CN115290882A - 一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备和检测方法试剂盒内包括96孔酶标板架、包被OA抗原的酶标板条、大田软海绵酸标准品、抗大田软海绵酸抗体、缓冲液、铕标记的羊抗鼠IgG、清洗液、增强液，在包被抗原与样品中的抗原竞争与抗体结合的基础上，加入荧光标记的第二抗体与抗原抗体复合物结合，在时间分辨荧光免疫分析仪的检测下，利用标准曲线，得到样品中的抗原浓度，本发明可以检测贝类样品中大田软海绵酸含量，检测时间短，检测效率高，为海产品中的OA检测提供了新的选择。

Description

一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其 制备和检测方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其制备和检测方法，更具体一点说，涉及一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备和检测方法，属于水产品安全检测领域。

背景技术

大田软海绵酸(Okadaic acid，OA)是一种具有耐热性且在酸性条件下稳定的小分子聚醚类化合物。由单细胞藻类产生后，在贝类等海洋生物滤食作用下积累于体内，造成海产品的毒化。贝类因为口味鲜美、营养丰富深受广大消费者的喜爱，但毒素在贝体内的富集阻碍了水产养殖业的健康发展。人们食用被OA污染的贝类后会引起腹泻、恶心、呕吐等症状，且此类症状容易与细菌性肠胃炎混淆，此外OA还具有致癌效应。因此，检测大田软海绵酸保障人们身体健康安全显得尤为重要。

现有的OA检测技术包括小鼠生物法、免疫分析法仪器检测法等。其中，小鼠生物法简便直观，但不能区别毒素的种类且干扰大、不精确；高效液相色谱法虽然准确灵敏但仪器昂贵且样品前处理繁琐费时；免疫分析法利用抗原抗体的特异性结合使得此类检测方法具有特异性强、仪器设备简单、方法易掌握等优点。常见的免疫分析法包括酶联免疫吸附法和金标免疫试纸条，然而他们的灵敏度都较差，微量检测几乎无法进行。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA) 则在抗原抗体特异性结合的条件下，保证了反应的特异性，也对灵敏度进行了提高。

时间分辨荧光免疫分析法是利用三价稀土离子(如Eu³⁺、Sm³⁺、Te³⁺、Dy³⁺等)作为示踪物标记抗体、蛋白质、激素等物质，待反应体系发生后用时间分辨荧光免疫分析仪测定最后产物的荧光强度，以此来判断待测物质浓度的微量分析法。TRFIA无放射性污染，且灵敏度高、稳定性好，应用前景广泛。但目前市场上暂时没有利用TRFIA检测OA的试剂盒以及方法。因此，本发明建立了一种利用时间分辨荧光免疫分析检测大田软海绵酸的方法并研发试剂盒。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有耗时低、仪器成本降低、灵敏度高等技术特点的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明还提供一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法。

本发明还提供一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述试剂盒内包括96孔酶标板架、包被OA抗原的酶标板条、大田软海绵酸标准品、抗大田软海绵酸抗体、缓冲液、铕标记的羊抗鼠IgG、清洗液、增强液。

如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括1个96孔酶标板架和8个包被OA-BSA的 12孔酶标板条。

优选的，所述试剂盒内包括6瓶不同浓度的大田软海绵酸标准品和1瓶抗大田软海绵酸抗体，大田软海绵酸标准品浓度分别为0ng/mL，0.02ng/mL， 0.2ng/mL，2ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，抗大田软海绵酸抗体浓度为2μg/mL。

优选的，所述缓冲液为pH值为7.8，其包含NaCl、BSA、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、Tween-80、以及含NaN₃的Tris-HCl的混合溶液。

优选的，所述铕标记的羊抗鼠IgG由Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)标记羊抗鼠IgG得到。

优选的，所述清洗液为pH值为7.8，其包含Tris、TritonX-100、Tween-20、 NaCl、盐酸的混合溶液。

优选的，所述增强液为3.6‰的冰醋酸、体积浓度为1‰的TritonX-100、 0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.5g/L的醋酸钠、0.03g/L的三辛基氧化膦的混合溶液。

本发明一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其所述制备方法包括：

所述酶标板条的制备如下：用50mmol/LpH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将 OA-BSA稀释至0.5μg/mL作为包被液，在96微孔板各孔中加入100μL，4℃放置过夜；弃去包被液后用0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的 Tween-20，以盐酸调节7.8的缓冲溶液洗涤1次；然后每孔加200μl的含3g/L BSA的缓冲液封闭2h；弃去封闭液后拍干真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用；

缓冲液的制备如下：将8mmol/L的Nacl、0.1％的BSA、50μmol/L的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mol/L的Tween-80和含0.1％NaN₃的Tris-HCl混合并调节pH至7.8；

铕标记的羊抗鼠IgG的制备方法如下：取羊抗鼠IgG抗1mg，采用超滤管转换缓冲条件至含0.155mol/L NaCl的Na₂CO₃-NaHCO₃(50mmol/L pH8.5)缓冲液中；在含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)冻干粉的小瓶中加入1mg/0.5mL的羊抗鼠IgG，25℃磁力搅拌反应20h；反应液经用80mmol/L pH7.8的Tris-Hcl缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测EU³⁺荧光值，收集蛋白峰，用缓冲液按1：100稀释后分装冻干保存；

洗涤液的制备如下：取12.11g的Tris，1g的TritonX-100，27.74g的 Tween-20和312.43g的NaCl加入去离子水中，完全溶解后用盐酸调节pH至7.8，再加入去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃保存；

增强液的制备如下：含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，体积浓度为1‰的 TritonX-100，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.5g/L的醋酸钠，0.03g/L的三辛基氧化膦的混合溶液。

本发明一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，所述检测方法主要包括：

取包被OA抗原的酶标板条置于96孔酶标板架上，加入50μL不同浓度的OA标准品或待测样品，同时加入50μL 8倍稀释的OA抗体，37℃条件下振荡孵育1h，用清洗液清洗2次后加入100μL100倍稀释的铕标记的羊抗鼠IgG，37℃条件下振荡孵育1h，再用清洗液清洗6次，加入100μL增强液振荡5min后用时间分辨荧光免疫分析仪检测其荧光强度。根据OA标准品浓度及其对应的荧光强度绘制标准曲线，然后将待测样品的荧光强度代入对应的标准曲线中，便可得到所述待测样品中OA的含量。

有益效果：灵敏度高、稳定性好，成本降低，应用前景广泛，耗时短、方法易掌握，在抗原抗体特异性结合的条件下，保证了反应的特异性，无放射性污染。

附图说明

图1为本发明免疫分析试剂盒的结构示意图。

图2为本发明OA时间分辨荧光免疫检测标准曲线图。

图1中：1、96孔酶标板架；2、包被OA抗原的酶标板；3、不同浓度的OA 标准品；4、抗OA抗体；5、清洗液；6；缓冲液；7、铕标记的羊抗鼠IgG；8、增强液。

具体实施方式

以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

本发明提供一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，试剂盒包括96孔酶标板架、包被OA抗原的酶标板条、6瓶不同浓度的OA标准品、 1瓶OA抗体、缓冲液、铕标记的羊抗鼠IgG抗体，清洗液、增强液。

酶标板条上的OA抗原与标准品或样品中的OA竞争与OA抗体结合，铕标记的羊抗鼠IgG再与该抗原抗体复合物结合后通过时间分辨荧光免疫分析仪测定其荧光值，便可绘出标准曲线。由标准曲线及检测样品时的荧光值，即可得到贝类样品中OA的浓度。

6瓶大田软海绵酸浓度梯度系列标准品溶液，浓度分别为：0ng/mL， 0.02ng/mL，0.2ng/mL，2ng/mL，20ng/mL，200ng/mL；1瓶大田软海绵酸抗体浓度为2μg/mL。

所述分析缓冲液具体是指pH7.8并包含以下成分：Nacl、BSA、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、Tween-80和含NaN3的Tris-Hcl。清洗液是指pH7.8并包含以下成分：12.11g Tris，1g TritonX-100，27.74g Tween-20，312.43g NaCl。增强液是具体包含：体积浓度为3.6‰的冰醋酸，体积浓度为1‰的TritonX-100， 0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.5g/L的醋酸钠，0.03g/L的三辛基氧化膦。

实施例1 OA时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒的制备

所述包被板的制备如下：用50mmol/LpH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将 OA-BSA稀释至0.5μg/mL作为包被液，在96微孔板各孔中加入100μL，4℃放置过夜；弃去包被液后用0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的 Tween-20，以盐酸调节7.8的缓冲溶液洗涤1次；然后每孔加200μl的含3g/L BSA的缓冲液封闭2h；弃去封闭液后拍干真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用。

分析缓冲液的制备如下：将8mmol/L的Nacl、0.1％的BSA、50μmol/L的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1mol/L的Tween-80和含0.1％NaN₃的Tris-Hcl 混合并调节pH至7.8。

铕标记的羊抗鼠IgG的制备方法如下：取羊抗鼠IgG抗1mg，采用超滤管转换缓冲条件至含0.155mol/L NaCl的Na₂CO₃-NaHCO₃(50mmol/L pH8.5)缓冲液中；在含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)冻干粉的小瓶中加入1mg/0.5mL的羊抗鼠IgG，25℃磁力搅拌反应20h；反应液经用80mmol/L pH7.8的Tris-Hcl缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Eu³⁺荧光值，收集蛋白峰，分装冻干保存。

洗涤液的制备如下：取12.11g的Tris，1g的TritonX-100，27.74g的Tween-20 和312.43g的NaCl加入去离子水中，完全溶解后用盐酸调节pH至7.8，再加入去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃保存。

增强液的制备如下：含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，体积浓度为1‰的 TritonX-100，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.5g/L的醋酸钠，0.03g/L的三辛基氧化膦的混合溶液。

实施例2 OA时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒的应用

所述的检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法为：

将标准品或待测样品加入OA-BSA包被的微孔板中，每孔加50μL，同时每孔加入稀释至0.25μg/mL的OA抗体50μL，37℃振荡反应1小时，用清洗液冲洗2次，每孔加入100μL用分析缓冲液按1：100稀释的Eu³⁺-羊抗鼠IgG， 37℃继续振荡反应1小时，用洗涤液清洗6次，每孔加入100μL增强液，37℃振荡反应5分钟后在DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪上分别检测Eu³⁺的荧光信号，根据标准曲线得到样品中OA的浓度。

基于上述制备的试剂，本发明用于检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括如下材料：

(1)96孔板×1块；

(2)包被有OA-BSA的板条×8条；

(3)大田软海绵酸标准品×6瓶，每瓶2mL，浓度分别为0ng/mL、0.02ng/mL、 0.2ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL；

(4)抗大田软海绵酸抗体×1瓶，2mL，浓度为2μg/mL。

(5)清洗液×1瓶，60mL；

(6)缓冲液×1瓶，60mL；

(7)铕标记的羊抗鼠IgG抗体溶液×1瓶，2mL；

(8)增强液×1瓶，60mL。

具体样品检测步骤如下：

样品的处理方法如下：将剪碎的试样均质，准确称取10g(精确至0.1g)，加入50mL90％的甲醇溶液，均质1～2分钟，6000r/min离心10分钟，转移出上清液，根据上清液体积加入2倍体积的PBS溶液，混合均匀，吸取50μL试样稀释液进行测定。

取包被有OA-BSA的板条，加入50μLOA标准品或样品到各自微孔，加入稀释8倍后的抗OA抗体50μL，37℃振荡孵育1h，清洗液清洗2次，加入100 μL稀释100倍后的铕标记的羊抗鼠IgG，37℃振荡1h，清洗液清洗6次，加 100μL增强液振荡5min后测量荧光强度，根据所得OA标准品浓度及其对应的荧光值得到标准曲线，代入待测样品的荧光强度得到待测样品中OA的含量。检测结果如下：OA标准曲线如图2所示，其回归曲线方程为： y＝-0.19450-1.05403*x，R²＝0.99534。

检测贝类样品结果如表1所示。

表1检测样品中的OA浓度

样品编号	荧光值(cps)	浓度(ng/mL)
			1	66620	1.422988
2	52685	3.203104
			3	27344	21.185637
4	24805	27.305906
			5	68642	1.271878
6	45414	5.101679
			7	30536	15.793699
8	21844	37.770986

上表结果表明该检测方法有较好的灵敏度。

最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括96孔酶标板架、包被OA抗原的酶标板条、大田软海绵酸标准品、抗大田软海绵酸抗体、缓冲液、铕标记的羊抗鼠IgG、清洗液、增强液。

2.如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括1个96孔酶标板架和8个包被OA-BSA的12孔酶标板条。

3.如权利要求1或2所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括6瓶不同浓度的大田软海绵酸标准品和1瓶抗大田软海绵酸抗体，大田软海绵酸标准品浓度分别为0ng/mL，0.02ng/mL，0.2ng/mL，2ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，抗大田软海绵酸抗体浓度为2μg/mL。

4.如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为pH值为7.8，其包含NaCl、BSA、二乙烯三胺五乙酸、Tween-80、以及含NaN₃的Tris-HCl的混合溶液。

5.如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述铕标记的羊抗鼠IgG由Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸标记羊抗鼠IgG得到。

6.如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述清洗液为pH值为7.8，其包含Tris、TritonX-100、Tween-20、NaCl、盐酸的混合溶液。

7.如权利要求1所述的一种检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述增强液为3.6‰的冰醋酸、体积浓度为1‰的TritonX-100、0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.5g/L的醋酸钠、0.03g/L的三辛基氧化膦的混合溶液。

8.一种如权权利要求1-7任一项所述的检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

所述酶标板条的制备如下：用50mmol/LpH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将OA-BSA稀释至0.5μg/mL作为包被液，在96微孔板各孔中加入100μL，4℃放置过夜；弃去包被液后用0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节7.8的缓冲溶液洗涤1次；然后每孔加200μl的含3g/L BSA的缓冲液封闭2h；弃去封闭液后拍干真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存待用；

缓冲液的制备如下：将8mmol/L的Nacl、0.1％的BSA、50μmol/L的二乙烯三胺五乙酸、0.1mol/L的Tween-80和含0.1％NaN₃的Tris-HCl混合并调节pH至7.8；

铕标记的羊抗鼠IgG的制备方法如下：取羊抗鼠IgG抗1mg，采用超滤管转换缓冲条件至含0.155mol/L NaCl的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中；在含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸冻干粉的小瓶中加入1mg/0.5mL的羊抗鼠IgG，25℃磁力搅拌反应20h；反应液经用80mmol/LpH7.8的Tris-Hcl缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱层析，采用DELFIA-1420时间分辨荧光免疫分析仪检测Eu³⁺荧光值，收集蛋白峰，用缓冲液按1：100稀释后分装冻干保存；

洗涤液的制备如下：取12.11g的Tris，1g的TritonX-100，27.74g的Tween-20和312.43g的NaCl加入去离子水中，完全溶解后用盐酸调节pH至7.8，再加入去离子水定容至1L，分装，置于2-8℃保存；

增强液的制备如下：含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，体积浓度为1‰的TritonX-100，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.5g/L的醋酸钠，0.03g/L的三辛基氧化膦的混合溶液。

9.一种如权利要求1-7任一项所述的检测大田软海绵酸的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法主要包括：

取包被OA抗原的酶标板条置于96孔酶标板架上，加入50μL不同浓度的OA标准品或待测样品，同时加入50μL 8倍稀释的OA抗体，37℃条件下振荡孵育1h，用清洗液清洗2次后加入100μL100倍稀释的铕标记的羊抗鼠IgG，37℃条件下振荡孵育1h，再用清洗液清洗6次，加入100μL增强液振荡5min后用时间分辨荧光免疫分析仪检测其荧光强度。根据OA标准品浓度及其对应的荧光强度绘制标准曲线，然后将待测样品的荧光强度代入对应的标准曲线中，便可得到所述待测样品中OA的含量。

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