CN115298189A - 合成治疗性纳米颗粒的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于化学合成治疗性纳米颗粒的改进方法和反应物。该纳米颗粒包含聚合物核心，其中一种或多种导向分子和一种或多种治疗剂连接至该聚合物核心。使用本文公开的方法获得了速度、产率和纯度的改进。

Description

合成治疗性纳米颗粒的方法和组合物
交叉引用相关申请
根据35U.S.C.§119(e)(1)，本申请要求2019年12月4日提交的美国临时专利申请号62/943,594和2020年11月5日提交的美国临时专利申请号63/110,182的权益；出于所有目的，这两者的公开内容均以引用的方式并入本文。
关于联邦支持的声明
不适用。
发明领域
本公开属于用于治疗各种癌症的纳米颗粒领域，其中所述纳米颗粒包含聚合物核心，进一步包含一种或多种导向分子(即靶向分子)和/或一种或多种治疗分子。本文提供了用于合成此类纳米颗粒的改进方法。
背景技术
治疗许多脑部疾病(例如脑癌和脑转移)需要将治疗分子递送到脑部。直接向大脑递送治疗剂对受试者构成严重风险(例如，破坏颅骨)，并且不能像大多数化疗治疗所要求的那样持续进行。然而，由于血脑屏障(BBB，这是一层排列在大脑血管内的紧密连接的内皮细胞)的存在，全身递送(例如，通过血液)不能有效地将分子递送到大脑。在某些实体瘤中存在类似的渗透屏障，称为血肿瘤屏障(BTB)。
乳腺癌经常转移到脑部，如果治疗剂可以以足够的浓度递送至脑部，则这些脑转移瘤可以用用于治疗乳腺癌的化疗分子进行治疗。一种这样的化学治疗剂是喜树碱(抑制DNA拓扑异构酶I的生物碱)，从而阻止细胞***。由于喜树碱在水性环境如细胞质中的溶解度问题，已开发出具有更大溶解度的喜树碱衍生物。一种这样的衍生物是7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)，它最初是作为喜树碱类似物伊立替康的代谢物被发现的。
为了解决跨BBB和BTB递送治疗剂的问题，已经开发了含有化学治疗分子和导向(即靶向)分子的纳米颗粒，其中导向分子与存在于脑内皮细胞(和肿瘤脉管***的内皮细胞)表面上的转铁蛋白受体结合，这使得纳米颗粒能够通过胞吞作用穿过内皮细胞。参见例如美国专利号9,468,681；10,166,291和10,182,986。出于所有目的，或者至少出于它们对纳米颗粒的性质、它们的制备和使用方法以及它们的操作模式的教导，这些专利中的每一个都通过引用并入本文。
合成此类纳米颗粒的某些步骤是(1)将粘酸转化为能够聚合的反应性衍生物(即“粘酸单体”或MAM)，(2)将粘酸单体聚合形成粘酸聚合物(MAP)，(3)将治疗分子转化为选择性反应性衍生物，和(4)将一种或多种衍生的治疗分子与MAP相连。
已经描述了能够穿过血脑屏障和血肿瘤屏障的含有喜树碱(CPT)的纳米颗粒。参见例如美国专利号9,446,149；9,468,681；10,166,291和美国专利申请公开号2019/0381188(2019年12月19日)；出于所有目的或至少出于纳米颗粒的描述，这些专利中的每一个都通过引用并入本文。然而，用于制备此类纳米颗粒的现有方法是试剂和时间密集型的，需要升高的温度，并且产率低。此外，如上所述，在水性条件下溶解度更高的CPT衍生物将是优选的。因此，需要用于合成含有化学治疗剂如CPT及其衍生物如SN38的纳米颗粒的改进方法，其中所述方法是快速的，就反应物而言经济，并且提供高产率。
此外，非中枢神经***恶性肿瘤(如非中枢神经***肿瘤和血液***恶性肿瘤)的治疗将受益于改进的化疗药物递送载体。
发明内容
本文提供了用于合成治疗性纳米颗粒的改进方法，该治疗性纳米颗粒包含粘酸-聚乙二醇(PEG)聚合物和化疗药物，例如喜树碱(CPT)及其衍生物和代谢物，例如7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)。这些改进尤其包括新的中间体、更稳定的反应物的使用、更稳定的中间体的形成、更快速的反应时间、更高的中间体和产物产率，以及用于将靶向(导向)分子和治疗分子(例如，大分子治疗剂；例如，抗体)与纳米颗粒偶联的新连接基。还提供了用于本文所述方法的衍生的纳米颗粒(例如，含有偶联的CPT或SN38分子)；用于组装治疗性纳米颗粒的粘酸聚合物(MAP)缀合物(例如，与CPT、SN38、转铁蛋白和/或曲妥珠单抗偶联的MAP)也是如此。
因此，本文特别提供以下实施方案：
1.由粘酸二氨基氯化物合成粘酸二(天冬氨酰胺)二-三氟乙酸盐的方法，该方法包括：
(a)将具有以下结构的粘酸二氨基氯化物：
Figure BDA0003677646290000031
转化为具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)：
Figure BDA0003677646290000032
和
(b)将粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)转化为具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰胺)二-三氟乙酸盐：
Figure BDA0003677646290000033
2.实施方案1的方法，其中，在步骤(b)中：
(a)将粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)转化为具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰胺)中性物质：
Figure BDA0003677646290000034
和
(b)将粘酸二(天冬氨酰胺)中性物质转化为粘酸二(天冬氨酰胺)二-三氟乙酸盐。
3.合成粘酸二(天冬氨酰胺)二-三氟乙酸盐的方法，该方法包括将具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰胺)中性物质：
Figure BDA0003677646290000041
转化为具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰胺)二-三氟乙酸盐：
Figure BDA0003677646290000042
4.具有以下结构的粘酸二(天冬氨酰胺)中性物质：
Figure BDA0003677646290000043
5.合成SN38的10-TBDPS衍生物的方法，该方法包括在碱(例如胺碱，例如三烷基胺，例如三乙胺)和溶剂(例如二氯甲烷(DCM))中加热SN38和叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)的混合物，其中该产物具有以下结构：
Figure BDA0003677646290000044
在某些实施方案中，将该混合物加热到15℃至90℃范围内的温度，持续5分钟至48小时范围内的时间。在另外的实施方案中，在反应结束时，将该反应混合物依次用稀酸(例如，0.2N HCl)、弱碱(例如，饱和的NaHCO3)和盐水洗涤。在进一步的实施方案中，将中和的溶液干燥(例如，用MgSO4)。在另外的实施方案中，在真空下蒸发该干燥的溶液，得到固体。在进一步的实施方案中，将该固体重结晶；例如，通过溶解残余物(例如，在DCM中)和沉淀产物(例如，用己烷)。
在另外的实施方案中，将具有20-OH基团和/或10-OH基团的SN38或CPT的衍生物或类似物代替SN38用作起始物料。
上述实施方案的组合也被认为是本文公开的本发明的附加实施方案。
6.合成SN38的20-Boc-氨基酰基-10-TBDPS衍生物的方法，该方法包括在溶剂、碱和偶联剂的存在下将10-TBDPS-SN38与Boc-氨基酸-OH混合。在某些实施方案中，将反应物在溶剂(例如，DCM)和/或偶联剂(例如，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl))和/或碱(例如，4-二甲基氨基吡啶(DMAP))中混合。在某些实施方案中，将该反应在0℃至20℃或其间的任何整数或小数值的温度下进行。
7.实施方案6的方法，其中该氨基酸选自甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、γ-氨基丁酸(GABA)和己酸(Hex)。
8.具有以下结构的20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38：
Figure BDA0003677646290000051
9.具有以下结构的20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38：
Figure BDA0003677646290000052
10.具有以下结构的20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38：
Figure BDA0003677646290000053
11.具有以下结构的20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38：
Figure BDA0003677646290000061
12.合成SN38的10-OBoc衍生物(10-OBoc-SN38)的方法，该方法包括在碱(例如，吡啶)和溶剂(例如，DCM)的存在下将SN38与二碳酸二叔丁酯结合，其中10-OBoc-SN38具有以下结构：
Figure BDA0003677646290000062
13.合成SN38的20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc衍生物的方法，该方法包括在溶剂(例如，DCM)、碱(例如，DMAP)和偶联剂(例如，EDC.HCl)的存在下，在降低的温度下，将10-OBoc-SN38与Boc-氨基酸-OH结合，其中20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc-SN38具有以下结构：
Figure BDA0003677646290000063
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。在某些实施方案中，将该反应在0℃至20℃或其间的任何整数或小数值的温度下进行。
14.实施方案12的方法，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸(β-Ala)、缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)的官能团。
15.具有以下结构的20-(Boc-Gly)-10-OBoc-SN38：
Figure BDA0003677646290000071
16.具有以下结构的20-(Boc-Ala)-10-OBoc-SN38：
Figure BDA0003677646290000072
17.具有以下结构的20-(Boc-β-Ala)-10-OBoc-SN38：
Figure BDA0003677646290000073
18.具有以下结构的20-(Boc-Val)-10-OBoc-SN38：
Figure BDA0003677646290000074
19.具有以下结构的20-(Boc-Leu)-10-OBoc-SN38：
Figure BDA0003677646290000081
20.具有以下结构的20-(HCl.Gly)-SN38：
Figure BDA0003677646290000082
21.具有以下结构的20-(TFA.GABA)-SN38：
Figure BDA0003677646290000083
22.具有以下结构的20-(TFA.Hex)-SN38：
Figure BDA0003677646290000084
23.具有以下结构的20-(HCl.Val)-SN38：
Figure BDA0003677646290000091
24.具有以下结构的20-(TFA.Gly)-SN38：
Figure BDA0003677646290000092
25.具有以下结构的20-(TFA.Ala)-SN38：
Figure BDA0003677646290000093
26.具有以下结构的20-(TFA.β-Ala)-SN38：
Figure BDA0003677646290000094
27.具有以下结构的20-(TFA.Val)-SN38：
Figure BDA0003677646290000101
28.具有以下结构的20-(TFA.Leu)-SN38：
Figure BDA0003677646290000102
29.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-Gly-SN38)：
Figure BDA0003677646290000103
在某些实施方案中，化合物16中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
30.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-GABA-SN38)：
Figure BDA0003677646290000111
在某些实施方案中，化合物17中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
31.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-Hex-SN38)：
Figure BDA0003677646290000112
在某些实施方案中，化合物18中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
32.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-Val-SN38)：
Figure BDA0003677646290000121
在某些实施方案中，化合物19中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
33.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-Ala-SN38)：
Figure BDA0003677646290000131
在某些实施方案中，化合物37中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
34.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-β-Ala-SN38)：
Figure BDA0003677646290000132
在某些实施方案中，化合物38中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
35.具有以下结构的粘酸聚合物-SN38缀合物(MAP-Leu-SN38)：
Figure BDA0003677646290000141
在某些实施方案中，化合物39中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
36.包含实施方案29-35中任一项的MAP-SN38缀合物的纳米颗粒。
37.具有以下结构的20-(Boc-Gly)-CPT：
Figure BDA0003677646290000151
38.具有以下结构的20-(Boc-Val)-CPT：
Figure BDA0003677646290000152
39.具有以下结构的20-(Boc-Ala)-CPT：
Figure BDA0003677646290000153
40.具有以下结构的20-(Boc-β-Ala)-CPT：
Figure BDA0003677646290000154
41.具有以下结构的20-(Boc-GABA)-CPT：
Figure BDA0003677646290000155
42.具有以下结构的20-(Boc-Phe-Gly)-CPT：
Figure BDA0003677646290000161
43.具有以下结构的20-(TFA.Gly)-CPT：
Figure BDA0003677646290000162
44.具有以下结构的20-(TFA.Ala)-CPT：
Figure BDA0003677646290000163
45.具有以下结构的20-(TFA.β-Ala)-CPT：
Figure BDA0003677646290000164
46.具有以下结构的20-(TFA.Val)-CPT：
Figure BDA0003677646290000165
47.具有以下结构的20-(TFA.GABA)-CPT：
Figure BDA0003677646290000171
48.具有以下结构的20-(TFA.Phe-Gly)-CPT：
Figure BDA0003677646290000172
49.具有以下结构的硝基苯基硼酸-聚乙二醇缀合物(NPBA-PEG-AA)的合成方法：
Figure BDA0003677646290000173
所述方法包括：
(a)将NH2-PEG-乙酸(AA)悬浮在碱(例如，N,N'-二异丙基乙胺，DIPEA)和溶剂(例如，DCM)中；
(b)将3-羧基-5-硝基苯基硼酸溶解在溶剂混合物(例如DCM和二甲基甲酰胺(DMF))中；
(c)向(b)的溶液中加入偶联剂(例如，N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉，EEDQ)；
(d)将(a)和(c)的溶液混合；和
(e)酸化该混合物，
其中n是2至2,000范围内的数字或其间的任何整数值；例如，100至300、20至300、120至180和/或140至160。
在某些实施方案中，该反应在降低的温度下进行；例如，在0℃至20℃范围内的温度或其间的任何整数或小数值，随后在酸化和纯化之前温热至环境温度。在某些实施方案中，将混合物酸化至约4的pH。在另外的实施方案中，将该产物通过用溶剂(例如，乙酸异丙酯、iPrOAc)萃取来纯化。
在某些实施方案中，n的值使得化合物的PEG(即-CH2-CH2-O-)部分具有约2至约15kDa范围内的重均分子量；例如，约2kDa、约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa，或约15kDa。
50.具有以下结构的化合物(NPBA-PEG-AA-PFP)：
Figure BDA0003677646290000181
在某些实施方案中，n是2至2,000范围内的数字或其间的任何整数值；例如，100至300、20至300、120至180和/或140至160。
在某些实施方案中，n的值使得化合物的PEG(即-CH2-CH2-O-)部分具有约2至约15kDa范围内的重均分子量；例如，约2kDa、约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa，或约15kDa。
51.制备实施方案50的化合物的方法，该方法包括：
将实施方案49的NPBA-PEG-AA与双(五氟苯基)碳酸酯和碱催化剂(例如，N-甲基吗啉)结合。
52.合成NPBA-PEG-转铁蛋白缀合物的方法，该方法包括：
将实施方案50的NPBA-PEG-AA-PFP与全铁转铁蛋白(即铁结合的转铁蛋白)结合。
53.合成NPBA-PEG-曲妥珠单抗缀合物的方法，该方法包括：
将实施方案50的NPBA-PEG-AA-PFP与曲妥珠单抗结合。
54.合成NPBA-PEG-治疗性多肽缀合物的方法，该方法包括：
将实施方案50的NPBA-PEG-AA-PFP与治疗性多肽结合。
55.具有以下结构的SN38的20-Boc-氨基酰基-10-TBDPS衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-10-TBDPS-SN38)：
Figure BDA0003677646290000191
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
56.实施方案55的20-Boc-氨基酰基-10-TBDPS SN38衍生物，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)和己酸的官能团。
57.具有以下结构的SN38的20-Boc-氨基酰基-10-Oboc衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc-SN38)：
Figure BDA0003677646290000192
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
58.实施方案57的20-Boc-氨基酰基-10-Oboc SN38衍生物，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的官能团。
59.具有以下结构的SN38的20-氨基酰基衍生物的HCl盐(20-(HCl.氨基酰基)-SN38)：
Figure BDA0003677646290000201
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
60.实施方案59的HCl盐，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸和缬氨酸的官能团。
61.具有以下结构的SN38的20-氨基酰基衍生物的三氟乙酸(TFA)盐(20-(TFA.氨基酰基)-SN38)：
Figure BDA0003677646290000202
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
62.实施方案61的TFA盐，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA、己酸和亮氨酸的官能团。
63.具有以下结构的粘酸聚合物(MAP)-氨基酸-SN38缀合物：
Figure BDA0003677646290000211
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
在某些实施方案中，MAP-氨基酸-SN38缀合物中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
64.实施方案63的MAP-氨基酸-SN38缀合物，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA、己酸和亮氨酸的官能团。
65.包含实施方案63或64中任一项的MAP-氨基酸-SN38缀合物的纳米颗粒。
66.具有以下结构的喜树碱的20-Boc-氨基酰基衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-CPT)：
Figure BDA0003677646290000221
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
67.实施方案66的20-(Boc-氨基酰基)CPT衍生物，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团。
68.具有以下结构的CPT的20-氨基酰基衍生物的三氟乙酸(TFA)盐(20-(TFA.氨基酰基)-CPT)：
Figure BDA0003677646290000222
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。
69.实施方案68的TFA盐，其中该氨基酸官能团选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团。
70.具有以下结构的粘酸聚合物(MAP)-氨基酸-CPT缀合物：
Figure BDA0003677646290000231
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。术语“R为氨基酸的一个或多个α-碳原子”反映了上述结构中的-NH-R-CO2-(即，该结构的SN38部分和MAP/PEG部分之间的连接基)代表氨基酸的事实。“一个或多个”反映了该连接基可以包含多于一个氨基酸的事实；即，该连接基可以是二肽、三肽或寡肽。在某些实施方案中，该氨基酸官能团选自丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团。
在某些实施方案中，MAP-氨基酸-CPT缀合物中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
71.包含实施方案70的MAP-氨基酸-CPT缀合物的纳米颗粒。
发明详述
通过参考以下结合所附实施例的描述，可以更容易地理解本公开，所有这些都构成本公开的一部分。应当理解，本公开不限于本文描述或显示的具体产物、方法、条件或参数，并且本文使用的术语仅用于通过示例描述具体实施方案的目的，并不旨在限制任何要求保护的发明。类似地，除非另有特别说明，关于可能的作用机制或模式或改进原因的任何描述仅是说明性的，并且本文的公开不受任何此类建议的作用机制或模式或改进原因的正确性或不正确性的限制。在整个文本中，应认识到描述涉及组合物以及制备和使用所述组合物的方法。即，在本公开描述或要求保护与组合物或制备或使用该组合物的方法相关的特征或实施方案的情况下，应当理解，这样的描述或权利要求旨在将这些特征或实施方案扩展到这些上下文中的每一个中的实施方案(即，组合物、制备方法和使用方法)。
在本公开中，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定，对特定数值的引用至少包括该特定值。因此，例如，对“物料”的提及是对本领域技术人员已知的此类物料及其等价物中的至少一种的提及。
当通过使用描述符“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施方案。一般而言，术语“约”的使用表示可以根据所公开的主题寻求获得的期望性质而变化的近似值，并且将基于其功能在使用它的具体上下文中进行解释。本领域技术人员将能够将此解释为惯例。在某些情况下，用于特定值的有效数字的数量可能是确定“约”一词范围的一种非限制性方法。在其他情况下，在一系列值中使用的等级可用于确定每个值的术语“约”可用的预期范围。在存在的情况下，所有范围均包含在内且可组合。也就是说，对范围中所述值的引用包括该范围内的每个值。
应当理解，为了清楚起见，本文在单个实施方案的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方案中以组合的方式提供。也就是说，除非明显不相容或明确排除，否则每个单独的实施方案都被认为可以与任何其他实施方案组合，并且这种组合被认为是另一个实施方案。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独提供或以任何子组合来提供。最后，虽然实施方案可以被描述为一系列步骤的一部分或更一般结构的一部分，但是每个所述步骤本身也可以被认为是独立的实施方案，可以与其他实施方案组合。
过渡术语“包括(comprising)”、“基本上由......组成”和“由......组成”意图包含它们的在专利行话中的被普遍接受的含义；即，(i)与“包括(including)”、“包含(containing)”或“以......为特征”同义的“包括(comprising)”是包括端点的或开放式的并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤；(ii)“由......组成”排除未在权利要求中指定的任何要素、步骤或成分；并且(iii)“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的物料或步骤以及“不实质上影响要求保护的发明的基本特征和新颖特征的那些物料或步骤”。在措辞“包括”(或其等同物)的方面所描述的实施方案还提供在“由......组成”和“基本上由......组成”的方面独立地描述的那些作为实施方案。对于以“基本上由...组成”的措词提供的那些实施方案，基本的且新颖的特性是制备和使用本发明物料的方法(以及在这些方法中使用的体系和由此衍生的组合物)的简便可操作性以及物料本身，其中该方法和物料能够仅使用权利要求中提供的要素来提供突出的特性。也就是说，虽然本发明的组合物中还可以存在其他物料，但这些额外物料的存在对于提供那些组合物的所述益处(即效果可能是累加的)不是必需的和/或这些额外物料不损害产品组合物的性能。类似地，在方法中还可以使用额外步骤的情况下，它们的存在对于实现所述效果或益处不是必需的和/或它们不损害所述效果或益处。
除非另有说明，当列出一个列表时，应理解该列表的每个单独要素以及该列表的每个组合都是单独的实施方案。例如，表示为“A、B或C”的实施方案列表将被解释为包括实施方案“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或“A、B或C”。同样地，作为单独的实施方案，术语例如C1-3烷基也包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C1-2烷基和C2-3烷基。
如相关领域的技术人员将理解的，贯穿本说明书，词语将被赋予其正常含义。然而，为了避免误解，将对某些术语的含义进行特定定义或澄清。
提及的醇、醛、胺、羧酸、酮或其他类似的反应性官能团也包括它们的被保护的类似物。例如，提及的羟基或醇还包括其中羟基被以下保护的那些取代基：乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn、Bnl)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基(三苯基甲基、Tr)、甲硅烷基醚(最常用的包括三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、乙氧基乙基醚(EE)。提及的胺还包括其中胺被以下保护的那些取代基：BOC甘氨酸、苯甲氧甲酰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)、叔丁氧基羰基(BOC)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、氨基甲酸酯、对甲氧基苄基(PMB)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)基团或磺酰胺(Nosyl&Nps)基团。提及的含有羰基的取代基还包括其中羰基被以下保护的那些取代基：缩醛或缩酮、乙酰缩醛(acylal)或diathane。提及的含有羧酸或羧酸酯基团的取代基还包括其中羧酸或羧酸酯基团被以下保护的那些取代基：其甲酯、苄酯、叔丁酯、2,6-二取代的苯酚(例如2,6-二甲基苯酚、2,6-二异丙基苯酚、2,6-二叔丁基苯酚)的酯、甲硅烷基酯、原酸酯或噁唑啉。
缩写
AA：乙酸
ACN：乙腈
Ala：丙氨酸,丙氨酰基
ARS：茜素红S
Asp：天冬氨酸盐,天冬氨酸
β-Ala：β-丙氨酸,β-丙氨酰基
BBB：血脑屏障
Boc：叔丁氧基羰基
BTB：血肿瘤屏障
CPME：环戊基甲基醚
CPT：喜树碱
CV：柱体积
DCM：二氯甲烷
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺
DIPEA：N,N’-二异丙基乙胺
diSPA-PEG：二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)-PEG
DMA：二甲基乙酰胺
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
EDC.HCl：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
EEDQ：N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉
EtOAc：乙酸乙酯
GABA：γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酰基
Gly：甘氨酸,甘氨酰基
GPC：凝胶渗透色谱法
HBSS：Hank’s平衡盐溶液
HCl：盐酸
Hex：6-氨基己酸
HIC：疏水相互作用色谱法
HOPO：羟基吡啶N-氧化物
IPA：异丙醇
iPrOAc：乙酸异丙酯
MAM：可聚合的粘酸单体
MAP：粘酸聚合物
MeOH：甲醇
MTBE：甲基叔丁基醚
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
NP(或P)：纳米颗粒
NPBA：3-羧基-5-硝基苯基硼酸
Mono-NPBA-PEG-Tf：转铁蛋白的单-聚乙二醇化的部分
Mono-NPBA-PEG-Tras：曲妥珠单抗的单-聚乙二醇化的部分
PEO：聚环氧乙烷
PBS：磷酸盐缓冲溶液
PEG：聚乙二醇
PES：聚醚砜
PFP：五氟苯基
PyAOP：(7-氮杂苯并***-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
SN38：7-乙基-10-羟基-喜树碱
SpP：每个颗粒的链数
TBDPS：叔丁基二苯基甲硅烷；叔丁基二苯基甲硅烷基
TBDPSCl：叔丁基二苯基氯硅烷
TEA：三乙胺
Tf：全铁转铁蛋白
TFA：三氟乙酸盐,三氟乙酸
THF：四氢呋喃
Tras：曲妥珠单抗
UF/DF：超滤和渗滤
Val：缬氨酸,缬氨酰基
反应成分
本文所述的操作包括本领域已知的标准溶剂和催化剂。尽管在本公开中列举了特定的化合物(例如，酸、碱、偶联剂)，但是本领域技术人员清楚可以使用不同的试剂。
为此，示例性溶剂包括但不限于氯化溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷)、醚类(例如***、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、二甘醇二甲醚、1,4-二噁烷、2-甲基四氢呋喃)、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇)、烷烃类(例如戊烷、己烷、庚烷)、二醇类(例如乙二醇、聚乙二醇)、极性非质子溶剂(例如二甲基乙酰胺、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮)和极性质子溶剂(例如水、乙醇、乙酸、丙酸)。
示例性的酸包括但不限于无机酸(例如，盐酸、硝酸、磷酸、硫酸)和有机酸(例如，乙酸、丙二酸、甲磺酸、丙酸、硫代乙酸、对甲苯磺酸、三溴乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸)。
示例性的碱包括但不限于氨基碱(例如1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、氨基锂、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂、吗啉、哌啶)、醇盐(例如叔丁醇钡、叔丁醇锂、甲醇钠)、氢氧化物(例如四丁基氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾)、有机金属碱(例如正丁基锂、叔丁基锂、丁基氯化镁)、吡啶(例如4-二甲基氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶、吡啶)、碳酸盐(例如碳酸锂、碳酸钠、碳酸镁、碳酸钾)和氢化物(例如氢化钠、氢化钙、氢化钾)。
示例性的偶联剂包括但不限于碳二亚胺试剂(例如，N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环戊基碳二亚胺)、碳二亚胺试剂添加剂(例如，1-羟基-7-氮杂苯并***、6-氯-1-羟基苯并***、N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基-2-吡啶酮、6-氯-N-羟基-2-苯基苯并咪唑、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯)、基于酸酐或形成试剂(例如碳酸二叔丁酯、乙酸酐、2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉、氯甲酸乙酯)、酰基唑类(acylazoles)(例如羰基二咪唑)、酰卤生成试剂(例如亚硫酰氯、光气、氰尿酰氯、苄基三苯基二氢三氟化鏻)、鏻盐偶联试剂(例如苯并***-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐)、四甲基胺鎓(aminium)试剂(例如，2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、胺鎓(aminium)试剂(例如，2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓六氟磷酸盐)、oxyma脲鎓(uranium)盐(例如，1-((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)(吗啉代)亚甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸盐)、锑酸鎓(antimonate uranium)盐(例如，苯并***-1-基氧-N,N-二甲基-甲亚胺鎓六氯锑酸盐)，有机磷试剂(例如，氰基磷酸二乙酯、1-氧代-氯代膦烷、2-丙烷膦酸酐)，基于三嗪的试剂(例如，2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)，有机硫试剂(例如4-硝基苯磺酸五氟苯酯)，吡啶鎓试剂(例如，2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物)，聚合物结合的试剂(例如，聚合物负载的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉)。
可聚合粘酸单体(MAM)的合成
本文特别提供了用于合成粘酸的可聚合衍生物(“粘酸单体”或MAM)的方法。在第一阶段，粘酸与甲醇(MeOH)在硫酸存在下反应形成粘酸的1,6-二甲基二酯(化合物1)。然后将该二酯与N-Boc-乙二胺在三乙胺(TEA)和MeOH存在下反应形成N-Boc-保护的粘酸乙二胺(化合物2)。
在制备规模生产N-Boc-保护的粘酸乙二胺的替代方法中，将粘酸与MeOH在硫酸存在下反应生成甲氧基化的粘酸衍生物，然后在TEA和MeOH中将该甲氧基化的粘酸与N-(2-氨基乙基)(叔丁氧基)甲酰胺反应，生成N-Boc-保护的粘酸二胺。参见实施例24。
以前的方法在两个单独的反应中进行了第一阶段(即，将粘酸转化为N-Boc-保护的粘酸乙二胺)；首先形成二酯，纯化该二酯，然后将分离的二酯转化为N-Boc-保护的粘酸乙二胺。参见例如美国专利号10,166,291；和美国专利申请公开号2019/0381188(2019年12月19日)。在本文所述的方法中，粘酸向N-Boc-保护的粘酸乙二胺的转化在单一反应中完成。参见实施例1。
前述实施方案中的两个或更多个的任何和所有组合也被设想为本文所公开的本发明的另外的实施方案。
在下一阶段，通过与MeOH和HCl反应，从N-Boc-保护的粘酸乙二胺中除去Boc保护基。这将N-Boc-保护的粘酸乙二胺转化为粘酸乙二胺氯化物(化合物3)。参见实施例2。实施例25中提供了通过与MeOH和HCl反应制备粘酸乙二胺氯化物(粘酸二氨基氯化物)的替代的制备规模的方法。
在下一阶段，通过在羟基吡啶N-氧化物(HOPO)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和乙腈(ACN)存在下使粘酸二氨基氯化物与Boc-L-天冬氨酸4-叔丁酯反应将粘酸乙二胺氯化物转化为粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)(化合物4)。参见实施例3。在15℃至90℃范围内的温度下，反应时间可以为5分钟至48小时。在以前的方法中，在ACN和吡啶的存在下使粘酸乙二胺与二(天冬氨酰基(O-苄基)-Boc)反应，导致添加二(天冬氨酰基(O-苄基)-Boc)保护基(参见，例如美国专利申请公开号2019/0381188(2019年12月19日))，而不是本文公开的方法中使用的二(天冬氨酰基(O-叔丁基)-Boc)保护基。因此，本文所述的方法使用新的试剂(HOPO和DIC代替吡啶)和不同的保护基(O-叔丁基代替O-苄基)。与先前方法中使用的苄基相比，本方法中使用的叔丁基保护基的优点是可以用HCl或三氟乙酸(TFA)除去叔丁基保护基。因此，在合成的下一阶段，两个保护基(叔丁基和Boc)都可以用单一试剂(例如，TFA或HCl)去除。
在制备规模上合成粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)的另一种方法是在二氯甲烷(DCM)中通过添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)诱导使得Boc-L-天冬氨酸4-叔丁酯与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(Oxyma)反应。然后将该混合物在碳酸钠水溶液中与粘酸二氨基氯化物(化合物3)结合。粗产物通过加入ACN进行浓缩和结晶，同时蒸馏掉水相。参见实施例26。
前述实施方案中的两个或更多个的任何和所有组合也被设想为本文所公开的本发明的另外的实施方案。
在粘酸可聚合的单体合成的最后阶段，在DCM存在下，通过使粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)与TFA反应将粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)转化为粘酸二(天冬氨酰胺)(化合物5)。参见实施例4。在15℃至90℃的温度范围内，反应时间可以在5分钟至96小时的范围内。以前的方法(参见例如，美国专利申请公开号2019/0381188(2019年12月19日))需要两个步骤才能进行此转换；首先将粘酸二(Asp(O-苄基)-Boc)转化为粘酸二(Asp(O-苄基)-胺)；然后将粘酸二(Asp(O-苄基)-胺)转化为粘酸二(Asp-胺)。在本文所述的方法中使用叔丁基和Boc保护基；代替如前所述的O-苄基和Boc保护基，允许在水溶液或有机溶液中一步去除两个保护基；并且避免了均相或多相氢化的需要。
对于制备规模的应用，将粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)转化为粘酸二(天冬氨酰胺)中性物质(化合物20)，进而又将其转化为粘酸二(天冬氨酰胺)的二-TFA盐(化合物5)。在这些实施方案中，在DCM和水中将粘酸二(天冬氨酰(O-叔丁基)-Boc)与TFA和三异丙基硅烷反应，并且可以任选地使用四氢呋喃(THF)进一步重结晶以形成粘酸单体中性物质(20)。参见实施例27。然后在DCM和水中将中性粘酸单体与TFA反应，然后与化合物5的晶种在***中的溶液结合以沉淀MAM-二TFA盐(5)。参见实施例28。
前述实施方案中的两个或更多个的任何和所有组合也被设想为本文所公开的本发明的另外的实施方案。
粘酸聚合物的合成(MAP)
本文尤其提供了用于合成粘酸的聚合物(“粘酸聚合物”或MAP)的方法。在某些实施方案中，在溶剂(例如二甲亚砜、DMSO)中将二TFA-粘酸二(天冬氨酰胺)(MAM,化合物5)与二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)-PEG(diSPA-PEG)(例如，diSPA-PEG3.5k)结合，加入碱(例如，N,N'-二异丙基乙胺,DIPEA)，反应在15℃至70℃的温度范围内(例如，35℃)进行，时间为1小时至96小时(例如，66小时)。在获得所需的聚合物长度(通常在10kDa至120kDa的范围内)后，将反应混合物用DMSO透析，用水透析，过滤得到MAP(化合物6)。
Figure BDA0003677646290000311
通过调节MAM与diSPA-PEG的摩尔比来控制聚合物的分子量；在1:1的反应物摩尔比下获得最高分子量。随着MAM与diSPA-PEG的摩尔比变得大于或小于1，所得聚合物的分子量变得更低。在我们的实施例中，分子量的进一步降低与MAM与diSPA-PEG比率的增加相关。参见实施例29。
在某些实施方案中，化合物6中的x是20至200范围内的数字，并且y是5至200范围内的数字(或它们之间的任何整数值；例如，10至150、20至120、50至100、或10至25)。在某些实施方案中，选择x以提供约500Da至约50,000Da范围内的聚合物的PEG部分(即-O-CH2-CH2-)的数均分子量。
在某些实施方案中，MAP的重均分子量在5至150kDa的范围内或其间的任何整数值，例如20至120kDa，并且相应地选择x和y的值。
在另外的实施方案中，选择x和y的值使得在将MAP或药物偶联的MAP组装成纳米颗粒后，纳米颗粒的尺寸在10至900nm的范围内或其间的任何整数值，例如，100至800nm、200至500nm、400至700nm或20至100nm。
在一些实施方案中，本文所述的方法使用包含本文所述的纳米颗粒核心的靶向纳米颗粒进行，所述纳米颗粒核心与本文所述的任何一种靶向剂和本文所述的任何一种化疗剂偶联，其中靶向纳米颗粒的总尺寸为约20nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约90nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约80nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约70nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约60nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约40nm至约50nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约50nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约50nm至约90nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约60nm至约80nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约50nm至约70nm。在一些实施方案中，靶向纳米颗粒的尺寸为约70nm至约100nm。
在某些实施方案中，该溶剂为例如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMA)。
在某些实施方案中，升高的温度是20℃至40℃范围内的任何温度；即20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
可以使用各种孔隙率的膜进行透析，例如可以使用具有1kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa的截留分子量的膜。
前述实施方案中的两个或更多个的任何和所有组合也被设想为本文所公开的本发明的另外的实施方案。
聚合物分子量的测定
MAP的分子量测定通过凝胶过滤色谱法(例如Malvern OMNISEC凝胶渗透色谱法(GPC)***)使用聚环氧乙烷(PEO)标准进行。色谱装置可以包括例如溶剂输送泵、脱气器、自动进样注射器、柱隔室、折射率检测器和光散射检测器。
例如，通过将MAP溶解在浓度为1至5mg/mL的0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备样品，然后通过例如0.45微米(0.45μm孔径)过滤器过滤样品。将100μL过滤样品连同PEO分子量标准注入凝胶过滤或凝胶渗透柱(例如，2×Agilent PL Aquagel-OH 40柱；300mm长×7.5mm直径；8μm粒径)，流动相为PBS+0.02％叠氮化钠，流速为例如0.7mL/分钟，柱温为例如30℃。通过示差折射率和/或光散射检测峰级分，并使用例如MalvernOMNISEC软件进行分析。
喜树碱(CPT)及其衍生物、代谢物和类似物
本公开尤其提供用于制备CPT的选择性反应性衍生物及其衍生物、代谢物和类似物的方法和组合物。通常，这些分子包含五个稠合芳环，其中一个或多个环是杂芳环，并含有一个或多个侧羟基，如下图所示，其显示了CPT的结构。
Figure BDA0003677646290000331
这些类别中的示例性分子包括拓扑替康、伊立替康、silatacan、可司替康、依沙替康、勒托替康、吉马替康、贝洛替康、芦比替康、SN38、二氟替康、karenitecan、那米替康、依洛替康、德莫替康、吉米替康(chimmitecan)、ZBH-1205、DRF-1042和FL118。
用于连接MAP的衍生的7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)
先前描述的用于治疗脑癌和脑转移瘤的纳米颗粒利用CPT作为治疗分子。然而，如上所述，更可溶的CPT衍生物，例如SN38，提供更高的治疗指数和更低的毒性。因此，本公开尤其提供了用于合成具有聚合粘酸主链的纳米颗粒的方法，该主链连接有多个SN38分子。为此，本公开提供了用于合成多种SN38的衍生变体的方法和组合物，这些衍生变体能够与上述MAP共价连接。
因此，本文特别提供了用于合成化学治疗分子SN38的反应性衍生物的方法。该方法涉及通过SN38羟基将许多不同的基于氨基酸的连接基分子连接到SN38分子。SN38和其他CPT衍生物具有两个羟基：一个10-羟基和一个20-羟基。20-羟基的共轭稳定了这些分子的活性内酯形式；减少或防止它们在给药于受试者后转化为活性较低的羧酸盐形式；然而，10-羟基也是反应性的。
在本文所述的方法中，SN38的10-羟基首先被阻断反应性(即，被保护)；然后将连接基添加到20-羟基上。示例性氨基酸连接基包括甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、戊酸、己酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、色氨酸以及二肽(例如苯丙氨酸-甘氨酸)、三肽和寡肽。
本文提供了用于将许多不同连接基连接至SN38的20-羟基的方法。在与SN38的20-羟基基团偶联后，本文示例的每种不同的连接基(例如甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸和6-氨基己酸；以及其他如二肽苯丙氨酸-甘氨酸)能够与MAP的羧基反应(通过连接基的胺基和聚合物的羧基之间的酰胺化反应)，从而将SN38分子共价连接至MAP。每种不同的连接基具有不同的稳定性并影响所得纳米颗粒的性质(例如尺寸、密度)，这尤其影响SN38在穿过血脑屏障(BBB)或血肿瘤屏障(BTB)后从纳米颗粒释放的速率。
10-羟基保护的SN38(10-TBDPS-SN38)的合成
在衍生的SN38合成的初始步骤中，通过在DCM和三乙胺中将SN38和叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPS)混合，将叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)保护基添加到SN38的10-羟基上(以阻止该位点的反应性)。将混合物在搅拌下回流(例如，在45℃)大约16小时，然后用HCl(例如，0.2N)、饱和的NaHCO3和盐水洗涤；并最后用MgSO4干燥并真空蒸发。将产物(10-TBDPS-SN38，化合物7)溶解在DCM中，用己烷沉淀并干燥固体。
TBDPS保护基对SN38的10-羟基具有选择性(使20-OH基团在后续步骤中自由反应)，所得化合物在储存过程中不易自发失去保护基；从而提供更稳定的中间体。
使用TBDPS保护SN38的10-OH基团的另一个优点是，它可以在与从连接到20-OH基团的连接基上去除Boc保护基的条件相同的条件(1M-12M HCl或水：TFA在1:1至1:4v/v之间)下去除。
用被保护的20-羟基甘氨酸连接基合成10-羟基保护的SN38
通过在DCM中于0℃将10-TBDPS-SN38与Boc-Gly-OH结合，将被保护的甘氨酸(Gly)连接基添加到10-TBDPS-SN38的20-羟基位置。加入EDC.HCl和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，并将混合物在0℃搅拌。搅拌可以持续0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时或其间的任何间隔。搅拌后，将混合物用0.5％NaHCO3洗涤两次，用水洗涤一次，用0.1N HCl洗涤两次，用盐水洗涤一次。将该溶液干燥(例如用MgSO4)，并在真空下蒸发以生成20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38(化合物8)。
20-(HCl.Gly)-SN38的合成
在室温下，通过在己烷层下用HCl(浓度范围为1N至12N)处理将20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38的10-羟基和20-羟基脱保护。由此生成SN38衍生物，其中将10-羟基基团恢复，甘氨酸连接基与20-羟基基团共价连接(20-(HCl.Gly)-SN38，化合物12)。
用被保护的20-羟基GABA连接基合成10-羟基保护的SN38
通过在DCM中于0℃将10-TBDPS-SN38与Boc-GABA-OH结合，将被保护的γ-氨基丁酸(GABA)连接基添加到10-TBDPS-SN38的20-羟基位置。加入EDC.HCl和DMAP，并将混合物在0℃搅拌。搅拌可以持续0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时或其间的任何间隔。搅拌后，将混合物用0.5％NaHCO3洗涤两次，用水洗涤一次，用0.1N HCl洗涤两次，用盐水洗涤一次。将该溶液干燥(例如用MgSO4)，并在真空下蒸发以生成20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38(化合物9)。
20-(TFA.GABA)-SN38的合成
在室温下，通过在己烷层下用TFA的水溶液(浓度范围为1:1至4:1v/v)处理将20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38的10-羟基和20-羟基脱保护。由此生成SN38衍生物，其中将10-羟基基团恢复，GABA连接基与20-羟基基团共价连接(20-(TFA.GABA)-SN38,化合物13)。
用被保护的20-羟基己酸连接基合成10-羟基保护的SN38
通过在DCM中于0℃将10-TBDPS-SN38与Boc-Hex-OH结合，将被保护的6-氨基己酸(Hex)连接基添加到10-TBDPS-SN38的20-羟基位置。加入EDC.HCl和DMAP，并将混合物在0℃搅拌。搅拌可以持续0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时或其间的任何间隔。搅拌后，将混合物用0.5％NaHCO3洗涤两次，用水洗涤一次，用0.1N HCl洗涤两次，用盐水洗涤一次。将该溶液干燥(例如用MgSO4)，并在真空下蒸发以生成20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38(化合物10)。
20-(TFA.Hex)-SN38的合成
在室温下，通过在己烷层下用TFA的水溶液(浓度范围为1:1至4:1v/v)处理将20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38的10-羟基和20-羟基脱保护。由此生成SN38衍生物，其中将10-羟基基团恢复，Hex连接基与20-羟基基团共价连接(20-(TFA.Hex)-SN38,化合物14)。
用被保护的20-羟基缬氨酸连接基合成10-羟基保护的SN38
通过在DCM中于0℃将10-TBDPS-SN38与Boc-Val-OH结合，将被保护的缬氨酸(Val)连接基添加到10-TBDPS-SN38的20-羟基位置。加入EDC.HCl和DMAP，并将混合物在0℃搅拌。搅拌可以持续0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时或其间的任何间隔。搅拌后，将混合物用0.5％NaHCO3洗涤两次，用水洗涤一次，用0.1N HCl洗涤两次，用盐水洗涤一次。将该溶液干燥(例如用MgSO4)，并在真空下蒸发以生成20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38(化合物11)。
20-(HCl.Val)-SN38的合成
在室温下，通过在己烷层下用HCl(浓度范围为1N至12N)处理将20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38的10-羟基和20-羟基脱保护。由此生成SN38衍生物，其中将10-羟基基团恢复，缬氨酸连接基与20-羟基基团共价连接(20-(HCl.Val)-SN38,化合物15)。
在SN38的10-和20-OH基团上使用相同的保护基
用氨基酸连接基合成SN38的反应性衍生物的另一种途径是将Boc-O保护基置于10-OH基团上，并将Boc-氨基酸保护基置于20-OH上。当该化合物(20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc-SN38)与TFA反应时，10-OH基团被恢复，并且氨基酸连接基的TFA盐与20-OH连接。使用该方法合成了SN38的20-Boc-甘氨酰基、-丙氨酰基、-β-丙氨酰基、-亮氨酰基和-缬氨酰基衍生物。参见下文和实施例33-35。可用于该方法的其他氨基酸包括GABA、异亮氨酸和己酸，以及二肽例如苯丙氨酸-甘氨酸。
Figure BDA0003677646290000371
Figure BDA0003677646290000381
聚合物-药物缀合物的合成
本文特别提供了通过将衍生的SN38共价连接至MAP来形成聚合物-药物缀合物(即，MAP-连接基-SN38纳米颗粒)的方法。提供了许多不同的缀合物，它们在聚合物和药物之间的连接基的性质(即大小和化学性质)方面有所不同。不同的缀合物是通过使用已用各种类型的连接基衍生的SN38制备的。在一个实施方案中，该连接基为甘氨酰基(Gly)部分。在一个实施方案中，该连接基为缬氨酰基(Val)部分。在一个实施方案中，该连接基为γ-氨基丁酸(GABA)部分。在一个实施方案中，该连接基为6-氨基己酸(Hex)部分。在一个实施方案中，该连接基为丙氨酰基(Ala)部分。在一个实施方案中，该连接基为β-丙氨酰基(β-Ala)部分。在一个实施方案中，该连接基为亮氨酰基(Leu)部分。
为了形成聚合物-药物缀合物，将MAP溶解在DMSO中，然后加入EDC.HCl和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。加入EDC.HCl和NHS后，加入衍生的SN38和DIPEA，将该混合物在室温下搅拌约18小时。衍生的SN38可为例如20-(HCl.Gly)-SN38、20-(HCl.Val)-SN38、20-(TFA.GABA)-SN38、20-(TFA.Hex)-SN38、20-(TFA.Gly)-SN38、20-(TFA.Ala)-SN38、20-(TFA.β-Ala)-SN38、20-(TFA.Val)-SN38或20-(TFA.Leu)-SN38。接下来将该反应混合物用DMSO进行透析，然后用水在pH 4下使用10kDa膜进行透析。将透析的产物过滤(例如，通过0.22μm过滤器)、冷冻并冻干。根据所使用的衍生的SN38，产物为MAP-Gly-SN38(化合物16)；MAP-GABA-SN38(化合物17)、MAP-Hex-SN38(化合物18)、MAP-Val-SN38(化合物19)、MAP-Ala-SN38(化合物37)、MAP-β-Ala-SN38(化合物38)或MAP-Leu-SN38(化合物39)。
纳米颗粒的形成
为了将聚合物-药物缀合物(即化合物16、17、18或19、37、38或39中的任何一种)转化为纳米颗粒，将冻干的聚合物-药物缀合物溶解在pH 4的水中，浓度为1-10mg/mL(例如，4mg/mL)。然后过滤该溶液，并可冷冻直至进一步使用。
纳米颗粒的尺寸范围为约20至约60nm的直径。示例性纳米颗粒直径为15nm、16nm、17nm、18nm、19、nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm或更大。
由纳米颗粒体外释放SN38
当浓度为0.1mg SN38/mL的纳米颗粒在37℃的PBS中在pH为6.5、7.0或7.4的加湿烘箱中孵育时，从MAP-Gly-SN38、MAP-GABA-SN38、MAP-Hex-SN38、MAP-Val-SN38、MAP-Ala-SN38、MAP-β-Ala-SN38和MAP-Leu-SN38纳米颗粒释放SN38均表现出一级动力学。观察到释放速率与pH值有很强的依赖性。随着pH从6.5增加到7.4，所有纳米颗粒制剂的释放半衰期均降低，表明水解在SN38的释放中起重要作用。对于具有更多疏水性和空间位阻的连接基的纳米颗粒，观察到更长的半衰期。
用于连接MAP的衍生的CPT
在某些实施方案中，本公开提供了含有CPT作为治疗剂的纳米颗粒。与氨基酸偶联的CPT衍生物(例如，20-(TFA.Gly)-CPT)用于合成所述纳米颗粒。示例性氨基酸连接基包括甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、戊酸、己酸以及二肽(例如，苯丙氨酸-甘氨酸)、三肽和寡肽。
20-(TFA.Gly)-CPT分两步合成。在第一步中，在惰性气氛下(例如，在氩气下)，将CPT与Boc-Gly-OH在DMAP中结合，然后通过添加DCM将反应物制成浆液。然后在几分钟的过程中将DIC滴加到反应混合物中，随后在室温下将混合物搅拌几个小时(例如3小时)。然后在真空下除去大约一半的溶剂，并加入冷冻的MeOH以沉淀产物(20-(Boc-Gly)-CPT,化合物21)，将其通过过滤获得。用冷冻的MeOH和冷冻的甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤固体并在真空下干燥。参见实施例30。
在第二步中，将TFA逐步添加到搅拌下的20-(Boc-Gly)-CPT在DCM中的悬浮液中，并将混合物搅拌数小时(例如，2小时)。然后用MTBE沉淀产物(20-(TFA.Gly)-CPT,化合物22)，过滤，洗涤并在真空下干燥。参见实施例31。
可以通过使用其他Boc-保护的氨基酸(或肽)代替Boc-Gly-OH来制备其他CPT衍生物。例如，使用Boc-Ala-OH作为起始物料，得到20-(Boc-Ala)-CPT(化合物41)和20-(TFA.Ala)-CPT(化合物45)。使用Boc-β-Ala-OH作为起始物料，得到20-(Boc-β-Ala)-CPT(化合物42)和20-(TFA.β-Ala)-CPT(化合物46)。使用Boc-Val-OH作为起始物料，得到20-(Boc-Val)-CPT(化合物40)和20-(TFA.Val)-CPT(化合物47)。使用Boc-GABA-OH作为起始物料，得到20-(Boc-GABA)-CPT(化合物43)和20-(TFA.GABA)-CPT(化合物48)。使用Boc-Phe-Gly-OH作为起始物料，得到20-(Boc-Phe-Gly)-CPT(化合物44)和20-(TFA.Phe-Gly)-CPT(化合物49)。
CPT-聚合物缀合物的合成
在某些实施方案中提供了CPT和MAP的缀合物。为了合成这些缀合物，在惰性气氛中(例如在氩气下)将MAP和20-(TFA.氨基酰基)-CPT(对于CPT的示例性氨基酸和肽衍生物，请参见前面的部分)溶解在DMSO中。在单独的容器中，将(7-氮杂苯并***-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)溶解在DMSO中。然后将PyAOP溶液添加到MAP/20-(TFA.氨基酰基)-CPT溶液中并搅拌几分钟(例如2分钟)，然后添加DIPEA并将反应混合物在黑暗中在室温下搅拌12-24小时(例如，18小时)。将产物用冷的(0-4℃)乙酸乙酯(EtOAc)沉淀(任选分几批)，并用冷的EtOAc洗涤。产物可以通过冷冻干燥进一步分离。参见实施例32。
硝基苯基硼酸(NPBA)-聚乙二醇(PEG)缀合物
在某些实施方案中，大分子例如靶向(导向)分子或大分子治疗剂(例如，抗体)通过硝基苯基硼酸-聚乙二醇(NPBA-PEG)连接基与MAP相连。这样的NPBA-PEG连接基可以通过将PEG的胺衍生物(例如PEG3.5k,PEG5k)与NPBA的羧基衍生物组合以形成通过酰胺键连接的NPBA-PEG-乙酸(AA)缀合物来合成。在某些实施方案中，该PEG衍生物在一个末端包含氨基(用于与NPBA反应)并且在相反的末端包含羧基(在随后的反应中，它可以被激活以与大分子例如多肽反应)。参见实施例36。
Figure BDA0003677646290000411
在某些实施方案中，n是2至2,000范围内的数字或其间的任何整数值；例如，100至300、20至300、120至180、或140至160。
在某些实施方案中，n的值使得化合物的PEG(即-CH2-CH2-O-)部分具有约2至约15kDa范围内的重均分子量；例如，约2kDa、约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa，或约15kDa。
通过形成五氟苯基(PFP)衍生物来激活NPBA-PEG-AA缀合物以与多肽(例如转铁蛋白)反应。在这些实施方案中，将双(五氟苯基)碳酸酯与NPBA-PEG-AA缀合物结合以形成NPBA-PEG-五氟苯基酯(例如，NPBA-PEG5k-AA-PFP)。参见实施例37。
Figure BDA0003677646290000421
在某些实施方案中，n是2至2,000范围内的数字或其间的任何整数值；例如，100至300、20至300、120至180和/或140至160。
在某些实施方案中，n的值使得化合物的PEG(即-CH2-CH2-O-)部分具有约2至约15kDa范围内的重均分子量；例如，约2kDa、约3kDa、约4kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa，或约15kDa。
包含导向(靶向)分子的聚合物缀合物
在某些实施方案中，如本文所述的MAP包含导向(或靶向)分子以代替小分子治疗剂(例如CPT或SN38)或除了小分子治疗剂(例如CPT或SN38)之外还包含导向(或靶向)分子。靶向分子是本领域已知的，并且包括例如小分子(例如，维生素如叶酸)、糖类(例如甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、二糖、三糖、寡糖)、肽(例如RGD)、多肽(例如，抗体、结合细胞表面受体的蛋白质如转铁蛋白)、核酸、类肽和肽核酸(PNA)。
例如，MAP(以及由MAP制成的纳米颗粒)可以包含导向分子转铁蛋白，其将聚合物(或由聚合物形成的纳米颗粒)靶向血脑或血肿瘤屏障的内皮细胞。在这些实施方案中，通过与如上所述的PFP活性酯反应将导向分子与NPBA-PEG聚合物相连。由于蛋白质中的伯胺基团与PFP活性酯反应，全铁转铁蛋白与NPBA-PEG-五氟苯基酯的连接是通过将酯与全铁转铁蛋白结合来实现的。反应进程通过HPLC监测，并将该单-聚乙二醇化的转铁蛋白产物(例如，Mono-NPBA-PEG5k-Tf)通过疏水相互作用色谱法(HIC)纯化，基于与含有更高聚乙二醇化程度的级分(例如，二-和三-聚乙二醇化的级分)相比单-聚乙二醇化的转铁蛋白的差异结合。参见实施例38和39。这种方法可以防止铁在纯化过程中从转铁蛋白中损失，就像使用以前的方法发生的那样，从而保持了全铁转铁蛋白结构。
包含大分子治疗剂的聚合物缀合物
在某些实施方案中，如本文所述的MAP包含大分子治疗剂以代替小分子治疗剂(例如CPT或SN38)或除了小分子治疗剂(例如CPT或SN38)之外还包含大分子治疗剂。大分子治疗剂是本领域已知的并且包括例如治疗性多肽(例如抗体、酶和生物活性蛋白)和核酸。
示例性治疗性多肽包括但不限于抗体，例如曲妥珠单抗(抗-Her2)、抗-Her3、抗-Trop2、抗-PSMA、抗-LIV-1、抗-FOLR1、抗-DLL3、抗-PDGF、抗-FRalpha、抗-PTK7、抗-间皮素、抗-c-MET、抗-MUC1、抗-CD70、抗-CD74、抗-CD30、抗-CD33、抗-FLT3、抗-CD22、抗-CD20和抗-CD19。
某些多肽治疗剂，例如针对肿瘤标志物的抗体，如前一段中举例说明的那些，也可用于靶向(导向)分子。
例如，MAP(和由MAP制备的纳米颗粒)可以包含抗-Her2抗体曲妥珠单抗。在这些实施方案中，该抗体通过与如上所述的PFP活性酯反应与NPBA-PEG聚合物连接。
由于蛋白质中的伯胺基团与PFP活性酯反应，曲妥珠单抗与NPBA-PEG-五氟苯基酯的连接是通过将酯与曲妥珠单抗结合来实现的。反应进程通过HPLC监测，将该单-聚乙二醇化的曲妥珠单抗产物(例如，Mono-NPBA-PEG5k-Tras)通过HIC纯化，基于与含有更高聚乙二醇化程度的级分(例如，二-和三-聚乙二醇化的级分)相比单-聚乙二醇化的曲妥珠单抗的差异结合。参见实施例41和42。
测定每个纳米颗粒的聚合物链数
为了测定每个纳米颗粒的聚合物链数，将纳米颗粒的平均分子量除以相应聚合物-药物(即MAP-SN38)缀合物的分子量。
纳米颗粒的分子量通过凝胶渗透色谱法(GPC)使用标称分子量为100kDa和200kDa的PEO标准品测定。聚合物-药物缀合物的分子量由缀合物合成中使用的聚合物(即MAP)的分子量计算，如下调整载药量：
MW缀合物＝MW聚合物/(1-T)
其中MW聚合物是在缀合物合成中使用的MAP的分子量，T是治疗剂的部分负载，以小数部分表示。
如本文所用，每个颗粒的链数(SpP)是存在于颗粒或纳米颗粒中的粘酸聚合物(“MAP”)治疗剂偶联分子的数量。为了测定SpP的目的，颗粒或纳米颗粒是具有至少一种MAP-治疗剂-蛋白质偶联分子的实体，其在适合给药于人的浓度下在任何水溶液(例如中性pH值的水、pH 7.4的PBS或任何将其给药于患者的制剂)中表现为单个单元。为了计算每个颗粒的链数，MAP-治疗剂偶联分子是具有共价连接治疗剂的单一MAP聚合物。
提供了用于评估颗粒的本文公开的方法，其中所述颗粒包含一种或多种MAP-治疗剂偶联分子。通常，该方法需要提供包含多个所述颗粒的样品并确定样品中每个颗粒的MAP-治疗剂缀合物的数量值，从而评估颗粒的制备。颗粒样品的值将是针对多个颗粒获得的值的函数。
如上所述，SpP定义为自组装成颗粒或纳米颗粒的MAP-治疗剂偶联分子的数量，因此
SpP＝[MAP-治疗剂偶联分子]/P(或NP)
其中[MAP-治疗剂偶联分子]为MAP-治疗剂偶联分子的数量，并且P(或NP)为单个颗粒(或纳米颗粒)。
在某些实施方案中，该方法还包括将确定的值与参考值进行比较。可以以多种方式使用该比较。例如，为了适应在该方法中进行的比较或测定，做出决定或采取步骤，例如，改变用于制备颗粒的过程中的生产参数，对样品进行分类、选择、接受或丢弃、释放或扣留、加工成药品、运输、转移到不同的地点、配制(例如，与另一种物质(例如赋形剂)一起配制)、贴标签、包装、投放市场，或出售或标价出售。例如，基于测定结果，或在与参考标准比较时，可以处理从中提取样品的批次，例如，如刚刚描述的。
为了计算每个颗粒的链数，确定颗粒的大小(例如通过自组装颗粒的光散射确定分子量)，单个聚合物的大小(例如通过单个聚合物的光散射确定分子量)，以及治疗剂的负载量(例如质量％)。使用这些值，按照如下计算SpP：
SpP＝MW颗粒/(MW缀合物)
其中MW颗粒为颗粒的分子量，并且MW缀合物为MAP-治疗剂偶联分子的分子量，其按照如下计算：
MW缀合物＝MW聚合物/(1-T％)
其中MW聚合物为MAP的分子量，并且T％为治疗剂的负载百分比，以小数表示，例如10％的负载导致T％＝0.1。
使用具有不同连接基和药物的MAP证明了SpP的测定。具有CPT和SN38的相同分子量的MAP导致每个颗粒约1.5-2.5条链。不同的连接基会改变每个颗粒的链，从而改变颗粒的密度，这在SN38中得到了证明。该连接基甘氨酸、γ-氨基丁酸、己酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸使每个颗粒的链从每个颗粒约1.3个至约4.6个链变化。
聚合物分子量分布和颗粒分散度：合成MAP使得它们具有一定范围的分子量。不同分子量的分子对粒径和每个颗粒的链提供不同的贡献。颗粒可以通过小于或大于平均值的MAP(此处视为链)形成。链也可能与可能受到剪切限制的最大尺寸相关联。
颗粒形状：假设颗粒形状为近似球形。假设自组装是由MAP-治疗剂偶联分子的治疗剂产生的疏水区域驱动的。
制剂、试剂盒和给药途径
还提供了包含如本文所公开的纳米颗粒的治疗组合物。这种组合物通常包含纳米颗粒和药学上可接受的载体。补充的活性化合物也可以掺入纳米颗粒组合物中。
本文公开的治疗组合物尤其可用于治疗癌症、癌症转移以及脑和中枢神经***的其他疾病。因此，包含纳米颗粒的组合物的“治疗有效量”是减轻症状或例如刺激肿瘤消退的任何量。例如，纳米颗粒的剂量可以从约0.1-1.0mg/kg体重，或从约0.5-2.0mg/kg体重或从约1-5mg/kg体重或从约1mg/kg体重变化至约10mg/kg体重或更多(或其间的任何整数值)；给药频率例如每小时、每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次，这取决于例如体重、给药途径、疾病的严重性等。因此，治疗有效量可以包括多次给药相同量或不同量的纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒的单次给药是治疗有效量。
在某些实施方案中，纳米颗粒以每平方米受试者身体表面积1-20mg纳米颗粒(或其间的任何整数或小数值)的剂量给药，这对于化学药物的剂量是典型的。
鉴于本公开，本领域技术人员已知各种药物组合物及其制备和使用技术。对于合适的药理学组合物及其给药技术的详细列举，可以参考下列文本：例如Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed.1985；Brunton等人,“Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of theSciences in Philadelphia(eds.),“Remington：The Science and Practice ofPharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins,2005；和University of the Sciences inPhiladelphia(eds.),“Remington：The Principles of Pharmacy Practice,”LippincottWilliams&Wilkins,2008。
本文所述的纳米颗粒可以悬浮在生理学上相容的载体中用于给药。如本文所用，术语“生理学上相容的载体”是指与纳米颗粒和制剂的任何其他成分相容且对其接受者无害的载体。本领域技术人员熟悉生理学上相容的载体。合适的载体的实例包括水(例如，pH4的水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s平衡盐溶液+/-葡萄糖(HBSS)和多种电解质溶液例如Plasma-LyteTM A(Baxter)。
给药于受试者的纳米颗粒悬浮液的体积将根据给药部位、治疗目标和溶液中纳米颗粒的数量而变化。通常地，给药的纳米颗粒的量将是治疗有效量。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”是指实现特定疾病的治疗(即减少与该疾病相关的症状的数量和/或严重程度)所需的给药纳米颗粒的数量。例如，在癌症转移至脑的情况下，给药治疗有效量的纳米颗粒导致转移症状的减轻和/或逆转；例如，转移性肿瘤的消退。治疗有效量因脑损伤的类型和程度而异，也可能因受试者的整体状况而异。
所公开的治疗组合物还可以包含药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，即载体。例如，这些载体可以稳定纳米颗粒和/或促进纳米颗粒在体内的保留。在与制剂的其他成分相容且对受试者无害的意义上，每种载体都是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇和聚乙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇和甘露糖醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
纳米颗粒可以在包含一种或多种药学上可接受的载体的媒介物中通过任何合适的途径(包括但不限于吸入、局部、经鼻、经口、肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内)或直肠)给药于受试者，该载体的比例由化合物的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准实践确定。可以使用本领域已知的任何方法进行本文所述化合物的给药。例如，给药可以是透皮、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、颅内、眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、脑室内、鞘内、鼻内、雾化、通过栓剂或通过口服给药。本文所述的纳米颗粒的药物组合物可用于通过注射给药，或用于口服、经肺、经鼻、经皮或眼部给药。
示例性制剂包括但不限于适合于肠胃外给药(例如肺内、静脉内、动脉内、眼内、颅内、脑膜下或皮下给药)的那些制剂，包括包封在胶束、脂质体或药物释放胶囊中的制剂(活性剂掺入设计用于缓释的生物相容性涂层中)；可摄入的制剂；局部使用的制剂，例如滴眼液、乳膏、软膏和凝胶；以及其他制剂例如吸入剂、气雾剂和喷雾剂。本公开的组合物的剂量将根据治疗需要的程度和严重性、给药组合物的活性、受试者的一般健康状况以及本领域技术人员熟知的其他考虑因素而变化。
在另外的实施方案中，本文所述的组合物在脑损伤或转移部位处或附近经颅内递送。这种局部递送允许用于非全身递送组合物，从而与全身递送相比减少组合物的身体负担。局部递送可以例如通过颅内注射或通过使用包括但不限于支架和导管的各种医学植入装置来实现，或者可以通过吸入、静脉切开术或手术来实现。用于将所需药剂涂覆、植入、嵌入和以其他方式吸附到诸如支架和导管的医疗装置的方法在本领域中已经确立并且在本文中被考虑。
本公开的另一个方面涉及用于将任选地与另一种治疗剂组合的纳米颗粒给药于受试者的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含配制在药物载体中的纳米颗粒组合物，其适用于例如通过注射给药。
实施例
提供以下实施例以说明本公开中描述的一些概念。虽然每个实施例都被认为提供了组合物、制备方法和使用方法的具体实施方案，但没有一个实施例应被认为是对本文所述的更一般的实施方案的限制。
在以下实施例中，已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则温度以摄氏度为单位，压力为大气压或接近大气压。除非另有说明，对分子量的任何提及均意在指数均分子量。
实施例1-4描述了粘酸向可聚合的粘酸单体(MAM)的转化。实施例5和6描述了MAM的聚合以形成粘酸聚合物(MAP)。实施例7-15描述了用四种不同的基于氨基酸的连接基将7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)衍生为能够与MAP反应形成共价MAP-SN38缀合物的形式。实施例16-20描述了用于合成由基于氨基酸的连接基连接的MAP-SN38缀合物的反应。实施例21描述了将MAP-SN38缀合物转化为纳米颗粒的方法。实施例22和23描述了MAP-SN38纳米颗粒的表征。实施例24-29描述了MAP的制备规模的合成路线。实施例30-32描述了喜树碱(CPT)的衍生化及其与MAP的连接。实施例33-35描述了SN38的衍生化以连接到MAP。实施例36和37描述了具有适合蛋白质偶联的反应性末端的硝基苯基硼酸-聚乙二醇(NPBA-PEG)聚合物的合成。实施例38-40描述了靶向(导向)分子与NPBA-PEG聚合物的偶联和产物的表征。实施例41-43描述了大分子治疗剂与NPBA-PEG聚合物的偶联和产物的表征。
实施例1.N-Boc-保护的粘酸二胺(化合物2)的合成
在装有18g(86mmol)粘酸和磁力搅拌棒的1L圆底烧瓶中加入400mL甲醇(MeOH)和1.4mL浓硫酸。在不断搅拌下将混合物加热至回流(85℃)过夜(约18小时)。约18小时后，将32mL三乙胺(TEA)添加到烧瓶中，并将混合物在回流(85℃)下搅拌60分钟。然后向该反应混合物中加入溶解在50mL MeOH中的30g(187mmol)N-Boc-乙二胺。将该反应在回流(85℃)下搅拌过夜(约18小时)。将该反应混合物冷却至室温，过滤并用MeOH洗涤。然后将收集的固体溶于450mL MeOH中，并在不断搅拌下回流1小时。将该反应混合物冷却至室温，真空过滤，并用MeOH洗涤。将收集的固体在真空下干燥过夜，得到26.1g(52.8mmol,62％产率)的N-Boc-保护的粘酸二胺(2)。
Figure BDA0003677646290000491
实施例2.粘酸二氨基氯化物(化合物3)的合成
在不断搅拌下向装有25.9g(52mmol)N-Boc-保护的粘酸二胺(2)和磁力搅拌棒的500mL圆底烧瓶中缓慢加入466mL的在MeOH中的3M盐酸水溶液(HCl)。缓慢加入HCl后，将反应烧瓶移至定轨振荡器并在室温下振荡过夜。过滤该反应浆液，固体用MeOH洗涤3次(150mL)。将收集的固体在真空下在35℃下过夜干燥数小时，得到18.0g(49mmol,94％产率)的粘酸二氨基氯化物(3)。
Figure BDA0003677646290000492
实施例3.粘酸二(Asp(OtBu)-Boc)(化合物4)的合成
向装有14.9g(51mmol)Boc-L-天冬氨酸4-叔丁酯、6g(54mmol)羟基吡啶N-氧化物(HOPO)和磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶中加入140mL乙腈(ACN)和8.5mL(54mmol)N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)。将该反应混合物搅拌10分钟。然后向该反应烧瓶中加入溶解在水(55mL)和TEA(5.4mL)混合物中的6.3g(17mmol)粘酸二氨基氯化物(3)的悬浮液。在恒定磁力搅拌下将反应混合物加热(80℃)约24小时。加热后，使用真空从反应混合物中除去ACN。向浓缩的反应中加入额外的水(150mL)，并将混合物加热(85℃)1小时。冷却后，通过真空过滤收集反应混合物，用水洗涤3次(100mL)。将洗涤过的固体与ACN(150mL)一起返回到圆底烧瓶中。在不断搅拌下将反应混合物加热至回流直至溶解。冷却后，通过过滤收集该反应混合物，并用冷冻的ACN洗涤3次(100mL)。将收集的固体与ACN(150mL)一起再次返回到圆底烧瓶中，并将反应混合物在持续搅拌下加热至回流约1小时。冷却后，通过过滤收集该反应混合物，并用冷冻的ACN洗涤3次(100mL)。将收集的固体在真空下干燥过夜，得到5.9g(7mmol,41％产率)的粘酸二(Asp(OtBu)-Boc)(4)。
Figure BDA0003677646290000501
实施例4.粘酸单体(MAM)(化合物5)的合成
向装有1g(1mmol)粘酸二(Asp(OtBu)-Boc)(4)和磁力搅拌棒的40mL小瓶中加入二氯甲烷(DCM，7.5mL)。在不断搅拌下向该反应混合物中缓慢加入三氟乙酸(TFA，7.5mL，98mmol)。在室温下搅拌1小时后，通过缓慢加入甲基叔丁基醚(MTBE，100mL)使反应混合物沉淀。将沉淀的混合物离心并随后用MTBE(100mL)洗涤一次。将收集的固体在真空下干燥，然后溶解在水(30mL)中。然后将溶解的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到0.2767g(0.384mmol,32％产率)的MAM(5)。
Figure BDA0003677646290000502
实施例5.粘酸聚合物(MAP)(化合物6)的合成
将装有224mg(0.30mmol)MAM(5)、1g二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)-PEG(diSPA-PEG3.5k)(0.27mmol)和磁力搅拌棒的10mL圆底烧瓶密封，并将两种固体在室温下真空干燥4小时。然后向该反应烧瓶中加入4.1mL无水二甲亚砜(DMSO)，并将混合物加热(35℃)。溶解后，将208μL无水N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA,1.19mmol)添加到反应混合物中。将反应混合物在恒定磁力搅拌下加热(35℃)66小时。将反应混合物用DMSO进行透析，然后使用10kDa膜用水进行透析。然后将透析的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到1.03g(定量产率)的MAP(6)。
Figure BDA0003677646290000511
对于通过该方法合成的化合物6，x为约80，并且y为约16。因此，以数均分子量和重均分子量的算术平均值确定的化合物6具有约65kDa的平均分子量。如果使用不同的起始物料(例如，diSPA-PEG2k)(例如，对于2kDa PEG，x为约46)，这些值将发生变化。
实施例6.MAP分子量的测定
MAP(6)分子量在Malvern Omnisec凝胶渗透色谱法(GPC)***上测定，其包括溶剂输送泵、脱气器、自动进样注射器、柱隔室、折射率检测器和光散射检测器。通过将MAP(6)以1-5mg/mL范围内的已知浓度溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.02％叠氮化钠中来制备样品用于分析。完全溶解后，将样品通过0.45μm过滤器。通过以0.7mL/min的流速将100μL过滤样品注入到2×PL Aquagel-OH 40色谱柱(Agilent)来测定绝对分子量。分析在30℃下进行。使用Malvern OMNISEC软件分析所得聚合物峰。
实施例7.10-TBDPS-SN38(化合物7)的合成
向含有2g(5.10mmol)SN38和磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶中装入100mL无水DCM和4.2mL(30.58mmol)TEA。然后向该反应混合物中加入7.9mL(30.58mmol)叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)。在不断搅拌下将该混合物加热至回流(50℃)过夜(约16小时)，然后用0.2NHCl(2×50mL)、饱和的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机溶液经MgSO4干燥，并在真空下蒸发。将残余物溶解在无水DCM中，并用己烷沉淀。重复该沉淀以进一步去除过量的TBDPSCl。将固体真空干燥，得到1.2g(1.9mmol,37％产率)的10-TBDPS-SN38(7)。
Figure BDA0003677646290000521
实施例8.20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38(化合物8)的合成
向装有0.5g(0.8mmol)10-TBDPS-SN38(7)的40mL小瓶中加入8.9mL无水DCM和磁力搅拌棒。加入溶剂后，将该反应冷却至0℃。向单独的小瓶中加入0.35g Boc-Gly-OH(2.0mmol)、0.39g(2.0mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、0.1g(0.8mmol)4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和3.8mL无水DCM。然后将第二个小瓶中的内容物转移到含有7的烧瓶中。在0℃搅拌3小时后，用0.5％NaHCO3(2×50mL)、水(50mL)、0.1N HCl(2×50mL)和盐水洗涤该混合物。将有机溶液经MgSO4干燥，并真空蒸发，得到0.54g粗品20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38(8)(0.7mmol,86％产率)。
Figure BDA0003677646290000522
实施例9.20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38(化合物9)的合成
向装有1g(1.6mmol)10-TBDPS-SN38(7)的40mL小瓶中加入17.7mL无水DCM和磁力搅拌棒。加入溶剂后，将该反应冷却至0℃。向单独的小瓶中加入0.82g(4.0mmol)Boc-GABA-OH、0.77g(4.0mmol)EDC.HCl、0.20g(1.6mmol)DMAP和7.6mL无水DCM。然后将第二个小瓶中的内容物转移到含有7的烧瓶中。在0℃搅拌3小时后，用0.5％NaHCO3(2×50mL)、水(50mL)、0.1N HCl(2×50mL)和盐水洗涤该混合物。将有机溶液经MgSO4干燥，并真空蒸发，得到1.05g粗品20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38(9)(1.28mmol,定量产率)。
Figure BDA0003677646290000531
实施例10.20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38(化合物10)的合成
向装有0.6g(0.95mmol)10-TBDPS-SN38(7)的40mL小瓶中加入10.4mL无水DCM和磁力搅拌棒。加入溶剂后，将该反应冷却至0℃。向单独的小瓶中加入0.55g Boc-Hex-OH(2.4mmol)、0.45g(2.4mmol)EDC.HCl、0.12g(0.98mmol)DMAP和4.5mL无水DCM。然后将第二个小瓶中的内容物转移到含有7的烧瓶中。在0℃搅拌3小时后，用0.5％NaHCO3(2×50mL)、水(50mL)、0.1N HCl(2×50mL)和盐水洗涤该混合物。将有机溶液经MgSO4干燥，并真空蒸发，得到0.88g粗品20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38(10)(1.0mmol,111％产率)。
Figure BDA0003677646290000532
实施例11.20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38(化合物11)的合成
向装有1.0g(1.6mmol)10-TBDPS-SN38(7)的100mL圆底烧瓶中加入17.7mL无水DCM和磁力搅拌棒。加入溶剂后，将该反应冷却至0℃。向单独的小瓶中加入0.87g Boc-Val-OH(4.0mmol)、0.77g(4.0mmol)EDC.HCl、0.20g(1.6mmol)DMAP和7.6mL无水DCM。然后将第二个小瓶中的内容物转移到含有7的烧瓶中。在0℃搅拌3小时后，用0.5％NaHCO3(2×50mL)、水(50mL)、0.1N HCl(2×50mL)和盐水洗涤该混合物。将有机溶液经MgSO4干燥，并真空蒸发，得到1.24g粗品20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38(11)(1.5mmol,93％产率)。
Figure BDA0003677646290000541
实施例12.20-(HCl.Gly)-SN38(化合物12)的合成
在不断搅拌下向装有1.2g(1.5mmol)20-(Boc-Gly)-10-TBDPS-SN38(8)和磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶中缓慢加入75mL的12N HCl。加入溶剂后，将该反应冷却至0℃。向单独的小瓶中加入0.87g Boc-Val-OH(4.0mmol)、0.77g(4.0mmol)EDC.HCl、0.20g(1.6mmol)DMAP和7.6mL无水DCM。在HCl溶液顶部加入己烷(20mL)。在室温搅拌过夜(约16小时)后，从反应中除去己烷层。然后将该反应用己烷洗涤，一式三份(3×20mL)。然后使用真空从反应混合物中除去HCl。将残余物溶解在MeOH中，并用MTBE沉淀。将该固体真空干燥，得到0.44g(0.91mmol,60％产率)的20-(HCl.Gly)-SN38(12)。
Figure BDA0003677646290000542
实施例13.20-(TFA.GABA)-SN38(化合物13)的合成
在不断搅拌下向装有0.37g(0.45mmol)20-(Boc-GABA)-10-TBDPS-SN38(9)、8.6mL水和磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中缓慢加入8.6mL的TFA。在TFA溶液顶部加入己烷(20mL)。在室温搅拌过夜(约16小时)后，从反应中除去己烷层。然后将该反应用己烷洗涤，一式三份(3×20mL)。然后使用真空浓缩反应混合物。将残余物溶解在MeOH中，并用MTBE沉淀。将该固体真空干燥，得到0.16g(0.27mmol,60％产率)的20-(TFA.GABA)-SN38(13)。
Figure BDA0003677646290000551
实施例14.20-(TFA.Hex)-SN38(化合物14)的合成
在不断搅拌下向装有0.37g(0.43mmol)20-(Boc-Hex)-10-TBDPS-SN38(10)、8.3mL水和磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中缓慢加入8.3mL的TFA。在TFA溶液顶部加入己烷(20mL)。在室温搅拌过夜(约16小时)后，从反应中除去己烷层。然后将该反应用己烷洗涤，一式三份(3×20mL)。然后使用真空浓缩反应混合物。将残余物溶解在MeOH中，并用MTBE沉淀。将该固体真空干燥，得到0.16g(0.26mmol,60％产率)的20-(TFA.Hex)-SN38(14)。
Figure BDA0003677646290000552
实施例15.20-(HCl.Val)-SN38(化合物15)的合成
在不断搅拌下向装有1.2g(1.4mmol)20-(Boc-Val)-10-TBDPS-SN38(11)和磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶中缓慢加入75mL的12N HCl。在HCl溶液顶部加入己烷(20mL)。在室温搅拌过夜(约16小时)后，从反应中除去己烷层。然后将该反应用己烷洗涤，一式三份(3×20mL)。然后使用真空从反应混合物中除去HCl。将残余物溶解在MeOH中，并用MTBE沉淀。将该固体真空干燥，得到0.46g(0.86mmol,60％产率)的20-(HCl.Val)-SN38(15)。
Figure BDA0003677646290000561
实施例16.MAP-Gly-SN38(化合物16)的合成
向含有100mg MAP(6)和磁力搅拌棒的10mL圆底烧瓶中装入8mL无水DMSO。然后向该反应混合物中加入51.9mg(0.27mmol)EDC.HCl和24.9mg(0.22mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。加入EDC.HCl和NHS后，向该反应混合物中加入105.2mg(0.22mmol)20-(HCl.Gly)-SN38(12)和无水DIPEA(0.22mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜(约18小时)。将该反应混合物用DMSO进行透析，然后用pH 4的水使用10kDa膜进行透析。然后将透析的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到98mg(定量产率)的MAP-Gly-SN38(16)。
Figure BDA0003677646290000562
如实施例5所述，对于化合物6和16，x为约80，并且y为约16。
实施例17.MAP-GABA-SN38(化合物17)的合成
向含有100mg MAP(6)和磁力搅拌棒的10mL圆底烧瓶中装入8mL无水DMSO。然后向该反应混合物中加入51.9mg(0.27mmol)EDC.HCl和24.9mg(0.22mmol)NHS。加入EDC.HCl和NHS后，向该反应混合物中加入128.3mg(0.22mmol)20-(TFA.GABA)-SN38(13)和无水DIPEA(0.22mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜(约18小时)。将该反应混合物用DMSO进行透析，然后用pH 4的水使用10kDa膜进行透析。然后将透析的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到91mg(定量产率)的MAP-GABA-SN38(17)。
Figure BDA0003677646290000571
如实施例5所述，对于化合物6和17，x为约80，并且y为约16。
实施例18.MAP-Hex-SN38(化合物18)的合成
向含有100mg MAP(6)和磁力搅拌棒的10mL圆底烧瓶中装入8mL无水DMSO。然后向该反应混合物中加入51.9mg(0.27mmol)EDC.HCl和24.9mg(0.22mmol)NHS。加入EDC.HCl和NHS后，向该反应混合物中加入134.4mg(0.22mmol)20-(TFA.Hex)-SN38(14)和无水DIPEA(0.22mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜(约18小时)。将该反应混合物用DMSO进行透析，然后用pH 4的水使用10kDa膜进行透析。然后将透析的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到97mg(定量产率)的MAP-Hex-SN38(18)。
Figure BDA0003677646290000581
如实施例5所述，对于化合物6和18，x为约80，并且y为约16。
实施例19.MAP-Val-SN38(化合物19)的合成
向含有100mg MAP(6)和磁力搅拌棒的10mL圆底烧瓶中装入8mL无水DMSO。然后向该反应混合物中加入51.9mg(0.27mmol)EDC.HCl和24.9mg(0.22mmol)NHS。加入EDC.HCl和NHS后，向该反应混合物中加入114.3mg(0.22mmol)20-(HCl.Val)-SN38(15)和无水DIPEA(0.22mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜(约18小时)。将该反应混合物用DMSO进行透析，然后用pH 4的水使用10kDa膜进行透析。然后将透析的产物通过0.22μm过滤器，冷冻并冻干，得到96mg(定量产率)的MAP-Val-SN38(19)。
Figure BDA0003677646290000591
如实施例5所述，对于化合物6和19，x为约80，并且y为约16。
实施例20.载药特性
将SN38加载到MAP上是在Agilent 1100HPLC***上测定的，该***具有连接到荧光检测器的反相柱(Synergi 4μm Hydro-RP
Figure BDA0003677646290000592
Phenomenex)，荧光检测器设置为375/536nm(ex/em)。将ACN/10mM磷酸钾缓冲液，pH 4(1:1v/v)用作洗脱液，流速为0.5mL/min。
为了进行分析，将聚合物药物缀合物(化合物16-19)溶解在pH 7.4的PBS中，浓度为1mg/mL。通过首先将10μL样品与10μL 0.1N HCl混合并在室温下孵育30分钟来确定未偶联的SN38的量。然后加入6.7μL水，然后加入73.3μL ACN，并将混合物在室温下孵育3小时。将该混合物在4℃下以14,000g离心10分钟，然后将上清液通过0.45μm过滤器。SN38浓度通过注入10μL过滤的样品来测定。将洗脱的SN38的所得峰面积与已知浓度的SN38的峰面积进行比较。
为了测量SN38的总量，将10μL样品与6.7μL 0.1N NaOH混合。将该溶液在室温下孵育3.5小时以使SN38从母体聚合物中释放出来。然后加入10μL的0.1N HCl(以将羧酸盐SN38形式转化为内酯形式)，并将混合物孵育45分钟。随后加入73.3μL ACN，将混合物在室温下孵育3小时。然后将样品离心并如上处理。聚合物结合的SN38由总的SN38和未偶联的SN38浓度之间的差异确定。
实施例21.MAP-连接基-SN38纳米颗粒的形成
将聚合物药物缀合物(化合物16-19)溶解在pH 4的水中，浓度为4mg/mL，以形成MAP-连接基-SN38纳米颗粒。然后将溶液通过0.22μm过滤器并冷冻用于后续分析。将纳米颗粒在pH 4的水中稀释至2mg/mL，并使用ZetaPALS(Brookhaven Instruments Corporation)仪器通过动态光散射(DLS)测量流体动力学直径。对纳米颗粒进行了五次操作，每次操作1分钟。所有纳米颗粒的直径都接近25nm，从19到32nm不等。
实施例22.体外释放研究
进行实验以评估SN38从MAP-Gly-SN38、MAP-GABA-SN38、MAP-Hex-SN38、MAP-Val-SN38、MAP-Ala-SN38、MAP-β-Ala-SN38和MAP-Leu-SN38纳米颗粒中的释放。对于MAP-Ala-SN38、MAP-β-Ala-SN38和MAP-Leu-SN38纳米颗粒的合成参见下文实施例33-35。这些研究在PBS中以0.1mg SN38/mL在6.5、7.0或7.4的pH值下进行。
将PBS培养基移液到比色皿中，将其在37℃的加湿烘箱中孵育2小时以达到平衡。将纳米颗粒制剂混合到相关介质中并放回烘箱中。在预定时间点取出样品并立即在-80℃冷冻直至分析时间。如上文实施例20中所述测定未偶联的SN38的量和SN38的总量。聚合物结合的SN38浓度由总的SN38和未偶联的SN38浓度之间的差异确定。
结果表明SN38从下列所有七种纳米颗粒中的释放表现出一级动力学：MAP-Gly-SN38、MAP-GABA-SN38、MAP-Hex-SN38、MAP-Val-SN38、MAP-Ala-SN38、MAP-β-Ala-SN38和MAP-Leu-SN38。观察到释放速率与pH值有很强的依赖性。随着pH从6.5增加到7.4，所有纳米颗粒制剂的释放半衰期均降低，表明水解在SN38的释放中起重要作用。对于具有更多疏水性和空间位阻的连接基的纳米颗粒，观察到更长的半衰期，从约30小时至>168小时不等。
实施例23.每个颗粒的链数的测定
每个纳米颗粒的链数(SpP)通过计算颗粒的分子量和MAP的分子量之间的比率来确定。将标称分子量为100kDa和200kDa的聚环氧乙烷(PEO)标准品和目标样品通过在pH 3的水或PBS+0.02％叠氮化钠中溶解至1-5mg/mL的浓度来制备用于GPC分析(Omnisec GPC,Malvern)。选择的浓度与颗粒形成后预期的浓度相似。溶解后，将样品通过0.45μm过滤器，并在Zenix SEC 300或Zenix-C SEC 300色谱柱(Sepax,3μm)上以0.35mL/min在30℃下进行分析。光散射和示差折射率信息与Malvern OMNISEC软件或类似的分子量分析软件一起使用，以确定颗粒的分子量。
颗粒的分子量除以MAP-SN38偶联分子的分子量，以确定每个颗粒的链数。MAP-SN38偶联分子的分子量由聚合物的分子量根据药物负载百分比调整计算得出，根据下式：
MW缀合物＝MW聚合物/(1-T％)
其中MW聚合物为MAP的分子量，T％为治疗剂的负载百分比，以小数表示，例如10％的负载导致T％＝0.1。
使用具有不同连接基和药物的MAP证明了SpP的测定。与CPT或SN38偶联的相同分子量的MAP可生成每个颗粒约1.5-2.5条链的纳米颗粒。在衍生的SN38上使用不同的连接基会改变每个颗粒的链数，从而改变所得颗粒的密度。每个颗粒的链数从约1.3至约4.6不等，具体取决于连接基(甘氨酸、γ-氨基丁酸、己酸、丙氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸)。
实施例24.N-Boc-保护的粘酸二胺(化合物2)的制备规模合成
在氮气下，向机械搅拌的15升反应容器中加入450g(2.1mol)粘酸和MeOH(5.75L)。向该反应容器中加入由MeOH(1L)和浓硫酸(34.2mL，0.64mol)组成的溶液。将该混合物加热至65℃的内部温度48小时。将反应容器的内容物冷却至22℃，此时在20分钟的过程中加入0.81L(5.78mol)TEA。将该反应搅拌1小时，此时在20分钟的过程中加入0.76kg(4.71mol)N-(2-氨基乙基)(叔丁氧基)甲酰胺在0.9L MeOH中的溶液。将该反应加热至63℃的内部温度，并在60分钟后加入1.8L MeOH以促进搅拌。在63℃下总共2小时后，将反应容器以每分钟1℃的速度冷却并在20℃下保持过夜。过滤该反应浆液，将该滤饼用MeOH(3×0.5L)洗涤。将固体在真空过滤器上干燥过夜以确保完全去除液体。将分离的固体与MeOH(9.0L)一起装回反应容器中并在63℃下搅拌1小时。将反应容器设置为以每分钟1℃的速率冷却并在20℃下保持约60小时。将浆液过滤并用MeOH(2×1.0L)洗涤，将固体在真空烘箱中在45℃下干燥过夜，得到963g(91％产率，为与MeOH的溶剂合物，82％无水产率)的N-Boc-保护的粘酸二胺(2)。
Figure BDA0003677646290000621
实施例25.粘酸二氨基氯化物(化合物3)的制备规模合成
向机械搅拌的15升反应容器中加入890g的N-Boc-保护的粘酸二胺(2)(1.80mmol)、3.6L水和7.1L MeOH。在2小时内向该浆液中加入12M HCl(3.6L)，同时保持温度在20℃至30℃的范围内。将该反应搅拌过夜，此时将浆液过滤并用1.8L MeOH洗涤。将分离的固体在真空烘箱中在45℃的托盘中干燥。在氮气下将分离的固体与水(5.5L)一起装入15L反应容器中，并在45℃搅拌。在30分钟的过程中加入5.5L MeOH，导致结晶。将反应容器冷冻以使反应内容物冷却至室温。通过过滤分离固体并用MeOH(2×1.0L)洗涤。收集固体并在真空烘箱中在40℃下干燥过夜，得到504g(1.37mol,76％产率)的粘酸二氨基氯化物(3)。
Figure BDA0003677646290000622
实施例26.粘酸二(Asp(OtBu)-Boc)(化合物4)的制备规模合成
向机械搅拌的15L反应器中加入1.27kg Boc-L-天冬氨酸4-叔丁酯(4.39mol)、0.62kg Oxyma(氰基羟基亚氨基乙酸乙酯)(4.39mol)和3.5L DCM。将反应混合物冷却至5℃并搅拌30分钟。在10分钟的过程中向该反应混合物中加入0.84kg EDC.HCl(4.40mol)固体。用另外的0.5L DCM将EDC.HCl冲洗到反应中，将该反应搅拌约30分钟，然后冷冻至10℃。在单独的12L烧瓶中装入1.02kg碳酸钠(9.61mol)和5.0L水。将各组分溶解，然后冷却至室温。在10分钟的过程中，将504g(1.37mol)的3添加到碳酸钠溶液中。将该混合物搅拌15分钟，此时在约3分钟的过程中将其添加到15L反应烧瓶中的Boc-L-天冬氨酸4-叔丁酯中。该混合反应放热，但将冷却夹套设置为10℃保持30分钟，随后设置为15℃保持另外45分钟。然后将反应夹套设置为33℃保持1小时，然后在搅拌下加入8.06L的水5分钟。然后停止搅拌，15分钟后将反应相分离。除去DCM(底层)，然后向该反应器中添加额外的1.0L DCM。然后将该混合物搅拌10分钟，然后使其沉降。收集DCM层并与最初收集的有机层合并，浓缩至总体积为约3L。向该有机混合物中加入1升水以帮助进一步蒸馏掉DCM。然后将有机反应混合物添加到15L反应器中，该反应器中含有11.1L加热至40℃的水。将搅拌的混合物恢复至20℃并形成浆液。除去水并且固体留在反应器中。向湿固体中加入10.1升水。将反应混合物加热至37℃以促进搅拌。然后将反应冷却至3℃过夜并搅拌。过滤固体，然后用另外的10L水将其装回反应器中。使浆液在室温下搅拌3小时。再次过滤该固体，用1.0L水洗涤，并使其干燥，得到815g物料。将790克粗品4与2.4L的ACN一起添加到5L圆底烧瓶中，并加热至60℃。在部分真空下通过共沸蒸馏连续蒸馏出水，并继续加入ACN，至约1.6L的体积。向其中加入3.1L ACN以诱导结晶。将浆液短暂加热回流，然后冷却至5℃并保持30分钟。冷却后，将浆液过滤并用ACN(4×0.5L,5℃)洗涤。在真空下将固体加热至50℃以除去溶剂。将6.3L的DCM分两批添加到反应混合物中，此时浓缩浆液以蒸馏掉ACN。然后在真空下将固体加热至80℃以去除DCM并提供自由流动的粉末。然后将固体置于真空烘箱中，在减压下在80℃下干燥，得到310g(0.35mol,26％产率)的粘酸二(Asp(OtBu)-Boc)(4)，为与ACN的1:1摩尔溶剂合物。
Figure BDA0003677646290000631
实施例27.粘酸单体中性物质(化合物20)的制备规模合成
将300g的4(0.34mol)、1.2L DCM、0.11L水(6.13mol)和0.279L三异丙基甲硅烷(1.36mol)装入配备机械搅拌的5L夹套圆底烧瓶中。将反应混合物冷却至5℃并随后形成浆液。将预先在冰浴中冷却1小时的1.2L TFA添加到该搅拌的浆液中。将该反应保持在4℃的内部温度下过夜。添加另外的0.30L TFA并在4℃下继续搅拌过夜。在加入0.90L己烷后，将该反应在5℃搅拌10分钟。然后将反应混合物倒入分液漏斗中，将底部相分离到5L圆底漏斗中。用另外的DCM(300mL)冲洗该反应物料，将其与最初收集的级分合并。在低于30℃的旋转蒸发仪上浓缩合并的收集级分。将另外的0.90L DCM添加到烧瓶中，随后使用旋转蒸发仪在25℃下除去。然后加入0.60L甲苯，并在旋转蒸发仪上浓缩以共沸除去水和TFA，得到油状物。通过硅藻土塞(plug)过滤油状物，并用DCM(0.40L)洗涤四次。将DCM通过旋转蒸发仪在35℃下除去。将得到的双相混合物添加到干净的5L反应容器中并加热至23℃。在20分钟的过程中加入3.0L环戊基甲基醚(CPME)，导致形成油状固体。将容器冷却至22℃并搅拌过夜以提供粘性晶体。使用短程蒸馏柱在35℃下蒸馏出1.5L DCM。将得到的浆液过滤并用CPME(2×0.45L)洗涤。然后将固体在旋转蒸发仪上的圆底烧瓶中干燥，然后在室温下真空干燥过夜，得到261g的粘酸单体中性物质(208.8g,82％效力的产率核算)。
为了进一步重结晶，将0.24kg粘酸单体中性物质与水(0.20L)一起添加到1LErlenmeyer烧瓶中。将混合物在室温下搅拌1小时以提供溶液。借助另外的水(50mL)将该溶液通过过滤漏斗过滤到5L圆底烧瓶中。在30分钟的过程中，在搅拌下将2.2L四氢呋喃(THF)添加到烧瓶中。将混合物搅拌总共60分钟，此时在旋转蒸发仪上于35℃浓缩以除去1L馏出物。在10分钟内加入额外的THF(0.98L)。将浆液冷却至室温并搅拌20分钟。将冷却的浆液过滤并用THF(2×0.25L)洗涤，随后在真空烘箱中在室温下干燥2.5天，得到119g(0.23mol,66％产率)中性形式的粘酸单体(20)。
Figure BDA0003677646290000641
实施例28.MAM(化合物5)的制备规模合成
将装有120g(0.23mol)的20和DCM(1.2L)的3L圆底烧瓶搅拌10分钟，此时加入水(0.06L)。继续搅拌15分钟，此时在5分钟内加入TFA(66.0mL，0.86mol)。固体溶解，混合物在室温下搅拌1小时。固体溶解，混合物在室温下搅拌1小时。将混合物在旋转蒸发仪上在30℃浓缩。向配备机械搅拌的5L圆底烧瓶中加入***(4.0L)以及MAM晶种(5,12g)。在搅拌下将20/TFA/水溶液缓慢加入***中。1小时后，倾去***，加入另外的新鲜的***(3.6L)。将混合物在室温下搅拌直至MAM-二TFA盐沉淀。过滤固体并用***(0.2L)洗涤一次。过滤固体，并用***(0.2L)洗涤一次。固体在室温下真空干燥，然后在30℃加热1小时，得到122g(75％产率)的MAM(5)。
Figure BDA0003677646290000651
实施例29.粘酸聚合物(化合物6)的制备规模合成
MAP(6)是通过粘酸单体(MAM)(5)和diSPA-PEG3.5k之间的逐步聚合反应合成的。
将装有包含约1.5当量TFA、579.54mg的diSPA-PEG3.5k(0.157mmol)和磁力搅拌棒的108.52mg(0.158mmol)的MAM(5)的20mL玻璃小瓶密封，并将两种固体在室温下真空干燥1小时。在氩气下向反应烧瓶中加入3.43mL的无水DMSO。将反应物在室温下溶解。溶解后，在氩气下向反应混合物中加入126μL无水DIPEA(0.72mmol)。将反应混合物在室温下在恒定磁力搅拌下搅拌3小时。
将反应混合物在冷异丙醇(IPA,×10体积,0-4℃)中沉淀。将反应器用DMSO(3×1mL)洗涤，然后在冷IPA中沉淀。将获得的白色悬浮液在0-4℃搅拌30分钟，并在4℃离心12分钟。通过倾析IPA分离沉淀在底部的白色蓬松聚合物。将聚合物用冷的IPA(×5体积)洗涤两次并重复该操作。将产物在室温下在Schlenk线上真空干燥过夜以除去IPA，然后溶解在milli-Q水(8mL)中。将水溶液冷冻并冻干，得到612.5mg(定量产率)的MAP(6)。
通过在两种单体之间引入化学计量偏差来控制聚合物的分子量。在1:1时，MAP(6)分子量最大，随着摩尔比偏离1:1，分子量降低。通过GPC获得的示例性化学计量偏差和实验分子量如表1所示。
表1.受控的MAP(6)合成的化学计量偏差
MAM：diSPA-PEG<sub>3.5k</sub>比率 分子量(kDa)
1.01 77.49
1.04 62.44
1.10 55.87
实施例30.20-(Boc-Gly)-CPT(化合物21)的合成
将200.4mg(0.58mmol)的CPT、302.7mg(1.73mmol)的Boc-Gly-OH和140.6mg(1.15mmol)的DMAP添加到配备磁力搅拌棒和橡胶隔片的10mL圆底烧瓶中。将容器及其内容物用氩气吹扫10分钟，此时通过添加无水DCM(1mL)将物料制成浆液。在大约三分钟的过程中，通过注射器将280μL(1.81mmol)的DIC滴加到反应混合物中。将该反应在室温下搅拌3小时，此时在真空下除去约50％的溶剂。向浓缩的浆液中加入4mL冷冻的MeOH。将该反应搅拌几分钟以促进进一步沉淀，然后过滤到布氏漏斗中。用更多的冷冻的MeOH洗涤固体，然后用冷冻的MTBE洗涤。将分离的固体在高真空下干燥，得到110.8mg(0.22mmol,38％产率)的20-(Boc-Gly)-CPT(21)。
在上述操作中，可用其他Boc-保护的氨基酸和二肽代替Boc-Gly-OH。通过用Boc-Ala-OH、Boc-β-Ala-OH、Boc-Val-OH、Boc-GABA-OH和Boc-Phe-Gly-OH替代，相同的操作分别获得20-(Boc-Ala)-CPT(化合物41)、20-(Boc-β-Ala)-CPT(化合物42)、20-(Boc-Val)-CPT(化合物40)、20-(Boc-GABA)-CPT(化合物43)和20-(Boc-Phe-Gly)-CPT(化合物44)。
Figure BDA0003677646290000661
实施例31.20-(TFA.Gly)-CPT(化合物22)的合成
向装有磁力搅拌器和孔针的闪烁管中加入97.1mg(0.20mmol)20-(Boc-Gly)-CPT(21)。通过添加DCM(0.2mL)生成搅拌的悬浮液。在搅拌下，逐渐加入TFA(0.2mL)。将反应混合物搅拌2小时。2小时后，产物用MTBE沉淀，过滤，洗涤。将分离的样品在高真空下干燥，得到82.5mg(0.16mmol,83％产率)的20-(TFA.Gly)-CPT(22)。
Figure BDA0003677646290000671
在上述方法中，用20-(Boc-Ala)-CPT、20-(Boc-β-Ala)-CPT、20-(Boc-Val)-CPT、20-(Boc-GABA)-CPT和20-(Boc-Phe-Gly)-CPT代替20-(Boc-Gly)-CPT，分别获得20-(TFA.Ala)-CPT(化合物45)、20-(TFA.β-Ala)-CPT(化合物46)、20-(TFA.Val)-CPT(化合物47)、20-(TFA.GABA)-CPT(化合物48)和20-(TFA.Phe-Gly)-CPT(化合物49)。
实施例32.MAP-Gly-CPT(化合物23)的合成
将149.2mg(0.07mmol，基于CO2H)的MAP(6)和21.5mg的20-(TFA.Gly)-CPT(22)(0.04mmol)添加到装有磁力搅拌器的20mL闪烁瓶中。将容器顶部空间用氩气排气约30分钟，然后在氩气下密封。在加入无水DMSO(约9mL，约85％总反应体积)后，在搅拌下溶解小瓶内容物。将装有166.3mg的(7-氮杂苯并***-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP,0.32mmol,4.4eq)和磁力搅拌器的8mL闪烁瓶在氩气气氛下吹扫。在搅拌下将该容器的内容物溶解在无水DMSO(约3.2mL)中。一旦两个容器中的所有固体都溶解，将1.6mL PyAOP溶液(83.2mg PyAOP，0.16mmol PyAOP，约15％总反应体积)转移到含有聚合物的容器中。将该反应搅拌约2分钟，此时加入无水的约45μL(0.26mmol)DIPEA(目标为31.3μL，0.18mmol)。将反应容器在黑暗中在室温下搅拌大约18小时。18小时后，将反应容器从氩气氛中移出，将约1/3的反应内容物转移到50mL玻璃离心管中。通过缓慢加入冷的乙酸乙酯(EtOAc)(0-4℃)使该反应沉淀。将悬浮液在0-4℃下搅拌约30分钟，然后离心。倾析出EtOAc层，将下1/3的反应介质加入同一容器中。重复该操作，直到所有反应介质都已沉淀到同一管中。将沉淀的固体用冷冻的EtOAc(×5体积)洗涤总共3次，同时涡旋搅拌以重新悬浮固体。在最后的洗涤循环之后，倾析出最后的EtOAc，并使用液氮将固体在离心管中冷冻。将冷却的离心管暴露于高真空约3小时以干燥固体，并提供115.2mg(定量产率)的MAP-Gly-CPT(23)。
Figure BDA0003677646290000681
MAP-CPT缀合物也通过相同的方法使用20-(TFA.Ala)-CPT、20-(TFA.β-Ala)-CPT、20-(TFA.Val)-CPT、20-(TFA.GABA)-CPT或20-(TFA.Phe-Gly)-CPT作为起始物料，而不是20-(TFA.Gly)-CPT来制备，以生成MAP-Ala-CPT(化合物50)、MAP-β-Ala-CPT(化合物51)、MAP-Val-CPT(化合物52)、MAP-GABA-CPT(化合物53)和MAP-Phe-Gly-CPT(化合物54)。
Figure BDA0003677646290000691
Figure BDA0003677646290000701
如实施例5所述，对于化合物6、23和50-54，x为约80，并且y为约16。
实施例33.10-OBoc-SN38(化合物24)的合成
在氩气氛下，向反应容器中加入2.0g(5.10mmol)SN38。将204mL无水DCM加入反应容器，随后加入12.2mL(151mmol)无水吡啶和1.5mL(6.53mmol)二碳酸二叔丁酯。将该反应在室温下搅拌约16小时，此时将该反应通过Celite 545(助滤剂)过滤，并用0.5N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并真空浓缩。将反应混合物稀释到DCM中，随后沉淀到己烷中。过滤固体并真空干燥，得到2.2g(4.47mmol,88％产率)的10-OBoc-SN38(24)。
Figure BDA0003677646290000702
实施例34.20-(Boc-Gly)-10-OBoc-SN38(化合物25)的合成
在氩气氛下，向冷却至0℃的装有502mg(1.02mmol)10-OBoc-SN38(24)的反应容器中加入8.8mL DCM。向该反应容器中加入包含3.8mL DCM、447mg(2.55mmol)Boc-Gly-OH、489mg(2.55mmol)EDC.HCl和125mg(1.02mmol)DMAP的冷冻溶液。将该反应在0℃搅拌3小时。将反应用0.5％碳酸氢钠溶液、水、0.1N HCl和盐水洗涤。将有机相用硫酸镁干燥并真空蒸发，得到639mg(0.98mmol,97％产率)20-(Boc-Gly)-10-OBoc-SN38(25)。
在上述操作中，可用其他Boc-保护的氨基酸代替Boc-Gly-OH。通过用Boc-Ala-OH、Boc-β-Ala-OH、Boc-Val-OH和Boc-Leu-OH替代作为起始物料，相同的操作分别获得20-(Boc-Ala)-10-OBoc-SN38(化合物29)、20-(Boc-β-Ala)-10-OBoc-SN38(化合物30)、20-(Boc-Val)-OBoc-SN38(化合物31)和20-(Boc-Leu)-10-OBoc-SN38(化合物35)。
Figure BDA0003677646290000711
实施例35.20-(TFA.Gly)-SN38(化合物26)的合成
向装有250mg(0.38mmol)20-(Boc-Gly)-10-OBoc-SN38(25)和1.88mL DCM的反应容器中加入0.47mL(6.14mmol)TFA。将该反应在室温搅拌2.5小时。将该反应混合物沉淀到冷冻的(4℃)MTBE中，通过离心分离，再次用MTBE洗涤，并在真空下干燥，得到133mg(0.24mmol,61％产率)20-(TFA.Gly)-SN38(26)。
Figure BDA0003677646290000712
用20-(Boc-Ala)-10-OBoc-SN38、20-(Boc-β-Ala)-10-OBoc-SN38、20-(Boc-Val)-10-OBoc-SN38和20-(Boc-Leu)-10-OBoc-SN38代替20-(Boc-Gly)-10-OBoc-SN38作为起始物料，分别获得20-(TFA.Ala)-SN38(化合物32)、20-(TFA.β-Ala)-SN38(化合物33)、20-(TFA.Val)-SN38(化合物34)和20-(TFA.Leu)-SN38(化合物36)。
如实施例17和18中所述，前述氨基酸-连接的SN38衍生物的TFA盐可用于形成MAP-SN38缀合物。
实施例36.NPBA-PEG5k-AA(化合物27)的合成
将无水DCM(40mL)装入含有20g(4mmol)的NH2-PEG5k-乙酸(AA)盐酸盐、DIPEA(2.1mL,12mmol)的250mL圆底烧瓶中，并用氩气吹扫。将溶液在冰/水浴中冷却。在含有磁力搅拌棒的20mL小瓶中，将934mg(5.5mmol)的3-羧基-5-硝基苯基硼酸(NPBA)溶解在无水DCM/二甲基甲酰胺(DMF)(8mL,4:1v/v)中。将1038mg(5.25mmol)的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)添加到NPBA溶液中。将活化的酸搅拌15分钟，然后滴加到预冷的PEG-胺在DCM中的溶液中。将该反应混合物在0℃搅拌20分钟。向反应混合物中加入去离子水(100mL)，剧烈搅拌并升温至室温。在这个阶段，反应混合物的pH为9。随后，加入磷酸一钠(NaH2PO4,2.5g)，使pH为7。加入1M HCl(12mL)进一步将反应混合物的pH值降至4。将反应混合物转移至分液漏斗，并加入乙酸异丙酯(iPrOAc,100mL)。充分振荡该混合物，并使其沉降以获得分离的相。弃去有机相，用iPrOAc(3×100mL)重复萃取。将水相转移到250mL圆底烧瓶中，并在旋转蒸发仪上于室温在20Torr浓缩30分钟。将水溶液冻干以提供粉末。将冻干粉末溶解在DMSO/水(40mL,3:1v/v)中。将该溶液通过疏水相互作用色谱法在C18Aq TeledyneISCO柱(475g)上进行纯化，该柱用95％流动相A(水+0.05％TFA)和5％流动相B(ACN+0.05％TFA)预平衡，进样量为12-15mL。在洗涤色谱柱和进行后续进样之前，梯度从5％B运行到40％B。对剩余的产物溶液重复纯化。通过HPLC分析含有产物的级分。合并纯度>99.5％的级分并冻干，得到14.2g(2.71mmol,68％产率)的NPBA-PEG5k-AA(27)。
Figure BDA0003677646290000731
对于通过该方法合成的化合物27，n为约114。如果使用不同的起始物料(例如，NH2-PEG3.5k-AA)，这些值将发生变化(例如，对于3.5kDa PEG，n为约80)。
实施例37.NPBA-PEG5k-AA-PFP(化合物28)的合成
向8mL反应容器中加入301.8mg(0.06mmol)NPBA-PEG5k-AA(27)以及磁力搅拌棒。将反应容器用真空和氩气循环吹扫三次。将固体溶解在无水DCM(1.2mL)中，然后通过注射器加入35μL无水N-甲基吗啉(0.35mmol)。短暂打开反应容器并加入45.3mg碳酸双(五氟苯基)酯(0.12mmol)。将反应顶部空间用氩气吹扫，反应在室温下搅拌约2小时。将反应溶液滴加到搅拌体积的MTBE(25mL)中以促进沉淀。使混合物在氩气氛下搅拌30分钟，然后以2600g离心。倾析液体层，此时将庚烷(20mL)添加到离心管中。在以2600g(8分钟)进行第二轮离心之前，对样品进行机械搅拌。从容器中倾出液体以留下剩余的湿固体。将容器在液氮中短暂冷却，然后使用Schlenk管线泵送以除去溶剂，得到300mg(0.055mmol,96％产率)的NPBA-PEG5k-AA-PFP(28)。
Figure BDA0003677646290000732
如实施例36所述，化合物27和28中的n为约114。
实施例38.NPBA-PEG5k-Tf粗混合物的合成
将35g(0.440mmol)全铁转铁蛋白(Tf)装入反应容器，并缓慢加入1.75L的50mMHEPES(pH 7.8)以溶解浓度为20g/L的Tf。溶解后，将在44mL DMSO中的4.77g(0.881mmol)NPBA-PEG5k-AA-PFP(28)缓慢添加到反应混合物中并充分混合。将反应混合物在室温温育2小时。将粗的反应混合物在装有反相(RP)柱(Zorbax 300SB-CN 4.6mm ID x 150cm)的Agilent1290HPLC***上分析，流动相A(水+0.1％TFA)和流动相B(ACN/IPA(4:1v/v)+0.1％TFA)，流速为0.7mL/min。将色谱柱连接到设置为280nm波长和360nm参考波长的吸光度检测器。此外，将粗的反应混合物在装有疏水相互作用色谱(HIC)柱(TSK gel Butyl-NPR 4.6mmID x 3.5cm)的Agilent1290HPLC***上分析，流动相A(20mM磷酸钠,1.5M硫酸铵，pH 7.0)和流动相B(20mM磷酸钠，pH 7.0/IPA(4:1v/v))，流速为0.8mL/min。将色谱柱连接到设置为280nm波长信号和360nm参考的吸光度检测器。孵育2小时后，将粗反应混合物准备好用于HIC纯化。
实施例39.Mono-NPBA-PEG5k-Tf的分离
将1.75L的NPBA-PEG5k-Tf粗混合物(20g/L)加入到反应容器中。将7L流动相A(1.5M硫酸铵，20mM磷酸钠，pH 7.4)添加到粗混合物中，以获得1.2M硫酸铵，16mM磷酸钠，pH 7.4浓度。混合后，将样品混合物加载到填充有GE琼脂糖苯基高效HIC树脂的AxioChrom 140色谱柱(1.7L)上，泵流速为200mL/min。允许大约10分钟的停留时间将样品混合物加载到HIC柱上。将IPA/10mM磷酸钠，pH 7.4(1：4v/v，流动相B)用作洗脱液。在洗脱步骤之前，用20％流动相B洗涤色谱柱2个柱体积(CV)，以去除未结合的物质。将纯化的NPBA-PEG5k-Tf用15CV的梯度为20-100％流动相B洗脱。收集单-聚乙二醇化的Tf(Mono-NPBA-PEG5k-Tf)的级分，并合并用于超滤和渗滤(UF/DF)。将Sartocon Slice Hydrosart Cassette 30kDa膜用于Mono-NPBA-PEG5k-Tf的UF/DF。使用7体积的PBS pH 7.4，通过渗滤将Mono-NPBA-PEG5k-Tf缀合物浓缩至50g/L。之后，通过0.22μm聚醚砜(PES)膜对Mono-NPBA-PEG5k-Tf进行无菌过滤。
实施例40.每个Tf的NPBA数量的测定
通过使用NPBA的茜素红S(ARS)检测法计算Mono-NPBA-PEG5k-Tf中NPBA-PEG5k的摩尔浓度与Tf的摩尔浓度之比来确定Mono-NPBA-PEG5k-Tf中每个Tf的NPBA数量。为了制作标准曲线，以不同浓度(0-0.0098mM)溶解在pH 7.2的PBS中制备NPBA-PEG5k-AA(27)样品。ARS以0.049mM溶解在水中制备。然后将样品与ARS混合，并使用Varioskan LUX分光光度计(ThermoFisher)和SkanIt(Thermo Fisher)或类似的荧光分析软件测量荧光(Ex：468nm，Em：572nm)。这些数据的线性回归(荧光对浓度)提供了用于确定目标样品中NPBA的校准曲线。
以0.007mM溶解在pH 7.2的PBS中制备感兴趣的样品(例如，Tf和Mono-NPBA-PEG5k-Tf)。Mono-NPBA-PEG5k-Tf中NPBA-PEG5k的摩尔浓度由Mono-NPBA-PEG5k-Tf样品的平均荧光值和不同已知浓度的NPBA-PEG5k-AA标准品(0-0.0098mM)的荧光值校准曲线，使用以下等式计算：
荧光＝ε*CN+b
其中ε＝校准曲线的线性回归斜率，b＝校准曲线的线性回归的截距，和CN＝NBPA-PEG的浓度(mM)。因此，CN(mM)＝(荧光-b)/ε。
然后根据以下等式通过将CN除以已知的Tf浓度来计算每个Tf的NPBA数量(NTf)：
NTf＝(NPBA-PEG5k mmol/L)/(Tf mmol/L)
使用NPBA的ARS检测法确定的Mono-NPBA-PEG5k-Tf中NPBA的数量为Mono-NPBA-PEG5k-Tf中每个Tf约1个NPBA。与ARS的反应以及因此的荧光信号需要可用于反应的NPBA官能团。一些分子(例如柠檬酸盐)与NPBA络合，降低荧光信号并改变每个Mono-NPBA-PEG5k-Tf的NPBA测量数量。在其他情况下，粗样品中可能存在过量未反应的NPBA-PEG缀合物，从而增加荧光信号并改变每个Mono-NPBA-PEG5k-Tf的NPBA确定数量。示例性实验结果如表2所示。
表2.Mono-NPBA-PEG5k-Tf样品的每个Tf的NPBA数量
Figure BDA0003677646290000751
实施例41.NPBA-PEG5k-Tras粗混合物的合成
将5.5g(0.038mmol)的曲妥珠单抗与50mM HEPES(pH 7.8)进行缓冲液交换，并将最终蛋白质浓度调节至10g/L。溶解后，将在3.78mL DMSO中的409.07mg(0.076mmol)NPBA-PEG5k-AA-PFP(28)缓慢添加到反应混合物中并充分混合。将反应混合物在室温温育2小时。在装有反相(RP)柱(Zorbax 300SB-CN 4.6mm ID x 150cm)的Agilent 1290HPLC***上分析粗反应混合物，流动相A(水+0.1％TFA)和流动相B(ACN/IPA(4:1v/v)+0.1％TFA)，流速为0.7mL/min。将色谱柱连接到设置为280nm信号和360nm参考的吸光度检测器。温育2小时后，将粗反应混合物准备好用于HIC纯化。
实施例42.Mono-NPBA-PEG5k-Tras的分离
将0.55L NPBA-PEG5k-Tras粗混合物(10g/L)加入到反应容器中。将1.1L流动相A(1.5M硫酸铵，20mM磷酸钠，pH 7.4)添加到粗混合物中以获得1M硫酸铵，13.3mM磷酸钠，pH7.4浓度。混合后，将样品混合物以200mL/min的流速加载到填充有GE琼脂糖苯基高效HIC树脂的AxioChrom 140色谱柱(1.7L)上。允许大约10分钟的停留时间将样品混合物加载到HIC柱上。将IPA/10mM磷酸钠，pH 7.4(1：4v/v，流动相B)用作洗脱液。在洗脱步骤之前，用两个CV的40％流动相B洗涤色谱柱以去除未结合的物质。将纯化的NPBA-PEG5k-Tras用15CV的梯度为40-100％流动相B洗脱。收集单-聚乙二醇化的Tras(Mono-NPBA-PEG5k-Tras)的级分，并合并用于UF/DF。将Sartocon Slice Hydrosart Cassette 30kDa膜用于Mono-NPBA-PEG5k-Tras的UF/DF。使用7体积的PBS pH 7.4，通过渗滤将Mono-NPBA-PEG5k-Tras缀合物浓缩至50g/L。渗滤后，通过0.22μm PES膜对Mono-NPBA-PEG5k-Tras进行无菌过滤。
实施例43.确定每个Tras的NPBA数量
通过使用NPBA的ARS检测法计算Mono-NPBA-PEG5k-Tras中NPBA-PEG5k的摩尔浓度与Tras的摩尔浓度之比来确定Mono-NPBA-PEG5k-Tras中每个Tras的NPBA数量。为了制作标准曲线，以不同浓度(0-0.0098mM)溶解在pH 7.2的PBS中制备NPBA-PEG5k-AA(27)样品。ARS以0.049mM溶解在水中制备。然后将样品与ARS混合，并使用Varioskan LUX分光光度计(ThermoFisher)和SkanIt(Thermo Fisher)或类似的荧光分析软件测量荧光(Ex：468nm，Em：572nm)。这些数据的线性回归(荧光对浓度)提供了用于确定目标样品中NPBA的校准曲线。
以0.007mM溶解在pH 7.2的PBS中制备感兴趣的样品(例如，Tras和Mono-NPBA-PEG5k-Tras)。Mono-NPBA-PEG5k-Tras中NPBA-PEG的摩尔浓度由Mono-NPBA-PEG5k-Tras样品的平均荧光值和不同已知浓度的NPBA-PEG5k-AA标准品(0-0.0098mM)的荧光值校准曲线，使用以下等式计算：
荧光＝ε*CN+b
其中ε＝校准曲线的线性回归斜率，b＝校准曲线的线性回归的截距，和CN＝NBPA-PEG的浓度(mM)。因此，CN(mM)＝(荧光-b)/ε。
然后根据以下等式通过将CN除以已知的Tras浓度来计算每个Tras的NPBA数量(NTras)：
NTras＝(NPBA-PEG mmol/L)/(Tras mmol/L)
使用NPBA的ARS检测法确定的Mono-NPBA-PEG5k-Tras中NPBA的数量为Mono-NPBA-PEG5k-Tras中每个Tras约1个NPBA。如实施例40中所述，每个Mono-NPBA-PEG5k-Tras的NPBA数量可以通过分子与NPBA的不希望的络合来改变，这会降低荧光信号，或者通过在粗样品中存在过量的未反应的NPBA-PEG缀合物来改变，这会增加荧光信号。示例性实验结果如表3所示。
表3.Mono-NPBA-PEG5k-Tras样品中每个Tras的NPBA数量
样品 C<sub>N</sub>(mM) N<sub>Tras</sub>＝(每个Tras的NPBA数量)
Mono-NPBA-PEG<sub>5k</sub>-Tras(粗品) 1.15E-02 1.64
Mono-NPBA-PEG<sub>5k</sub>-Tras(纯化的) 7.05E-03 1.01
如本领域技术人员将理解的，根据这些教导，本公开的许多修改和变化是可能的，并且所有这些都在此被考虑。例如，除了在此描述的实施方案之外，本公开还考虑并要求保护由本文引用的公开的特征和补充本公开特征的引用的现有技术参考的那些特征的组合产生的那些发明。类似地，应当理解，任何描述的材料、特征或物品可以与任何其他材料、特征或物品组合使用，并且此类组合被认为在本公开的范围内。
本文件中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均以引用的方式全文并入本文，出于所有目的，或至少出于与其被引用的上下文相关的内容。除了已经提到的参考文献之外，本公开还包含与下列文献相关的主题：美国专利申请序列号12/540,319，2009年8月12日提交，现为美国专利8,557,292；13/782,458，2013年3月1日提交；13/782,486，2013年3月1日提交；13/852,303，提交日期：2013年3月28日；15/180,201，2016年6月13日提交，现为美国专利10,287,401；和国际申请号PCT/US2009/053620，2009年8月12日提交，出于所有目的其内容通过引用并入。

Claims (18)

1.具有以下结构的7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)的20-(Boc-氨基酰基)、10-TBDPS衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-10-TBDPS-SN38)：
Figure FDA0003677646280000011
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
2.权利要求1的SN38的20-(Boc-氨基酰基)-10-TBDPS衍生物，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)和己酸的官能团。
3.具有以下结构的SN38的20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc-SN38)：
Figure FDA0003677646280000012
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
4.权利要求3的SN38的20-(Boc-氨基酰基)-10-OBoc衍生物，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的官能团。
5.具有以下结构的SN38的20-氨基酰基衍生物的HCl盐(20-(HCl.氨基酰基)-SN38)：
Figure FDA0003677646280000021
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
6.权利要求5的HCl盐，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸和缬氨酸的官能团。
7.具有以下结构的SN38的20-氨基酰基衍生物的三氟乙酸(TFA)盐(20-(TFA.氨基酰基)-SN38)：
Figure FDA0003677646280000022
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
8.权利要求7的TFA盐，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA、己酸和亮氨酸的官能团。
9.具有以下结构的粘酸聚合物(MAP)-SN38缀合物：
Figure FDA0003677646280000023
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子，
x是20至200范围内的数字；和
y是5至200范围内的数字。
10.权利要求9的MAP-SN38缀合物，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA、己酸和亮氨酸的官能团。
11.包含权利要求10的MAP-SN38缀合物的纳米颗粒。
12.具有以下结构的喜树碱(CPT)的20-(Boc-氨基酰基)衍生物(20-(Boc-氨基酰基)-CPT)：
Figure FDA0003677646280000031
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
13.权利要求12的20-(Boc-氨基酰基)-CPT衍生物，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团。
14.具有以下结构的CPT的20-氨基酰基衍生物的三氟乙酸(TFA)盐(20-(TFA.氨基酰基)-CPT)：
Figure FDA0003677646280000032
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子。
15.权利要求14的TFA盐，其中该氨基酸官能团为选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团。
16.具有以下结构的粘酸聚合物(MAP)-CPT缀合物：
Figure FDA0003677646280000033
其中R为任选地与氨基酸官能团键合的氨基酸的一个或多个α-碳原子，其中该氨基酸官能团为选自丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、GABA和二肽苯丙氨酸-甘氨酸的官能团，
x是20至200范围内的数字；和
y是5至200范围内的数字。
17.包含权利要求16的MAP-CPT缀合物的纳米颗粒。
18.具有以下结构的化合物(NPBA-PEG-AA-PFP)：
Figure FDA0003677646280000041
其中n是2至2000范围内的数字。
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