0.59^cd

H21

7.29±0.86^ef

6.25±1.03^abc

5.50±0.85^ef

5.07±0.88^e

3.86±0.65^abc

4.86±1.06^cd

3.11±0.60^a

3.36±0.58^ab

4.89±0.89^bcd

3.82±0.84^ab

H22

6.14±0.89^bc

6.64±1.11^bcd

5.93±0.80^fg

5.14±1.19^e

4.61±0.47^d

4.21±0.99^bc

4.50±0.73^defg

3.82±0.79^ab

5.50±1.12^d

4.96±0.90^d

注：同一行不同字母表示在p<0.05水平上具有显著差异。

3.2豆豉香气特征分析

对QDA法的结果进行PCA分析，如图1所示，嗜盐芳香酵母发酵豆豉均与速成永川豆豉发生偏离。与高温发酵豆豉相比，嗜盐芳香酵母在中温和低温条件下发酵的豆豉香气特征更相似，可能是由于高温条件下细菌活性增强，酵母发酵受到一定抑制；但低温发酵需要更高的菌种浓度，可能是由于低温条件下酵母活性较低。与发酵30d相比，嗜盐芳香酵母发酵 45d更有利于香气特征变化。

3.3豆豉挥发性成分分析

挥发性成分是评价豆豉香气的重要指标。本实验通过SPME-GC-MS共检测出64种挥发性成分(表3)，包括9种酸类，9种醛类，12种酯类，5种酮类，3种醇类，4种酚类，9 种吡嗪类，2种呋喃类，9种烃类，2种其他。由此看出，豆豉挥发性成分主要由酸类、醛类、酯类、吡嗪类和烃类物质构成。与速成永川豆豉相比，嗜盐芳香酵母发酵豆豉的酸类、醛类、酯类、酮类、醇类、吡嗪类、呋喃类及其他挥发性成分含量整体呈增加趋势，大多烃类物质含量呈减少趋势。

表3豆豉样品中挥发性成分含量

注：“-”表示未检测出。

3.4豆豉香气活性物质分析

一般认定，当挥发性化合物的OAV≥1时对食品香气具有一定贡献作用，且OAV越大，其贡献作用越大。速成永川豆豉共有6种OAV≥1的挥发性成分，而嗜盐芳香酵母发酵的豆豉则有7～12种。通过表4，发现嗜盐芳香酵母提高了速成永川豆豉中异戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、异戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈创木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7种OAV≥1的挥发性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异己酸乙酯、辛酸乙酯、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。

表4豆豉样品中鉴定出的香气活性成分的香气活性值

注：“-”表示未检测出。

序列表

<110> 西南大学

<120> 鲁氏接合酵母ZR21和汉逊德巴利酵母DH06及利用其制作速成豆豉的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 677

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggagggag atctcctgat ttgaggtcaa ctttgagaat tttgtctagc cagacggctt 60

accttagaat aaaaaaaaaa gaaacctctc cactattccg ccgagtcggt aaaacctaat 120

acgacttttc gtggctaggc cgctcccatg cctctcggca cagtcgcaaa ctaagctccg 180

cctatggcct cccactttca agcaaactca aaaagagtat cgctcactac caaacataaa 240

cataaaagct atgtttgaga gggaaatgac gctcaaacag gcatgccccc tggaatacca 300

aggggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat gattcacgga attctgcaat tcacattacg 360

tatcgcagtt cgctgcgttc ttcatcgatg cgagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt 420

ttgaatattt tgttttaatt cgtttttgac tttttataat ttcataaaaa tgttgtttgt 480

gtttacctct ggggacagac gcctttaaaa gcacttcccc aaagagaaca aaaaagcaga 540

aactccactg tgtgtatcaa aggcggaggg taaatcaagc cgcgcaatta agcgcaggct 600

cttccccccc cccactcctt caaaatttcc ttttccaata aggaccctcc ccaaggcccc 660

ccccctcggg gaggggg 677

<210> 2

<211> 664

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcccctcgg tatgggggac ctgcggaagg atcattacag tattcttttt gccagcgctt 60

aattgcgcgg cgaaaaaacc ttacacacag tgttttttgt tattacaaga acttttgctt 120

tggtctggac tagaaatagt ttgggccaga ggtttactga actaaacttc aatatttata 180

ttgaattgtt atttatttaa ttgtcaattt gttgattaaa ttcaaaaaat cttcaaaact 240

ttcaacaacg gatctcttgg ttctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 300

atatgaattg cagattttcg tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccctctggt 360

attccagagg gcatgcctgt ttgagcgtca tttctctctc aaaccttcgg gtttggtatt 420

gagtgatact cttagtcgaa ctaggcgttt gcttgaaatg tattggcatg agtggtactg 480

gatagtgcta tatgactttc aatgtattag gtttatccaa ctcgttgaat agtttaatgg 540

tatatttctc ggtattctag gctcggcctt acaatataac aaacaagttt gacctcaaat 600

caggtaggat tacccgctga acttaagcat atcataaagc gggaggaagg gaaacttacc 660

ggta 664

Claims

1. 一种嗜盐芳香酵母，其特征在于：所述嗜盐芳香酵母为鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）ZR21或/和汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）DH06，所述ZR21在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211016 ，所述DH06在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211017。

2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂包含权利要求1所述的酵母。

3.权利要求1所述的酵母或权利要求2所述的菌剂在制备豆豉中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述豆豉为曲霉型速成豆豉。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为提高速成豆豉的香气。

6.一种制作増香速成豆豉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制作速成豆豉；

2）取制作好的速成豆豉，接种权利要求1所述的酵母或权利要求2所述的菌

剂，5-35℃发酵30-45天。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1）制作速成豆豉的方法为米曲霉制曲后高温后发酵技术制备速成豆豉。

8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中接种酵母时，接种浓度为10²～10¹⁰cfu/kg，即每一种酵母在单位质量豆豉中的菌落数为10²cfu～10¹⁰cfu。

9. 如权利要求7至8任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，在不同发酵温度条件下，发酵条件不同，具体如下：在5-10 ℃的条件下，接种浓度为10⁶ cfu/kg，发酵20-45d；在20-35 ℃条件下，接种浓度为10⁵cfu/kg，发酵15-35 d。