CN115335335A - 废水处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含呋喃化合物的废水的处理方法，用于该方法的微生物制剂，上述方法中使用的微生物的高密度培养方法，以及使用所述培养方法制备微生物制剂的方法。
Description
相关申请
本说明书要求日本专利申请No.2020-052011(2020年3月24日提交)和日本专利申请No.2021-031309(2021年3月1日提交)的优先权，其内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及一种处理包含呋喃化合物的废水的方法、该方法中使用的微生物制剂、上述方法中使用的微生物的高密度培养方法以及通过使用该培养方法生产微生物制剂的方法。
背景技术
呋喃化合物是指以糠醛、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、呋喃、二氢呋喃、糠醇、四氢呋喃、四氢糠醇和羟甲基糠醛为代表的环状醚化合物，它们是有用的石油化学衍生物。到目前为止，呋喃化合物已经从石油中生产出来。然而，近年来，随着对环境问题的日益关注，已经研究了从生物质资源(作为原料)生产呋喃化合物。
在呋喃化合物的生产过程中产生的废水中包含呋喃醛，如糠醛和四氢糠醛。在呋喃化合物当中，特别是，已知呋喃-醛抑制微生物的增殖和代谢，并且对活性污泥具有高毒性。因此，难以对呋喃-醛进行生物处理。由于许多国家的废水法规规定的值非常严格，因此需要开发有效处理包含呋喃化合物的废水的技术。
最近，发现了特异性降解呋喃化合物的微生物，并且报道了使用该微生物处理呋喃化合物的生物学方法(专利文献1和2、非专利文献1)。
专利文献1公开了通过真菌拟青霉属(Paecilomyces sp.)FA13菌株降解羟甲基糠醛和糠醛的方法。然而，这种方法的使用仅限于堆肥的生产。此外，考虑到环境负担和能源成本，该方法不适合处理包含大量呋喃化合物的废水。专利文献2公开了通过使用假诺卡氏菌属(Pseudonocardia sp.)RM31菌株降解包含呋喃的环状醚化合物的方法。该方法对于降低废水中1,4-二噁烷的量是有效的，但是对于呋喃化合物无效。
目前，微生物不仅用于处理废水，还用于各种目的。例如，通过微生物产生的酶用于生产化合物，并且微生物作为土壤调节剂在作物收获后添加至土壤中。
对于这些应用，在某些情况下，需要大量微生物。因此，期望以高密度(高浓度)培养微生物的技术(参照专利文献3、4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开No.2016-67288
专利文献2：日本专利特开No.2017-42097
专利文献3：日本专利特开No.2019-30292
专利文献4：日本专利特开No.H4-234981
非专利文献
非专利文献1：Wierckx et al.,Appl Microbiol Biotechnol(2011)92：1095-1105
发明内容
发明要解决的问题
本发明的第一个目的是提供一种有效处理包含呋喃化合物的废水的新方法。本发明的第二个目的是提供一种以高浓度培养微生物以获得大量用于例如废水处理的微生物。
用于解决问题的方案
考虑到现有技术的问题，本发明人进行了深入研究，结果发现，在包含呋喃化合物的废水的生物处理中，使废水与用于降解的具有羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性的微生物接触，从而可以有效地处理废水，同时防止例如活性污泥等的活性降低。基于该发现，完成了本发明。
更具体地，本发明提供以下[1]至[21]。
[1]一种用于处理包含呋喃化合物的废水的微生物制剂，该微生物制剂包含选自属于丛毛单胞菌属(genus Commamonas)的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属(genusBurkholderia)的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属(genus Paraburkholderia)的微生物和属于假单胞菌属(genus Pseudomonas)的微生物中的至少一种。
[2]根据[1]所述的微生物制剂，其中属于丛毛单胞菌属的微生物为***丛毛单胞菌(Commamonas testosteroni)和/或氧化硫丛毛单胞菌(Commamonas thiooxydans)；属于伯克霍尔德氏菌属的微生物为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)；属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物为异食副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderiaxenovorans)；和属于假单胞菌属的微生物为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。
[3]根据[1]或[2]所述的微生物制剂，其中呋喃化合物为呋喃醛。
[4]一种废水处理方法，其包括：使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触的步骤。
[5]根据[4]所述的废水处理方法，其中属于丛毛单胞菌属的微生物为***丛毛单胞菌和/或氧化硫丛毛单胞菌；属于伯克霍尔德氏菌属的微生物为多噬伯克霍尔德氏菌；属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物为异食副伯克霍尔德氏菌；属于假单胞菌属的微生物为恶臭假单胞菌或栖稻假单胞菌。
[6]根据[4]或[5]所述的废水处理方法，其中呋喃化合物为呋喃醛。
[7]一种废水处理方法，其包括：在膜分离器的存在下，使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触的步骤。
[8]一种废水处理方法，其包括以下步骤：
(1)使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触；和
(2)使步骤(1)中获得的废水与选自活性炭、芬顿催化剂(Fenton's catalyst)和多环芳香族降解酶中的至少一种接触。
[9]根据[4]至[8]中任一项所述的废水处理方法，其中获得的废水的CODcr值为500ppm以下。
[10]一种培养属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物的方法，其包括在包含葡萄糖酸的培养基中培养微生物的步骤。
[11]一种培养属于丛毛单胞菌属的微生物的方法，其包括：在包含选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种的培养基中培养微生物的步骤。
[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中包含微生物的培养基在培养开始24小时后在660nm的波长下的光学密度为15以上。
[13]根据[10]或[11]所述的方法，其中包含微生物的培养基在培养开始48小时后在660nm的波长下的光学密度为20以上。
[14]根据[10]至[13]中任一项所述的方法，其中培养基中存在的葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸全部具有10g/L以下的浓度。
[15]根据[10]至[14]中任一项所述的方法，其中微生物的增殖速度基于微生物细胞的干重为0.2g/L/hr以上。
[16]根据[10]至[15]中任一项所述的方法，其中依照流加培养进行培养。
[17]根据[10]至[16]中任一项所述的方法，其包括：使包含90％(v/v)以上的氧气的气体通过培养液的步骤。
[18]根据[17]所述的方法，其中气体以6至5vvm的通气量通过。
[19]一种根据[1]至[3]中任一项所述的微生物制剂的生产方法，其包括：将包含通过根据[10]至[18]中任一项所述的方法获得的微生物和基于微生物的干重为1至10倍的量的冷冻保护剂的组合物冷冻干燥的步骤。
[20]根据[19]所述的方法，其中冷冻保护剂为选自海藻糖、脱脂乳和谷氨酸中的至少一种。
[21]一种根据[1]至[3]中任一项所述的微生物制剂，其通过根据[19]或[20]所述的方法来生产。
发明的效果
根据本发明，可以在抑制例如活性污泥的效力降低的同时，有效地降解废水中包含的呋喃化合物。根据本发明，不仅可以降解呋喃化合物，而且可以降解废水中包含的包括如甲酸和乙酸等酸组分、和如木糖等糖类的其它组分。此外，如果在微生物处理后以组合进行用活性炭、芬顿催化剂和多环芳香族降解酶处理，可以降低废水的CODcr值，并且可以实现满足对废水的严格规定的废水处理。本发明允许高密度培养在废水处理中使用的属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物。因此，可以在短时间内大量获得微生物。
附图说明
[图1]示出通过***丛毛单胞菌NBRC12047菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图2]示出通过氧化硫丛毛单胞菌NBRC 110656菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图3]示出通过异食副伯克霍尔德氏菌DSM17367菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图4]示出通过恶臭假单胞菌NBRC3738菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图5]示出当使用膜分离器时，通过***丛毛单胞菌NBRC12047菌株的处理水的CODcr去除率的经时变化。纵轴表示CODcr去除率％(处理水/原水)，和横轴表示天数。
[图6]示出通过多噬伯克霍尔德氏菌NBRC102086菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图7]示出通过卡莱多尼亚副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia caledonica)NBRC102488菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
[图8]示出通过栖稻假单胞菌NBRC102199菌株的糠醛、甲酸和乙酸的降解(48小时的浓度变化)。纵轴表示浓度[g/L]和横轴表示时间[h](点线：▲(FRL：糠醛)，实线：◆(FA：甲酸)，虚线：■(ACE：乙酸))。
具体实施方式
1.废水处理方法
本发明涉及对包含呋喃化合物的废水生物学处理的方法，其特征在于，使废水与具有羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性的微生物接触。
(1)要进行处理的废水
在本发明中，要处理的废水为包含呋喃化合物的废水。废水的产生来源没有限制，只要废水包含呋喃化合物即可。废水的实例包括从由石油原料生产呋喃化合物的步骤排出的废水和从来自由生物质提取的C5糖类(甘蔗渣，即甘蔗榨汁后的残渣)生产糠醛的步骤排出的废水。
废水中不仅会包含呋喃化合物，而且还会包含如甲酸、乙酸、和乳酸等酸，和如木糖等糖的组分。从由生物质生产呋喃化合物的工序排出的废水中也包含如酸和糖等这些组分，与呋喃化合物同样地，难以生物学处理废水。因此，优选从废水中去除这些组分(酸和糖)。
根据需要，可以在微生物处理之前预先处理废水。例如，如果废水由于酸性组分的含量多而呈酸性，则可以添加碱组分以将废水的pH调节为5至9，优选5.5至8.5，更优选6至8。对所使用的碱组分没有限制，例如可以使用固态或液态的NaOH或KOH。
(2)呋喃化合物
呋喃化合物是指具有呋喃骨架的化合物，如糠醛、羟甲基糠醛、2-甲基呋喃、3-甲基呋喃、呋喃、二氢呋喃、糠醇、四氢呋喃和四氢糠醇。在本发明中，对要处理的呋喃化合物没有特别限制。对微生物和活性污泥具有高毒性的如糠醛和四氢糠醛等呋喃醛是特别期望的处理(降解)目标。
(3)用于废水处理的微生物
本发明中使用的微生物为“具有羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性的微生物”。“羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性”是指将羟甲基糠醛和/或糠醛氧化以将它们转化成相应的羧酸的酶的活性。更具体地，该酶将羟甲基糠醛(也称为5-羟甲基糠醛)氧化为5-甲酰基-2-糠酸，进一步氧化为2,5-呋喃二甲酸；并且将糠醛氧化为2-糠酸。
羟甲基糠醛的降解，换言之，羟甲基糠醛氧化成5-甲酰基-2-糠酸并进一步氧化成2,5-呋喃二羧酸，可以通过本技术领域公知的手段例如HPLC来检查。类似地，糠醛的降解，换言之，糠醛氧化成2-糠酸，可以通过HPLC(本技术领域公知的手段)。
微生物的实例包括属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物。微生物可以单独使用或者以组合(两种以上)使用。
作为属于丛毛单胞菌属的微生物，例如，食酸丛毛单胞菌(Commamonasacidovorans)、堆肥丛毛单胞菌(Commamonas composti)、广东丛毛单胞菌(Commamonasguangdongensis)、土丛毛单胞菌(Commamonas terrae)、***丛毛单胞菌和氧化硫丛毛单胞菌是优选的。其中，***丛毛单胞菌和氧化硫丛毛单胞菌是更优选的，并且***丛毛单胞菌是特别优选的。
可以使用的***丛毛单胞菌的实例包括，但不限于，NBRC 12047菌株、NBRC12048菌株、NBRC 14951T菌株、NBRC 100989菌株、NBRC 109938菌株、NBRC 110673菌株、ATCC 700441菌株、ATCC 13474菌株、ATCC 700441D-5菌株、ATCC 55744菌株、ATCC 49249菌株、ATCC 33083菌株、ATCC 17510菌株、ATCC 17409菌株、ATCC 15666菌株、ATCC 15667菌株、ATCC 39523菌株、ATCC 53716菌株、ATCC 25094菌株、TA441菌株和TK102菌株。
可以使用的氧化硫丛毛单胞菌的实例包括，但不限于，NBRC 110656菌株、S23菌株和CNB-1菌株。
作为属于伯克霍尔德氏菌属的微生物，例如，越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)、广泛伯克霍尔德氏菌(Burkholderia lata)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)、多噬伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、欺瞒伯克霍尔德氏菌(Burkholderia dolosa)、吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、污染伯克霍尔德氏菌(Burkholderia contaminans)、乌汶伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaubonensis)、广布伯克霍尔德氏菌(Burkholderia diffusa)、隐蔽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia latens)、领地伯克霍尔德氏菌(Burkholderia territorii)、种子伯克霍尔德氏菌(Burkholderia seminalis)、假多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomultivorans)、金属伯克霍尔德氏菌(Burkholderia metallica)、礁湖伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stagnalis)、稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)、颖壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagladioli)、共生伯克霍尔德氏菌(Burkholderia insecticola)和植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderia plantarii)是优选的。其中，多噬伯克霍尔德氏菌是更优选的。
可以使用的多噬伯克霍尔德氏菌的实例包括，但不限于，NBRC 102086菌株、ATCC17616D-5菌株、ATCC 17616菌株和ATCC BAA-247菌株。
作为属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物，例如，异食副伯克霍尔德氏菌、吩嗪副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia phymatum)、吩里拉普副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia phenoliruptrix)、吩里拉普副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderiaphenoliruptrix)、葡萄藤副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia phytofirmans)、真菌副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia fungorum)、加勒比群岛副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia caribensis)、灵芝副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderiasprentiae)、噬芳烃副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia aromaticivorans)、赫氏副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia hospita)、土地副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderiaterrae)、草类副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia graminis)、卡莱多尼亚副伯克霍尔德氏菌和栖土副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia terricola)是优选的。其中，异食副伯克霍尔德氏菌是更优选的。
可以使用的异食副伯克霍尔德氏菌的实例包括，但不限于，DSM 17367菌株和LB400菌株。
作为属于假单胞菌属的微生物，例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、香矛醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)、恶臭假单胞菌、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、土壤假单胞菌(Pseudomonas soli)、香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、栖稻假单胞菌、丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae)、沙氏极毛杆菌(Pseudomonas savastanoi)、扁桃假单胞菌(Pseudomonasamygdali)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、榛黄假单胞菌(Pseudomonasavellanae)、防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、草假单胞菌(Pseudomonas poae)、产黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha)、孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)、平凡假单胞菌(Pseudomonastrivialis)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)、威隆假单胞菌(Pseudomonasveronii)、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、东方假单胞菌(Pseudomonasorientalis)、猿猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)、浅黄色假单胞菌(Pseudomonaslurida)、喜昆虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)、油菜假单胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)、克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)、绿叶假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)、烷基假单胞菌(Pseudomonas alkylphenolica)、根际假单胞菌(Pseudomonas rhizosphaerae)、Pseudomonas cremoricolorata、副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva)、Pseudomonas versuta、韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)、南极假单胞菌(Pseudomonas antarctica)、耐冷假单胞菌(Pseudomonas psychrotolerans)、丝状假单胞菌(Pseudomonas silesiensis)、雅马纳假单胞菌(Pseudomonas yamanorum)、克氏假单胞菌(Pseudomonas kribbensis)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)、Pseudomonas deceptionensis、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)、孔雀尾假单胞菌(Pseudomonas pavonaceae)和***假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)是优选的。其中，恶臭假单胞菌和***假单胞菌是更优选的。
可以使用的恶臭假单胞菌的实例包括，但不限于，ATCC 3738菌株、ATCC 12653菌株、ATCC 12668菌株、ATCC 12996菌株、ATCC 13696菌株、ATCC 14164T菌株、ATCC 14671菌株、ATCC 14796菌株、ATCC 15366菌株、ATCC 100650菌株、ATCC 100651菌株、ATCC 100988菌株、ATCC 101019菌株、ATCC 101020菌株、ATCC 102090菌株、ATCC 102092菌株、ATCC102093菌株、ATCC 109109菌株、ATCC 109110菌株、ATCC 109347菌株、ATCC 109348菌株、ATCC 109349菌株、ATCC 109350菌株、ATCC 110474菌株、ATCC 110475菌株、ATCC 110476菌株、ATCC 110477菌株、ATCC 110482菌株、ATCC 110654菌株、ATCC 110666菌株和ATCC110667菌株。
作为微生物，例如，可以使用从ATCC(美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection))和NBRC(NITE生物资源中心(Biological Resource Center))可得的微生物，或者可以使用从例如土壤和废水中收集的微生物；并且可选择地，作为微生物，可以使用野生型微生物或转基因微生物。
(4)废水的处理方法
(4-1)微生物处理
废水可以通过使废水与如上所述的微生物彼此接触来处理。作为使废水与微生物彼此接触的方法，尽管没有特别限定，但是可以将微生物添加至废水中，或者可以将废水添加至微生物中。
可以在连续或间歇***中进行用微生物的废水处理(反应)。本领域技术人员可以根据废水的量和种类来适当地选择该***。
对微生物的添加量没有限制，可以根据例如待处理废水的量和品质等适当设定。微生物可以在反应开始时一次性添加或多次添加。
当多次添加微生物时，可以在监控例如废水的处理速度的同时，以一定的间隔或适当的时机添加微生物。
对用微生物处理的时间(使微生物与废水彼此接触的时间)没有特别限制。可以继续处理直到要降解的化合物的量减少到检测限以下。
对用微生物处理的废水的温度没有限制，只要可以有效地进行微生物处理即可。废水的温度可以为例如15至60℃，优选20至50℃，更优选25至45℃。
待处理废水的pH值可以适当设定，以有效地进行微生物处理。
(4-2)膜分离器的使用
在本发明的废水处理方法中，可以(以组合)使用膜分离法。膜分离法是指通过使用分离膜(在膜分离器的存在下)分离用微生物处理的水(处理水)的方法。在膜分离方法中，提及膜生物反应器(MBR)作为本发明的优选实施方案。MBR是一种其中处理后的水和活性污泥通过微滤膜(MF膜)或超滤膜(UF膜)分离的活性污泥工艺。如果用具有羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性的微生物处理废水，则可以在抑制活性污泥劣化的同时降解废水中的呋喃化合物，实现高效的废水处理。
在本发明中，膜分离器可以放置在用于废水的微生物处理的槽中或放置在不同的槽中。与微生物处理槽不同的槽中的膜分离可以通过引入待处理水来进行。作为不同的槽，可以设置多个槽。如果在膜分离器的存在下进行微生物处理，则可以提高微生物反应的效率。结果，可以减少废水处理所需的微生物的量和处理(反应)时间。
对用于本发明的膜分离器的种型和尺寸没有特别限制并且可以根据例如废水处理设施的尺寸和废水的体积来适当地选择。
作为膜分离器中使用的分离膜的种类，微滤膜(MF膜)或超滤膜(UF膜)是优选的。
如果按形状分类，则分离膜的实例包括中空纤维膜、平膜、管状膜和袋状膜。其中，优选中空纤维膜，因为如果基于体积进行比较，则可以在单位面积的膜上积累大量物质。
用于分离膜的材料的实例包括有机材料(例如，纤维素，乙酰纤维素，如聚乙烯和聚丙烯等聚烯烃，芳香族聚酰胺，聚砜，聚乙烯醇，聚甲基丙烯酸甲酯，聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚丙烯腈，聚碳酸酯和聚四氟乙烯)、金属(例如不锈钢)和无机材料(例如陶瓷)。分离膜的材料根据废水的性质而适当地选择。
分离膜的孔径可以根据处理的目的而适当地选择。在后述的膜生物反应器(MBR)中，分离膜的孔径通常优选为0.001至3μm。如果孔径小于0.001μm，则膜的电阻可能高。如果孔径超过3μm，则污泥不能完全分离，结果，处理水(渗透)的品质会劣化。分离膜的孔径更优选在微滤膜的(孔径的)范围内，即，0.04至1.0μm。
在本发明中，膜分离器可以是由商购可得的分离膜制成的分离器或商购可得的膜分离器。可以使用例如，使用由Mitsubishi Chemical Corporation制造的中空纤维膜SADF(商标名“Sterapore SADF TM”)的模块和用于膜生物反应器的装置DiaFellow(TM)AM(由Mitsubishi Chemical Corporation制造)。在本发明的废水处理方法中，可以在废水处理设施中设置单个或多个膜分离器。
当使用膜分离器时，对曝气量没有特别限制，且可以根据废水的量和品质、以及要使用的微生物种类来适当选择。
(4-3)一次处理
在本发明中，从废水中除去固体物质的处理(以下称为“一次处理”)可以在微生物处理之前进行。例如，可以提及通过网筛或棒去除例如大碎片的处理(筛选)，通过在沉淀池中沉淀来去除沙子的处理，以及通过在初级沉淀池中沉淀来去除污泥的处理。
(4-4)二次处理
在本发明中，可以进行通过例如活性污泥中的微生物除去废水中的有机物的处理(以下，称为“二次处理”)。
(4-5)三次处理
在本发明中，如果存在通过微生物处理未去除的化合物，则可以在微生物处理后进行进一步处理(以下称为“三次处理”)以去除该化合物。如果组合使用三次处理，则可以提高废水的品质，并且可以进一步降低CODcr值(后述)。
对三次处理的种类没有特别限制，并且可以根据例如废水的种类和通过微生物处理未去除的化合物的种类而适当地选择。例如，可以提及用活性炭的处理、用芬顿催化剂的处理和用多环芳香族氧化催化剂的处理。
(4-3-1)活性炭处理
活性炭可以通过吸附从废水中去除不能通过微生物处理去除的化合物。作为所使用的活性炭，如石油沥青、煤、和焦炭等矿物材料；和通过碳化(热处理)或热处理后活化而从包括木材和椰子壳的果壳等植物材料获得的材料是优选的。可以使用用于液相的商购可得的活性炭。
对通过活性炭的处理方法没有特别限制。例如，如柱等管状容器装有活性炭。然后，将待处理的废水供给(通过)至容器(活性炭吸附塔)中，结果，可以进行通过活性炭的处理。对通过活性炭吸附塔的水的空速(SV)没有特别限制，可以根据例如废水中所包含的组分对活性炭的吸附亲和性和吸附量、处理水期望的水品质和废水品质值来适当确定。例如，在活性炭很少吸附组分的情况下(吸附量低)或在对废水的水品质要求严格的情况下，可以通过降低SV来延长待处理水(废水)与活性炭的接触时间。
(4-3-2)芬顿催化剂处理
过氧化氢与亚铁离子(铁催化剂)生成羟基自由基的反应称为芬顿反应。羟基自由基具有强的氧化能力，可以通过利用氧化能力可以对有害物质和持久性污染物质进行降解杀菌。芬顿催化剂是用于芬顿反应的铁催化剂。芬顿催化剂可用于用羟基自由基降解不能用微生物处理的化合物，以从废水中去除化合物。
对用作芬顿催化剂的铁催化剂没有特别限制，只要其溶解在水中以产生亚铁离子即可。例如，亚铁盐或亚铁氧化铁是优选的。其中，硫酸铁或氯化铁是(更)优选的，因为不需要对其进行控制以满足排放标准并且具有优异的溶解性。
对使用芬顿催化剂的处理方法没有特别限制，只要可以降解目标化合物即可。例如，根据需要在搅拌废水的同时将铁试剂添加在待处理的废水中，然后，添加过氧化氢使其反应。铁试剂和过氧化氢的添加量，添加两个组分后的反应时间，可以根据例如，待处理的废水中所包含的化合物的种类和废水的量而适当地选择。
(4-3-3)用多环芳香族降解酶处理
多环芳香族降解酶降解不能用微生物处理的难降解性多环芳香族，并将其从废水中去除。尽管对多环芳香族降解酶的种类没有特别限制，但优选具有在过氧化氢的存在下使如腐殖质等持久性多环芳香族氧化或聚合的催化活性的多环芳香族降解酶。多环芳香族降解酶的实例包括过氧化物酶和漆酶。
作为过氧化物酶，适合使用源自辣根(Armorica rusticana)的过氧化物酶。作为漆酶，适合使用源自例如变色栓菌(Trametes versicolor)、漆树(Rhus vernicifera)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或曲霉属(Aspergillus sp.)的漆酶。
对用多环芳香族降解酶的处理方法没有限制。酶可以添加至待处理的废水中，或者可以固定在单个物体上并使用。多环芳香族降解酶对废水的添加量根据废水的种类或量适当设定。添加量例如为0.1至300ppm，优选0.5至200ppm，更优选1至100ppm。对用多环芳香族降解酶的处理时间没有特别限制，可以根据例如废水的量和品质、以及使用的酶的种类和品质等适当设定。
(5)本发明中获得的废水
根据本发明，可以有效地降解废水中所包含的呋喃化合物。不仅呋喃化合物，而且包括如甲酸和乙酸等酸以及如木糖等糖的组分也可以得到有效地降解。
另外，用微生物处理后的废水进一步用例如活性炭、芬顿催化剂或多环芳香族降解酶处理(三次处理)，这使得去除不能通过微生物处理而去除的物质，从而获得更高品质的废水。
作为水品质指标，通常使用COD(化学需氧量)和BOD(生物需氧量)。COD表示氧化水中可氧化物质的量所需的氧气量；而BOD表示氧化可生物降解的有机物(单独)所需的氧气量。COD根据测量方法而变化，并且包括通过使用重铬酸钾作为氧化剂测量的CODcr；通过使用高锰酸钾作为氧化剂而测得的CODMn；和通过使用碱性高锰酸钾而测得的CODOH。
在通过由本发明的方法处理废水而获得的废水中，不仅呋喃化合物，而且如甲酸和乙酸等酸和如木糖等糖的组分也被降解。因此，可以获得符合废水规定的高品质废水(处理水)。通过本发明的方法获得的废水的CODcr值为500ppm，优选小于120ppm，这满足对废水的严格规定。
2.废水处理用微生物制剂
本发明提供用于上述废水处理方法的微生物制剂。尽管对呋喃化合物没有特别限制，但是作为处理(降解)对象，例如，对微生物和活性污泥具有高毒性的如糠醛和四氢糠醛等呋喃醛是特别期望的。
本发明的微生物制剂可以为液体(悬浮液)或固体。当微生物制剂以液态使用时，可以直接使用培养至期望密度的微生物，或者可以将通过向培养的微生物中添加如防腐剂和稳定剂等添加剂制备的混合物用作微生物制剂。可选择地，可以使用通过将微生物培养至期望的密度，并且根据需要，将其分离、洗涤、纯化和浓缩而制备的微生物制剂，或通过将上述制备的微生物进一步悬浮于包括例如缓冲溶液的水溶液中而制备的微生物制剂。
当微生物制剂以固态使用时，在将微生物培养至期望密度后，根据需要，向其中添加例如海藻糖、谷氨酸钠或脱脂乳作为冷冻干燥保护剂，然后，冷冻干燥。冷冻干燥微生物细胞可以直接作为微生物制剂使用，或者可以将冷冻干燥微生物细胞与各种添加剂的混合物用作微生物制剂使用。
本发明的微生物制剂包含选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种作为有效成分。微生物具有羟甲基糠醛和/或糠醛氧化酶活性。
上述微生物的实例与第1(3)部分中所述的相同。其中，属于丛毛单胞菌属的微生物优选为***丛毛单胞菌和氧化硫丛毛单胞菌；属于伯克霍尔德氏菌属的微生物优选为多噬伯克霍尔德氏菌；属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物优选为异食副伯克霍尔德氏菌；和属于假单胞菌属的微生物优选为恶臭假单胞菌。
本发明的微生物制剂包含如上所述的微生物和维持该微生物所需的组分，且通过将其添加至活性污泥中而使用。可选择地，本发明的微生物与现有的活性污泥混合并且用作微生物制剂。
3.用于降解呋喃化合物的微生物制剂
本发明提供一种用于降解如上所述的呋喃化合物的微生物制剂。尽管对目标呋喃化合物没有特别限制，但优选如糠醛、四氢糠醛等呋喃醛。
本发明的用于降解呋喃化合物的微生物制剂包含***丛毛单胞菌、氧化硫丛毛单胞菌和异食副伯克霍尔德氏菌中的至少一种和维持该微生物所需的组分并且用于呋喃化合物的降解。
4.微生物用于废水处理或呋喃化合物的降解的使用。
本发明提供如第1(3)部分所述的微生物在处理包含呋喃化合物的废水或呋喃化合物的降解中的使用。微生物的使用可以按照第1部分的说明进行。
5.微生物的培养方法
本发明提供以高密度培养属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物的方法。
如本文所用，“以高密度培养”或“高密度培养”是指以高密度培养微生物。尽管没有特别限制，但是“高浓度(高密度)”是指在培养开始后24小时的时间点，包含微生物的培养基在660nm的波长处的光学密度(OD660)为，例如，15以上，优选16以上，更优选18以上，进一步优选20以上。可选择地，“高浓度(高密度)”是指在培养开始后48小时的时间点，包含微生物的培养基在660nm的波长处的光学密度(OD660)为例如20以上，优选21以上，更优选22以上，进一步优选23以上，特别优选25以上。
密度(OD660)可以通过稀释培养液，然后使用紫外-可见分光光度计(UV-1280Shimadzu Corporation)来测量。
本发明的培养方法提高了微生物的增殖速度，因此能够进行如上所述的高密度培养。
微生物的增殖速度可以通过如直接显微镜观察、平板培养法、比浊测量法、和重量测量法等常用方法来测量。在重量测量法中，增殖速度可以通过使微生物细胞的干重除以培养时间来计算。微生物的微生物细胞的干重通过将预先清洗过的预定体积的培养液放入称重管或预先称重的铝盘中，将溶液干燥，再次称重，获得干燥前后的重量变化(差异)来确定，并且基于该变化(差异)确定干重/体积。
根据本发明的培养方法，微生物的增殖速度基于根据重量测量法的微生物细胞干重(g-DCW/L)为0.2g/L/hr以上，优选0.3g/L/hr以上，更优选0.4g/L/hr以上。
(1)微生物
本发明的培养方法的对象微生物为属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物。这些微生物的例子与第1(3)部分中描述的相同。
(2)微生物的培养(主培养)
(2-1)培养基
培养基是为待培养的微生物提供生长环境的培养基，更具体地，是指通过将例如碳源、氮源和无机盐溶解在如水等水系介质中而制备的培养基。
“初级培养基”是指当按照流加培养***(后述)进行培养时，通过接种预培养物(种子)而开始培养(主培养)的培养基。
“流加培养基”是指在初级培养基中开始培养后的培养时间(过程)期间连续或间歇地添加到初级培养基中的培养基。
在本发明中，用于培养属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物的初级培养基和流加培养基包含葡萄糖酸。用于培养属于丛毛单胞菌属的微生物的初级培养基和流加培养基包含选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种。
优选对初级培养基和流加培养基灭菌并且用于培养。对培养基灭菌的方法没有限制，只要培养基处于不存在增殖微生物的无菌条件下即可。灭菌方法的实例包括高压灭菌法(在高压釜中例如在121℃下加热灭菌20分钟)和过滤灭菌(通过例如孔径为0.45μm或0.2μm的过滤器过滤。在加热灭菌的情况下，如果担心培养基的组分之间可能发生反应，则可以将培养基中的一种以上的组分与其它培养基组分分开灭菌，然后组合。
(2-1-1)初级培养基
初级培养基只要包含本发明的微生物可以利用的例如碳源、氮源、和无机盐类，并且为可以以高密度在短时间内培养微生物的培养基，就是令人满意的。
碳源的实例包括如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖和淀粉等碳水化合物；如乙酸、丙酸、葡萄糖酸和琥珀酸等有机酸；和如乙醇和丙醇等醇类。
如上所述，本发明的初级培养基包含选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种，并且优选葡萄糖酸和/或乙醇。
可以使用的氮源的实例包括源自天然产物(例如微生物、植物、动物奶或动物肉)的复合培养基组分；如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐；氨；以及如氨基酸和氮化合物等其它。
无机盐的实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、碳酸钙和七钼酸钼铵。
初级培养基根据需要可以包含上述组分以外的组分，如维生素和用于防止培养期间培养基起泡的消泡剂。
作为初级培养基的基本培养基，可以使用本领域公知的无机培养基。无机培养基的实例包括K1矿物培养基(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Dec.2005,p.7996-8005)；P.putida培养基(Biotechnology and Bioengineering,Vol.112,No.4,April,2015)；和MM培养基(磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水合磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA 10.0mg/L，六水合氯化镁100mg/L，七水合硫酸锌2.0mg/L，七水合硫酸铁5.0mg/L，四水合氯化锰10mg/L，五水合硫酸铜0.2mg/L，六水合氯化钴0.4mg/L，四水合七钼酸钼铵0.2mg/L，二水合氯化钙1.0mg/L)。其中，优选MM培养基。
在本发明中，当培养属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物时，将葡萄糖酸添加至如上所述的无机培养基中来使用。当培养属于丛毛单胞菌属的微生物时，将选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种，优选葡萄糖酸和/或乙醇添加至如上所述的无机培养基中来使用。
作为葡萄糖酸，例如可以使用如葡萄糖酸钠和葡萄糖酸钾等葡萄糖酸的盐。作为琥珀酸，可以使用如琥珀酸钠和琥珀酸钾等琥珀酸的盐。
对葡萄糖酸的使用量没有特别限制，只要可以以高浓度培养微生物即可。葡萄糖酸的量基于培养开始时的培养基的总量可以为例如50g/L以下，30g/L以下，更优选10g/L以下。如果该量为10g/L以下，则可以以更高的浓度以更高的收率培养微生物。相对地，将该量设定为110g/L以下，因为即使进一步增加该量也难以获得更高的效果。
对乙醇的使用量没有特别限制，只要可以以高浓度培养微生物即可。乙醇的量基于培养开始时的培养基的总量可以为例如30g/L以下，优选20g/L以下，更优选10g/L以下。如果该量为10g/L以下，则可以以更高的浓度以更高的收率培养微生物。相对地，将该量设定为110g/L以下，因为即使进一步增加该量也难以获得更高的效果。
对琥珀酸的使用量没有特别限制，只要可以以高浓度培养微生物即可。琥珀酸的量基于培养开始时的培养基的总量可以为例如50g/L以下，优选30g/L以下，更优选10g/L以下。如果该量为10g/L以下，则可以以更高的浓度以更高的收率培养微生物。相对地，将该量设定为110g/L以下，因为即使进一步增加该量也难以获得更高的效果。
(2-1-2)流加培养基
在本发明中，为了获得以高密度培养的微生物，优选在培养(培养过程)期间向初级培养基中添加流加培养基。
对流加培养基的组分没有限制，只要可以维持培养期间微生物的充分生长速度即可。在本发明中，可以使用与初级培养基相同的组分。
对于培养属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物，流加培养基包含葡萄糖酸。对于培养属于丛毛单胞菌属的微生物，流加培养基包含选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种。
对其它组分及其量没有限制，只要在培养期间可以维持微生物的充分生长速度并且可以被本领域技术人员适当选择即可。
对添加的流加培养基的体积没有限制，只要本发明中使用的微生物可以充分生长即可。流加培养基的体积例如为初级培养基的体积的0.1倍以上且相同体积以下，优选0.15倍以上且0.75倍以下，更优选0.2倍以上且0.5倍以下。将该体积设定为0.1倍以上，因为可以以高密度培养微生物。相对地，将该量设定为300g/L以下，因为即使进一步增加对培养基的添加量，也难以获得与添加量相当的高效果。
(2-2)培养方法
(2-2-1)培养体系
可用于本发明的培养方法的实例包括分批培养、流加培养(半分批培养、流加分批培养)和连续培养(灌流培养)。其中，优选流加培养。
流加培养***是指在培养过程中向培养基(例如，初级培养基)连续或间歇地补料(添加)培养基而不从容器中取出培养基直至培养结束来进行培养的培养方法。
对流加模式没有限制，只要可以在短时间内以高密度培养转基因的微生物以有效地生产重组蛋白即可。流加模式的实例包括恒速流加模式、指数流加模式、阶段增加流加模式、比生长速率控制流加模式、pH stat流加模式、DO-stat流加模式、葡萄糖浓度控制流加模式、乙酸浓度监控流加模式和脉冲流加模式。
对添加流加培养基的方法没有限制，只要在培养期间可以维持微生物的生长/增殖即可。例如，恒速流加模式为其中流加培养基以基于质量或体积的恒定流量连续或间歇补料的方法。注意，流量是每单位时间的流体移动量。
脉冲流加模式是指在随着基质的降解而消耗溶解氧后溶解氧再次开始上升时的点，流加培养基以基于质量或体积的恒定流量补料的模式。
可以在初级培养基中的溶解氧消耗高达80至99.9％、优选85至99.5％、更优选在溶解氧消耗高达90％至99％之后溶解氧再次开始上升时的时间点添加流加培养基。考虑到工作负荷和微生物细胞收率的提高，优选使用脉冲流加模式。这是因为通过添加流加培养基可以在短时间内以高密度培养微生物。
对流加培养基的添加量和添加速度没有限制，只要在培养期间维持培养基中的葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸的浓度并且充分维持微生物的生长/增殖即可。例如，优选增大培养基中各组分的浓度，因为可以节省流加培养基的添加量。
(2-2-2)培养温度
对培养温度没有限制，只要用于本发明的微生物充分生长和增殖即可。例如，可以将温度设定为10℃至45℃，优选15℃至40℃，更优选20℃至37℃。根据需要，可以在培养期间改变温度。如果将培养温度设定为10℃以上，则可以以高浓度培养微生物。如果将培养温度设定为45℃，则可以抑制培养速度的下降。
(2-2-3)pH
对培养期间的培养基的pH没有限制，只要本发明中使用的微生物充分生长和增殖即可。可以将培养基的pH设定为例如3至9，优选3.5至8.5，更优选5至8。如果在所述pH的范围内培养，则可以在短时间内以高密度培养微生物。
为了控制培养期间的培养基的pH值，可以使用无机或有机酸或碱溶液。作为酸，优选使用无机酸。酸的实例包括硫酸、磷酸、盐酸和硝酸。碱的实例包括氢氧化钾、氢氧化钠和氨。
(2-2-4)通气
在培养期间可以对培养液进行通气。例如，当以高浓度培养本发明中使用的微生物时，优选用包含较高浓度的氧气的气体对培养基通气。通气气体中包含的氧气的浓度可以根据例如要培养的微生物的种类和培养条件来适当地选择。可以将氧气的浓度设定为例如，20％(v/v)以上，优选50％(v/v)以上，且更优选90％(v/v)以上。如果用包含90％(v/v)以上的氧气的气体对培养基通气，则促进微生物的增殖。
通气量可以根据包括培养槽的尺寸的培养条件和要培养的微生物的种类来适当地选择。通气量可以为，例如，0.6至10vvm(1.2至20L/min)，优选0.8至8vvm(1.6至16L/min)，且更优选1至5vvm(2至10L/min)。如果将通气量设定为0.6vvm以上，则可以以高浓度培养微生物。将通气量限定为10vvm以下，因为即使通气量进一步提高，也难以获得比上述更高的效果。
(2-2-5)压力
对培养期间的压力没有特别限制。可以在大气压下，根据需要，在加压下进行进行培养。作为压力，例如可以在0至0.5MPa、优选0.01至0.3MPa、更优选0.02至0.2MPa的加压下进行培养。由于通过加压增加了培养基中溶解氧的浓度，因此，可以以更高的浓度培养微生物。
(2-2-6)搅拌
在本发明中，可以根据需要在搅拌培养液的同时进行培养。搅拌速度可以根据培养条件和微生物的种类来适当地选择。可以将搅拌速度设定为例如10至2500rpm，优选20至2000rpm，更优选30至1500rpm。如果将搅拌速度设定为10rpm以上，则可以以高浓度培养微生物。如果将搅拌速度设定为3000rpm以下，则可以降低对微生物的应力。
(2-2-7)培养时间
对培养时间没有限制，只要微生物以足够高的浓度生长和增殖即可。可以将培养时间设定为例如约5至120小时，优选10至100小时，进一步优选15至80小时，还更优选20至60小时。对培养的结束时间没有特别限制，可以在以期望的浓度(量)获得微生物后结束培养。
(2-2-8)其它条件
在本发明中，根据需要，可以进行预培养。预培养是用于制备在用于以高密度培养微生物的培养(主培养)中待接种的种子的培养过程。如果适当地进行预培养，则可以获得作为用于主培养的种子所需的微生物细胞量。
对用于预培养的培养基没有特别限制，只要其不抑制主培养中微生物的高密度培养即可。预培养用培养基例如可以包含与主培养的初级培养基相同的碳源、氮源、和无机盐类，根据需要，也可以包含其它组分。对预培养期间的培养温度、pH、压力和培养时间没有限制，只要它们不抑制主培养中微生物的生长即可。
培养温度可以为例如10℃至45℃，优选15℃至45℃，更优选20℃至37℃。培养期间的培养基的pH可以与主培养类似地用酸和碱控制，以落入预定范围内，但pH控制不是必需的。例如，当制备培养基时，将培养基的pH控制为3至9，优选3.5至8.5，更优选5至8。在培养期间，可以不控制pH。作为压力，可以在大气压下进行培养，并且根据需要，可以在0至0.1MPa、优选0.01至0.05MPa的压力下进行培养。对培养时间没有特别限制，只要在主培养中充分获得以高密度培养微生物所需的微生物细胞量即可。可以将培养时间设定为例如0.5至48小时，优选1至30小时，更优选3至24小时。
由于通过本发明的培养方法得到的培养液以高浓度包含微生物，因此该培养液可以直接用作微生物制剂。
根据需要，可以将微生物洗涤、进一步浓缩或在添加如防腐剂和稳定剂等添加剂的情况下使用。
根据需要，可以在添加如海藻糖、谷氨酸钠和脱脂乳等冷冻干燥保护剂的情况下冷冻干燥微生物。冷冻干燥的微生物细胞可以直接用作微生物制剂，或者可以将冷冻干燥的微生物细胞与各种添加剂的混合物用作微生物制剂。
由于本发明中使用的微生物可以降解例如糠醛、乙酸和甲酸，因此，如上所述的微生物制剂可用于第1部分所述的废水处理。
实施例
将通过实施例更具体地描述本发明；然而，本发明不限于这些实施例。
[部分I]
[试验例1]废水中包含的呋喃类化合物利用***丛毛单胞菌NBRC12047菌株的经时降解试验
向置于200mL锥形瓶中的20mL包含浓度分别调节为100ppm、1000ppm和1300ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中，添加***丛毛单胞菌NBRC12047菌株，以使获得最终的OD660＝0.005。将烧瓶用棉塞封闭并且在30℃和230rpm下振荡。在0、7、24和48小时的时间点取样。样品中的悬浮物通过0.45μm过滤器过滤，样品中糠醛、甲酸和乙酸的浓度通过HPLC测量。
测量条件如下。糠醛通过使用Nakalai 5C18-MS-II(4.6ID×250mm)柱、通过将20mM甲酸和甲醇的比例设定为20：80测量20分钟。甲酸、乙酸和木糖通过ULTRON PS-80H(ID8.0mm×300mm)柱使用0.108％高氯酸测量20分钟。
结果在图1中示出。从图1可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm；甲酸(1000ppm)减少至130ppm；和乙酸(1300ppm)减少至0ppm。
[试验例2]废水中包含的呋喃化合物利用氧化硫丛毛单胞菌NBRC110656菌株的经时降解试验
除了添加氧化硫丛毛单胞菌NBRC 110656菌株，以在包含浓度分别调节为100ppm、1800ppm和2500ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中获得最终OD660＝0.005以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图2中示出。从图2可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm，甲酸(1800ppm)减少至220ppm和乙酸(2500ppm)减少至0ppm。
[试验例3]废水中包含的呋喃化合物利用异食副伯克霍尔德氏菌DSM17367菌株的经时降解试验
除了添加异食副伯克霍尔德氏菌DSM17367菌株，以在包含浓度分别调节为100ppm、900ppm和1300ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中获得最终OD660＝0.005以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图3中示出。从图3可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm，甲酸(900ppm)减少至200ppm和乙酸(1300ppm)减少至180ppm。
[试验例4]废水中包含的呋喃化合物利用恶臭假单胞菌NBRC3738菌株的经时降解试验
除了添加恶臭假单胞菌NBRC3738菌株，以在包含浓度分别调节为100ppm、900ppm和1200ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中获得最终OD660＝0.005以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图5中示出。从图5可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm，甲酸(900ppm)减少至0ppm和乙酸(1200ppm)减少至0ppm。
[试验例5]废水中包含的呋喃化合物利用多噬伯克霍尔德氏菌NBRC102086菌株的经时降解试验
除了添加多噬伯克霍尔德氏菌NBRC 102086，以在包含浓度分别调节为100ppm、1800ppm和2500ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中获得最终OD660＝0.005以外，重复与试验例1相同的步骤。
[试验例6]膜分离器中废水中包含的呋喃化合物利用***丛毛单胞菌NBRC12047菌株的经时降解试验
在宽度为105mm的范围内等间隔排列20张中空纤维微滤膜(由聚偏二氟乙烯制成的“SADF膜”，由Mitsubishi Chemical Corporation制造)，然后，将中空纤维微滤膜的两端连接至环状支承体。以这种方式，制备未封闭(开放)的膜组件(有效膜长度125mm，膜面积0.022m2)。将膜组件配置在通气槽(宽10cm，深12cm，高35cm)的扩散管上方，使膜的长度方向(长边)与垂直方向平行，以制备膜生物反应器。
向膜生物反应器中装入2000mL从Mitsubishi Chemical Corporation的Science&Innovation Center的所在地中的废水处理设施收集的活性污泥(pH 7.0)，以包含4000mg/L的MLSS。在处理温度为30℃、曝气量为10L/min下，通过以720mL/天的流速供给废水来开始膜过滤以获得处理水。包含浓度分别调节为100ppm、2000ppm、200ppm和550ppm的糠醛、甲酸、乙酸和木糖的废水，添加***丛毛单胞菌NBRC12047菌株，以获得最终OD660＝0.005。每天从通过膜过滤的水中取样。通过TOC分析仪(TOC-V SCN,Shimadzu Corporation)根据“JIS K-0102工厂废水试验法”按照燃烧氧化-红外线TOC分析法来测量样品中的TOC(有机碳浓度)。样品的CODcr值通过将各样品的TOC乘以从已知TOC值和CODcr值的样品获得的相关系数来确定。结果在图5中示出。从图5可以看出，确认处理水的CODcr去除率保持在约90％以上的水平27天。
[试验例7]包含呋喃化合物的废水用***丛毛单胞菌NBRC12047菌株和活性污泥处理后获得的废水的活性炭处理试验
将试验例6中得到的废水供给至装有活性炭达到35cm高度的柱(由MitsubishiChemical Aqua Solutions Co.,Ltd.制造)中，并且使其通过重力而落下并以获得1.3m/h的线速度和41/h的空速的方式通过废水2小时。废水通过柱前的620ppm废水的CODcr值在废水通过柱后降低至30ppm。
[试验例8]对包含呋喃化合物的废水用***丛毛单胞菌NBRC12047菌株和活性污泥处理后获得的废水的芬顿催化剂处理试验
将试验例6中获得的废水添加至50mL Falcon管中，并且向其中分别以废水中TOC的2倍的摩尔量添加七水硫酸铁和过氧化氢，然后，在常温(25℃)下静置一小时。在形成沉淀后，将样品的上清液通过0.45μm过滤器过滤。处理前的520ppm的CODcr值在芬顿催化剂处理后降低至102ppm。
[试验例9]包含呋喃化合物的废水用***丛毛单胞菌NBRC12047菌株和活性污泥处理后获得的废水的过氧化物酶或漆酶处理试验
将试验例6中获得的废水添加至50mL Falcon管中，添加过氧化氢、过氧化物酶(源自辣根(Armorica rusticana)，由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)和漆酶(源自变色栓菌，Sigma-Aldrich)使得分别为10ppm、5ppm和5ppm，然后，在常温下单独放置24小时。在形成沉淀后，将样品的上清液通过0.45μm过滤器过滤。处理前的620ppm的CODcr值，在用过氧化氢和过氧化物酶处理后降低至110ppm，和在用漆酶处理后降低至100ppm。
[试验例10]废水中包含的呋喃化合物利用多噬伯克霍尔德氏菌NBRC102086菌株的经时降解试验
除了添加多噬伯克霍尔德氏菌NBRC 102086菌株，使得包含浓度分别调节为100ppm、200ppm和2000ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中的最终OD660＝0.1以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图6中示出。从图6可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0ppm，甲酸(200ppm)减少至0ppm，乙酸(2000ppm)减少至0ppm。
[试验例11]废水中包含的呋喃化合物利用卡莱多尼亚副伯克霍尔德氏菌NBRC102488菌株的经时降解试验
除了添加卡莱多尼亚副伯克霍尔德氏菌NBRC102488菌株，使得包含浓度分别调节为100ppm、200ppm和2000ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中最终OD660＝0.1以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图7中示出。从图7可以看出，确认在48小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm，甲酸(200ppm)减少至0ppm和乙酸(2000ppm)减少至0ppm。
[试验例12]废水中包含的呋喃化合物利用栖稻假单胞菌NBRC102199菌株的经时降解试验
除了添加栖稻假单胞菌NBRC102199菌株，使得包含浓度分别调节为100ppm、200ppm和2000ppm的糠醛、甲酸和乙酸的液体培养基中最终OD660＝0.1以外，重复与试验例1相同的步骤。结果在图8中示出。从图8可以看出，确认在120小时内，以100ppm的浓度存在的糠醛降解并且减少至0pm，甲酸(200ppm)减少至0ppm和乙酸(2000ppm)减少至0ppm。
[部分II]
1.通过试管培养寻找最佳碳源
<实施例1>
(主培养)
将***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株的菌落接种到在15mL试管中制备的3mL主培养基中，并且在30℃的温度和200rpm的转速下振荡16小时的同时培养。
通过在水中溶解各组分(葡萄糖酸钠10g/L，磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA 10.0mg/L，六水氯化镁100mg/L，七水硫酸锌2.0mg/L，七水硫酸铁5.0mg/L，四水氯化锰10mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.4mg/L，四水七钼酸钼铵0.2mg/L，二水氯化钙1.0mg/L)，在量瓶中稀释该溶液，然后加热灭菌(121℃，20分钟)来制备主培养基。
微生物密度的测量通过测量660nm处的吸光度(OD660)来确定。结果在表1中示出。
<实施例2>
除了在主培养基中使用琥珀酸二钠(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
<实施例3>
除了在主培养基中使用甘油(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
<实施例4>
除了在主培养基中使用乙醇(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
<比较例1>
除了在主培养基中使用葡萄糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
<比较例2>
除了在主培养基中使用木糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
<比较例3>
除了在主培养基中使用蔗糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表1中示出。
[表1]
从表1可以确认，当葡萄糖酸钠、琥珀酸二钠、乙醇或甘油用作碳源时，***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株在16小时时具有高微生物浓度，而当葡萄糖、木糖或蔗糖用作碳源时，菌株不生长。
<实施例5>
除了将多噬伯克霍尔德氏菌NBRC 102086菌株用作微生物以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<实施例6>
除了在主培养基中使用琥珀酸二钠(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<实施例7>
除了在主培养基中使用甘油(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<实施例8>
除了在主培养基中使用乙醇(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<比较例4>
除了在主培养基中使用葡萄糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<比较例5>
除了在主培养基中使用木糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
<比较例6>
除了在主培养基中使用蔗糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例5相同的方式进行培养。结果在表2中示出。
[表2]
<实施例9>
除了将卡莱多尼亚副伯克霍尔德氏菌NBRC102488菌株用作微生物以外，以与实施例1相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<实施例10>
除了在主培养基中使用琥珀酸二钠(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<实施例11>
除了在主培养基中使用甘油(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<实施例12>
除了在主培养基中使用乙醇(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<比较例7>
除了在主培养基中使用葡萄糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<比较例8>
除了在主培养基中使用木糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
<比较例9>
除了在主培养基中使用蔗糖(10g/L)代替葡萄糖酸钠以外，以与实施例9相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
[表3]
2.通过1L罐培养优化主培养基中葡萄糖酸钠的初始浓度
<实施例13>
(前预培养(Pre-pre culture))
将***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株的菌落接种到8个15mL试管中制备的3mL前预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在30℃的温度和230rpm的转速下振荡的情况下培养8小时。
前预培养基的通过将LB Broth Miller Novagen(25g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至1000mL，然后，加热灭菌(121℃，20分钟)来制备。
(预培养)
将获得的前预培养液(3mL)接种(添加)到500mL烧瓶中制备的100mL预培养基(LBBroth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在温度30℃和转速230rpm下振荡的情况下培养16小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(2.5g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至100mL并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(主培养)
通过离心机浓缩获得的预培养液(200mL)。将浓缩的微生物细胞接种于1L发酵罐中制备的500mL主培养初级培养基(葡萄糖酸钠10g/L，磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA 10.0mg/L，六水氯化镁100mg/L，七水硫酸锌2.0mg/L，七水硫酸铁5.0mg/L，四水氯化锰10mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.4mg/L，四水七钼酸钼铵0.2mg/L，二水氯化钙1.0mg/L，LG-294(1g/L ADEKA CORPORATION))中，以获得1.0的初始OD660，在以1.0vvm用包含20％(v/v)氧气的气体对培养基通气，并且将pH的下限控制为6.95和pH的上限控制为7.05(使用1N氢氧化钾溶液)的同时，在温度为30℃并且转速为500rpm下培养。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中，在量瓶中将溶液稀释至2000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先通过0.20μm过滤器灭菌的其它各组分(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)的溶液在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
培养(培养基)的pH保持在约7.0直到培养结束。培养47小时后得到的培养液通过测量660nm处的吸光度(OD660)来测量微生物浓度。结果在表4中示出。
<比较例10>
除了在主培养基中，将葡萄糖酸钠的量改变为20g/L以外，以与实施例13相同的方式进行培养。结果在表4中示出。
<比较例11>
除了进行接种以获得0.5的初始OD660，并且在培养23小时后收集主培养液以外，以与实施例13相同的方式进行培养。结果在表4中示出。
<比较例12>
除了在主培养基中，将葡萄糖酸钠的量改变为50g/L以外，以与实施例13相同的方式进行培养。结果在表4中示出。
<比较例13>
除了在主培养基中，将葡萄糖酸钠的量改变为100g/L以外，以与实施例13相同的方式进行培养。结果在表3中示出。
[表4]
3.5L罐培养时通气量的优化
<实施例14>
(前预培养)
将***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株的菌落接种在8个15mL试管中制备的3mL前预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在30℃的温度和230rpm的转速下振荡的情况下培养8小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(25g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至1000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(预培养)
将获得的前预培养液(3mL)接种(添加)在8个500mL烧瓶中制备的100mL预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在30℃的温度和230rpm的转速下振荡的情况下培养16小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(2.5g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至100mL并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(主培养)
通过离心机浓缩获得的预培养液(800mL)。将浓缩的微生物细胞接种于5L发酵罐中制备的2L主培养初级培养基(葡萄糖酸钠10g/L，磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA 10.0mg/L，六水氯化镁100mg/L，七水硫酸锌2.0mg/L，七水硫酸铁5.0mg/L，四水氯化锰10mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.4mg/L，四水七钼酸钼铵0.2mg/L，二水氯化钙1.0mg/L，LG-294(1g/L ADEKA CORPORATION))中，以获得1.0的初始OD660，并且在用包含90％(v/v)氧气的气体以2.0vvm和0.05MPa的压力对培养基通气，并且将pH的下限控制为6.95，和pH的上限控制为7.05(使用1N氢氧化钾钠溶液)的同时，在温度30℃并且转速200rpm下培养。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中，在量瓶中将溶液稀释至2000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先用0.20μm过滤器灭菌的其它组分的溶液(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
(流加培养基的添加)
在当在消耗初级培养基中90至99％的溶解氧后溶解氧再次开始上升时的各时间点，以恒定的速度重复添加(进料)主培养流加培养基(葡萄糖酸钠259g/L，磷酸氢二钾1.12g/L，硫酸铵1.12g/L，二水磷酸二氢钾1.12g/L，EDTA 0.02mg/L，六水氯化镁0.22mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，七水硫酸铁0.22mg/L)(脉冲进料法)。
通过将通过使葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中，在1000mL量瓶中将溶液稀释至上述浓度，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先用0.20μm过滤器灭菌的其它各组分的溶液(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)在无菌条件下混合来制备主培养流加培养基。
在适当的时间取样的同时，培养总共进行48小时。从培养开始约48小时后，以2.6mL/min的恒定流量添加流加培养基。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。通过测量660nm处的吸光度(OD660)来测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表5中示出。
<实施例15>
除了将通气量控制为达到0.5vvm以外，以与实施例14相同的方式进行培养。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。以与实施例1相同的方式测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表5中示出。
<实施例16>
除了将通气量控制为达到1.0vvm以外，以与实施例14相同的方式进行培养。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。以与实施例1相同的方式测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表5中示出。
[表5]
4.5L罐培养时通气气体中氧气浓度的优化
<实施例17>
(前预培养)
将***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株的菌落接种在8个15mL试管中制备的3mL前预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在30℃的温度和230rpm的转数下振荡的情况下培养8小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(25g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至1000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(预培养)
将获得的前预培养液(3mL)接种(添加)在8个500mL烧瓶中制备的100mL预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在温度30℃和转速230rpm下振荡的情况下培养16小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(2.5g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至100mL并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(主培养)
通过离心机浓缩获得的预培养液(800mL)。将浓缩的微生物细胞接种于5L发酵罐中制备的2L主培养初级培养基(葡萄糖酸钠10g/L，磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA 10.0mg/L，六水氯化镁100mg/L，七水硫酸锌2.0mg/L，七水硫酸铁5.0mg/L，四水氯化锰10mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.4mg/L，四水七钼酸钼铵0.2mg/L，二水氯化钙1.0mg/L，LG-294(1g/L ADEKA CORPORATION))中以获得1.0的初始OD660，并且在用包含90％(v/v)以上的氧气的气体以1.0vvm和0.05MPa的压力对培养基通气，并且将pH的下限控制为6.95，和pH的上限控制为7.05(使用1N氢氧化钾钠溶液)的同时，在温度30℃并且转速200rpm下培养。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中，在量瓶中将溶液稀释至2000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先通过0.20μm过滤器灭菌的其它各组分(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)的溶液在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
(流加培养基的添加)
在当在消耗初级培养基中90至99％的溶解氧后溶解氧再次开始上升时的各时间点，以恒定的速度重复添加(进料)主培养流加培养基(葡萄糖酸钠259g/L，磷酸氢二钾1.12g/L，硫酸铵1.12g/L，二水磷酸二氢钾1.12g/L，EDTA 0.02mg/L，六水氯化镁0.22mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，七水硫酸铁0.22mg/L)(脉冲进料法)。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中使得浓度如上所述，然后在量瓶中将溶液稀释至1000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先通过0.20μm过滤器灭菌的其它各组分(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)的溶液在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
在适当的时间取样的同时，培养总共进行25小时。从培养开始48小时后，以2.6mL/min的恒定流量添加流加培养基。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。通过测量660nm处的吸光度(OD660)来测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表6中示出。
<实施例18>
除了用包含20％(v/v)氧气的气体以1.0vvm进行通气以外，以与实施例17相同的方式进行培养。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。以与实施例1相同的方式测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表6中示出。
[表6]
5.5L罐中添加方法的优化
<实施例19>
(前预培养)
将***丛毛单胞菌NBRC 12047菌株的菌落接种在8个15mL试管中制备的3mL前预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在30℃的温度和230rpm的转速下振荡的情况下培养8小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(25g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至1000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(预培养)
将获得的前预培养液(3mL)接种(添加)在8个500mL烧瓶中制备的100mL预培养基(LB Broth Miller Novagen目录号：71753-5CN)中，并且在温度30℃和转速230rpm下振荡的情况下培养16小时。
通过将LB Broth Miller Novagen(2.5g)溶解在水中，在量瓶中将混合物稀释至100mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)来制备前预培养基。
(主培养)
通过离心机浓缩所得预培养液(800mL)。将浓缩的微生物细胞接种于5L发酵罐中制备的2L主培养初级培养基(葡萄糖酸钠10g/L，磷酸氢二钾3.9g/L，硫酸铵2.0g/L，二水磷酸二氢钾2.1g/L，EDTA10.0mg/L，六水氯化镁100mg/L，七水硫酸锌2.0mg/L，七水硫酸铁5.0mg/L，四水氯化锰10mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.4mg/L，四水七钼酸钼铵0.2mg/L，二水氯化钙1.0mg/L，LG-294(1g/L ADEKACORPORATION)中以获得1.0的初始OD660，并且在用包含20％(v/v)以上的氧气的气体以1.0vvm和0.05MPa的压力对培养基通气，并且将pH的下限控制为6.95，和pH的上限控制为7.05(使用1N氢氧化钾钠溶液)的同时，在温度30℃并且转速200rpm下培养。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中，在量瓶中将溶液稀释至2000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先通过0.20μm过滤器灭菌的其它各组分(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)的溶液在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
(流加培养基的添加)
在当在消耗初级培养基中90至99％的溶解氧后溶解氧再次开始上升时的各时间点，以恒定的速度重复添加(进料)主培养流加培养基(葡萄糖酸钠259g/L，磷酸氢二钾1.12g/L，硫酸铵1.12g/L，二水磷酸二氢钾1.12g/L，EDTA 0.02mg/L，六水氯化镁0.22mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，七水硫酸铁0.22mg/L)(脉冲进料法)。
通过将通过使所需量的葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵和二水磷酸二氢钾溶解在水中使得浓度如上所述，在量瓶中将溶液稀释至1000mL，并且加热灭菌(121℃，20分钟)制备的溶液与预先通过0.20μm过滤器灭菌的其它各组分(葡萄糖酸钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、二水磷酸二氢钾除外)的溶液在无菌条件下混合来制备主培养初级培养基。
培养的pH保持在约7.0直到培养结束。通过在660nm处测量吸光度(OD660)来测量在培养48小时时获得的培养液的微生物浓度。供给的葡萄糖酸的量(初级培养基中的葡萄糖酸的量和流加培养基中的葡萄糖酸的量的总和)为80g。
通过将微生物浓度除以葡萄糖酸的供给量来计算微生物细胞对葡萄糖酸的收率。结果在表7中示出。
<实施例20>
除了用包含20％(v/v)氧气的气体以2vvm进行通气；以0.1mL/min的恒定流量添加流加培养基；和进行培养96小时以外，以与实施例1相同的方式进行培养。葡萄糖酸的供给量为136g。培养的pH保持在约7.0直到培养结束。以与实施例1相同的方式测量获得的培养液的微生物浓度。结果在表7中示出。
[表7]
6.冷冻干燥菌的生产方法
<实施例21>
将培养液(5mL)放入15mL Falcon管中，离心至10倍浓缩微生物细胞。向浓缩的微生物细胞(80g-DCW/L)中，添加与微生物细胞相同重量的作为冷冻保护剂的海藻糖。将混合物通过超冷冷冻柜(CLN-50UW Nihon Freezer Co.,Ltd.)在-80℃下冷冻17小时。通过冷冻干燥机(FDU-2110TOKYO RIKAKIKAI CO,LTD.)以下条件下进行冷冻干燥：真空度：3.7Pa，干燥温度：30℃，干燥时间：24小时，和捕集温度：-45.5℃。将获得的冷冻干燥微生物细胞在冰箱中储存40天，然后，悬浮在20mM磷酸盐缓冲液中。活菌计数的评价和废水中所包含的呋喃化合物的降解试验如下进行。
<活菌计数的评价>
将冷冻干燥并且在冰箱中储存40天的微生物细胞悬浮在20mM磷酸盐缓冲液中，并且用20mM磷酸盐缓冲液稀释104倍。将稀释溶液(5μl)涂抹在LB琼脂培养基(LB BrothMiller Novagen目录号：71753-5CN，调节至包含1.5％的琼脂)上，并且在30℃下进行静置培养2天。目测计数呈现的菌落并且用作活菌计数(CFU：菌落形成单位)。
<废水中包含的呋喃化合物的降解试验>
向放置于200mL锥形瓶中的包含浓度调节为100ppm的糠醛的20mL MM液体培养基中，添加***丛毛单胞菌NBRC12047菌株，使得获得最终OD660＝0.1。将烧瓶用棉塞封闭并且在30℃和230rpm下振荡。72小时后，取样并且用0.45μm过滤器过滤样品中的悬浮物。通过HPLC测量样品中糠醛的浓度。
测量条件如下。通过使用Nakalai 5C18-MS-II(4.6ID×250mm)柱，通过将20mM甲酸和甲醇的比例设定为20：80，测量糠醛20分钟。结果在表8中示出。
<实施例22>
除了添加微生物细胞5倍重量的海藻糖以外，重复与实施例21相同的步骤。结果在表8中示出。
<实施例23>
除了添加与微生物细胞相同量(重量)的脱脂乳以外，重复与实施例21相同的步骤。结果在表8中示出。
<实施例24>
除了添加微生物细胞5倍重量的脱脂乳以外，重复与实施例21相同的步骤。结果在表8中示出。
<实施例25>
除了添加与微生物细胞相同量(重量)的谷氨酸钠以外，重复与实施例21相同的步骤。结果在表8中示出。
<实施例26>
除了添加微生物细胞5倍重量的谷氨酸钠以外，重复与实施例21相同的步骤。结果在表8中示出。
<比较例14>
除了离心浓缩10倍的微生物细胞不进行冷冻干燥以外，以与实施例21相同的方式进行活菌计数的评价和废水中的呋喃化合物的降解试验。结果在表8中示出。
<比较例15>
除了不添加冷冻保护剂以外，在冷冻干燥后即刻，以与实施例21相同的方式进行活菌计数的评价和废水中所包含的呋喃化合物的降解试验。结果在表8中示出。
[表8]
产业上的可利用性
根据本发明，提供包含呋喃化合物的废水的生物学处理，其中可以在防止处理能力降低的同时有效地去除废水中的呋喃化合物、酸组分和糖类。通过本发明得到的处理水的水品质高(CODcr：500ppm以下)，并且可以满足对废水的严格规定。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以全文引用的方式并入本文中。
Claims (21)
1.一种用于处理包含呋喃化合物的废水的微生物制剂，所述微生物制剂包含选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的微生物制剂，其中所述属于丛毛单胞菌属的微生物为***丛毛单胞菌和/或氧化硫丛毛单胞菌；所述属于伯克霍尔德氏菌属的微生物为多噬伯克霍尔德氏菌；所述属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物为异食副伯克霍尔德氏菌；和所述属于假单胞菌属的微生物为恶臭假单胞菌或栖稻假单胞菌。
3.根据权利要求1或2所述的微生物制剂，其中所述呋喃化合物为呋喃醛。
4.一种废水处理方法，其包括：使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触的步骤。
5.根据权利要求4所述的废水处理方法，其中所述属于丛毛单胞菌属的微生物为***丛毛单胞菌和/或氧化硫丛毛单胞菌；所述属于伯克霍尔德氏菌属的微生物为多噬伯克霍尔德氏菌；所述属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物为异食副伯克霍尔德氏菌；所述属于假单胞菌属的微生物为恶臭假单胞菌或栖稻假单胞菌。
6.根据权利要求4或5所述的废水处理方法，其中所述呋喃化合物为呋喃醛。
7.一种废水处理方法，其包括：在膜分离器的存在下，使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触的步骤。
8.一种废水处理方法，其包括以下步骤：
(1)使包含呋喃化合物的废水与选自属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物、属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物和属于假单胞菌属的微生物中的至少一种接触；和
(2)使步骤(1)中获得的废水与选自活性炭、芬顿催化剂和多环芳香族降解酶中的至少一种接触。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的废水处理方法，其中获得的废水的CODcr值为500ppm以下。
10.一种培养属于丛毛单胞菌属的微生物、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物或属于副伯克霍尔德氏菌属的微生物的方法，其包括在包含葡萄糖酸的培养基中培养微生物的步骤。
11.一种培养属于丛毛单胞菌属的微生物的方法，其包括：在包含选自葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸中的至少一种的培养基中培养微生物的步骤。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中包含微生物的培养基在培养开始后24小时在660nm的波长下的光学密度为15以上。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中包含微生物的培养基在培养开始后48小时在660nm的波长下的光学密度为20以上。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中培养基中存在的葡萄糖酸、乙醇和琥珀酸全部具有10g/L以下的浓度。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述微生物的增殖速度基于微生物细胞的干重为0.2g/L/hr以上。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中依照流加培养进行培养。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其包括：使包含90％(v/v)以上的氧气的气体通过培养液的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述气体以6至5vvm的通气量通过。
19.一种根据权利要求1至3中任一项所述的微生物制剂的生产方法，其包括：将包含通过根据权利要求10至18中任一项所述的方法获得的微生物和基于所述微生物的干重为1至10倍的量的冷冻保护剂的组合物冷冻干燥的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述冷冻保护剂为选自海藻糖、脱脂乳和谷氨酸中的至少一种。
21.一种根据权利要求1至3中任一项所述的微生物制剂，其通过根据权利要求19或20所述的方法来生产。
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