CN115287271B - 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种类病毒颗粒的制备方法，以及根据所述方法制备的类病毒颗粒。本申请还涉及一种筛选抗SARS‑CoV‑2抗体或者检测SARS‑CoV‑2抗体中和活性的方法，以及一种筛选能够抑制SARS‑CoV‑2感染细胞的候选药物的方法。

Description

一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种SARS-CoV-2类病毒颗粒的制备方法，以及根据所述方法制备的SARS-CoV-2类病毒颗粒。本申请还涉及一种筛选抗SARS-CoV-2抗体或者检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，以及一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法。
背景技术
假病毒是指一种反转录病毒整合了另外一种病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒囊膜，而基因组仍保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒的产生过程为用带有一种病毒外膜蛋白基因的质粒与带有另一种病毒骨架基因的质粒共转染到包装细胞(如293T细胞)中，外膜蛋白基因在包装细胞表面表达出外膜蛋白，另一种病毒的基因在包装细胞中转录翻译组装成病毒颗粒，病毒颗粒出芽时会被细胞表面表达的外膜蛋白所包装，即形成假病毒。
假病毒内部核酸为缺陷型基因组，不能表达假病毒颗粒表面蛋白，因此病毒表面蛋白需要通过额外的质粒转染或细胞系稳定表达来实现。研究表明，新冠病毒SARS-CoV-2是由病毒S蛋白通过细胞hACE2受体结合进入细胞，因此构建新冠假病毒选择的胞膜蛋白为S蛋白。假病毒的骨架载体包含了病毒转录、包装、整合等基因序列，为假病毒提供除膜蛋白外的其余所有蛋白。由于通常情况下假病毒只进行一轮感染，不具备复制增殖能力，因此可以使假病毒***携带报告基因，从而方便后续的定性、定量研究。
利用假病毒感染hACE2基因敲入小鼠的动物模型，可以模拟SARS-CoV-2感染进入细胞的过程，用来评价体内交叉保护作用。因此假病毒适合产生中和抗体的疫苗效果评价。假病毒***具有其独特的优势。由于假病毒不具备自我复制能力，只能进行单一周期的侵染，因此降低了病毒突变率且具有较高的生物安全性，可以降低实验室操作的风险。
因此，需要一种替代活病毒用于疫苗研发及免疫原性中和抗体水平检测的方法，以抗体筛选和检测过程中的操作难度与试验成本。
发明内容
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，对类病毒颗粒的制备方法，以及检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法进行了优化，使得检测结果具有较高的准确性，良好的重复性以及特异性。更进一步的，将上述方法与利用活病毒进行的中和方法进行比较，发现与活病毒的趋势一致，可以一定程度上反应活病毒的结果。制备类病毒颗粒时将新型冠状病毒膜蛋白的C端截断21个氨基酸可以显著提高类病毒滴度，且在进行假病毒滴定和中和试验中发现AF细胞(AF细胞为本实验室构建的将ACE2受体和Furin受体稳定转染的293T细胞)为敏感细胞系。所述方法能够应用于抗SARS-CoV-2抗体或药物的筛选或者检测SARS-CoV-2中和抗体的活性，为SARS-CoV-2疫苗、药物评价、及病毒致病机制的研究提供了良好的技术支撑手段。
因此，在第一方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将骨架质粒与膜质粒以2：1至3：1的比例转入宿主细胞中；其中，所述骨架质粒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述膜质粒含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在某些实施方案中，将所述骨架质粒与膜质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中。
在某些实施方案中，所述骨架质粒是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列***pSG3-△env质粒所获得的。
在某些实施方案中，所述膜质粒是将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列***pcDNA3.1载体，并根据宿主细胞进行密码子优化所获得的。
在某些实施方案中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；例如，293T细胞。
如前所述的方法，所述方法包括：将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。
在某些实施方案中，将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。
在另一方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2类病毒颗粒，其是通过如前所述的方法制备获得的。
在另一方面，本申请提供了一种筛选抗SARS-CoV-2抗体或者检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
在某些实施方案中，方法包括：
步骤(i)：将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述抗体是否是抗SARS-CoV-2的抗体；或者，在免疫斑点读板仪中对所述宿主细胞的阳性细胞数进行计数，并计算ID50值，以检测抗体的中和活性。
在另一方面，本申请提供了一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。
在某些实施方案中，将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
在某些实施方案中，方法包括：
步骤(i)：将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述候选药物能否抑制SARS-CoV-2感染细胞。
如前所述的方法，其中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞为表达ACE2的细胞，例如，293T-ACE2细胞和/或AF细胞。
在某些实施方案中，所述细胞为表达ACE2和Furin的细胞，例如，AF细胞。
如前所述的方法，其中，在步骤(i)中，将如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触36h-48h(例如，36h，38h，40h，42h，44h，46h，48h)。
如前所述的方法，其中，在步骤(i)中，将所述宿主细胞与所述抗体接触0.5h-1h。
如前所述的方法，其中，在步骤(i)中，将MOI的值为0.025的如前所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触。
在某些实施方案中，所述方法的步骤(i)和(ii)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：
步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，稀释后将所述抗体转移至384孔板中，每孔加入10ul所述抗体；
步骤(b)：每孔加入MOI＝0.025的SARS-CoV-2-Spike假病毒，孵育1h；
在某些实施方案中，将所述96孔板置于37℃5％CO2孵箱中孵育1h；
步骤(c)：每孔接种2.5x104细胞/孔的表达ACE2和Furin的细胞(例如，AF细胞)，孵育36-48h。
在某些实施方案中，将所述96孔板置于37℃5％CO2孵箱中孵育36-48h；
步骤(d)：使用Biotec对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算50％中和滴度(NT50)，以评估样本的中和抗体水平；
或者，
所述方法的步骤(1)和(2)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：
步骤(a)：步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，稀释后将所述抗体转移至384孔板中，每孔加入10ul所述抗体；
步骤(b)：用DMEM完全培养基将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒稀释至每孔约400个GFP阳性颗粒数，每孔加10μl所述类病毒颗粒，孵育1h；
在某些实施方案中，将所述384孔板置于37℃5％CO2孵箱中孵育1h；
步骤(c)：将表达ACE2和Furin的细胞(例如，AF细胞)浓度调整为1.5x 105个/ml悬液，每孔加入20ul所述细胞，即每孔细胞加入量为3x 103个，孵育24h；
在某些实施方案中，将所述384孔板置于37℃5％CO2孵箱中孵育24h；
步骤(d)：在免疫斑点读板仪Biotek对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算ID50值，以评估样本的中和抗体水平。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“SARS-CoV-2”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus2)”的简称，旧称为“新型冠状病毒”，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，S蛋白在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“假病毒”和“类病毒”二者具有相同的含义，可互换使用；其是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，从而，所述假病毒或类病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力。因此，与真正的病毒相比，其生物安全性高。假病毒的包装***一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，HIV-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。
在某些实施方案中，所述包装组分为骨架质粒。在某些实施方案中，所述表达组分为膜质粒。在某些实施方案中，所述包装组分包含骨架质粒和辅助质粒。
如本文中所使用的，术语“骨架质粒”和“包装质粒”具有相同的含义，可以互换使用。如本领域技术人员通常理解的，病毒载体***(特别是慢病毒载体***)可以由两部分组成，即，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)和载体成分(例如，携带目的基因的重组表达载体)；其中，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)可提供转录和包装遗传物质(例如RNA)到重组的假病毒颗粒内所需要的所有辅助蛋白。由此，可通过下述方式产生高滴度的假病毒颗粒：用重组表达载体和包装质粒共转染细胞，然后在细胞中进行假病毒的包装，随后包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。此类包装质粒或骨架质粒是本领域技术人员熟知的，例如，以HIV-1为基础构建的骨架质粒：包括但不限于，pSG3-Δenv(Wei X等人，Antibody neutralization and escape by HIV-1.Nature 422:307-312,2003)和NL4-3.Fluc.R-.E-(Connor RI,等人，Vpr is required for efficient replication ofhuman immunodeficiency virus type-1in mononuclear phagocytes.Virology 206:935–944,1995)。
如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK21细胞，HEK 293T细胞或人细胞等的动物细胞。
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如轮状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如轮状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由轮状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，术语“MOI(multiplicity of infection)”是指病毒感染宿主细胞时，病毒与细胞数量的比值。通常认为MOI是一个比值，没有单位，其隐含的单位也可以是pfu number/cell。选择合适的MOI值，病毒的感染效率会提高。
如本文中所使用的，术语“FFU/ml(focus-forming units per ml)”是指病毒滴度，表示为每毫升的AmCyan阳性细胞数。
发明的有益效果
与现有技术相比，本申请提供的SARS-CoV-2类病毒颗粒的制备方法，以及检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法能够检测多种不同的抗体，且检测结果均具有较高的准确性，良好的重复性以及特异性。更进一步的，将上述方法与利用活病毒进行的中和方法进行比较，发现与活病毒的趋势一致，可以一定程度上反应活病毒的结果。所述方法能够应用于抗SARS-CoV-2抗体或药物的筛选或者检测SARS-CoV-2中和抗体的活性，为SARS-CoV-2疫苗、药物评价、及病毒致病机制的研究提供了良好的技术支撑手段。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了pSG3-△env-CMV+Kozac+AmCyan骨架质粒的构建图。
图2显示了D614G与D614Gdel21突变示意图。
图3显示了包装SARS-CoV-2-Spike荧光假病毒的流程图。
图4显示了通过六孔板摸索骨架质粒和膜质粒比例的示意图。
图5显示了3倍梯度稀释滴定收获的SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒。
图6显示了5种不同比例的骨架质粒与膜质粒转染293T细胞后，收获荧光假病毒上清，AF细胞滴定后所检测的AmCyan阳性细胞数。
图7显示了SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan和SARS-CoV-2-D614G-AmCyan对不同细胞(AF、Hela-ACE2、293T、BHK21-ACE2和ACE2)的感染效率的比较结果。
图8显示了假病毒使用AF细胞滴定后在不同时间(0h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h和120h)的AmCyan的阳性细胞数的比较结果。
图9显示了三种样品(单克隆抗体AM180、人新型冠状病毒阳性血清和豚鼠阳性血清)与SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan假病毒的中和试验在不同检测时间(24h、36h、48h、72h、96h)的ID50值的差异结果。
图10显示了不同样本在不同细胞加入量(细胞/孔)的四参曲线；其中，图10A为人血清样本；图10B为豚鼠血清样本；图10C为单克隆抗体。
图11显示了不同样本在不同病毒加入量MOI的四参曲线；其中，图11A为人血清样本；图11B为豚鼠血清样本；图11C为单克隆抗体。
图12显示了在细胞加入量为2.5x 104细胞/孔，病毒接种量MOI＝0.0125条件下，不同孵育时间对SARS-CoV-2-D614Gdel21荧光假病毒中和试验结果的影响。
图13显示了荧光体系SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan假病毒与化学发光体系SARS-CoV-2-D614Gdel21-Fluc假病毒测定7份豚鼠血清的ID50值的线性回归分析。
图14显示了SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒中和试验方法学验证结果，其中，图14A为荧光假病毒中和试验方法灵敏度与检出限结果；图14B为荧光假病毒中和试验方法重复性验证结果；图14C为荧光假病毒中和试验方法特异性验证结果。
图15显示了SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒中和试验与SARS-CoV-2-D614Gdel21-Fluc中和试验测定ID50值相关性分析
图16显示了48份新型冠状病毒人临床血清样本在96孔板和384孔板中和试验测定ID50值结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.假病毒的滴定试验与中和试验
细胞与样本：293T(美国典型培养物保藏中心[ATCC]，CRL-3216)使用提供100U/mL青霉素-链霉素溶液(GIBCO)和10％胎牛血清(FBS,Pansera ES,PAN-Biotech)在5％CO2环境中37℃培养。将ACE2受体和Furin受体稳定转染在293T细胞上，得到并命名为AF细胞(本实验室构建，构建方法为：通过云舟生物有限公司构建ACE2受体和Furin受体的慢病毒，效价为108IFU/mL实验室将上述慢病毒(MOI＝100)和10ug/uL的凝聚胺(polybrene)转导293T细胞，37℃5％CO2孵箱培养48h后进行药筛，直至培养基中不再出现悬浮的死细胞，经过2-3周稳定的嘌呤霉素药物筛选，得到稳定转染ACE2受体和Furin受体的293T细胞，命名为AF细胞)。
1、基于假病毒的滴定试验
基于透明96孔板的滴定试验，取收获的假病毒SARS-CoV-2-Spike上清，首列加入原倍病毒上清液，之后横向3倍梯度稀释假病毒，共9个稀释度，第10列为细胞对照，每孔加入2.5x104细胞/孔的AF细胞，37℃孵育36-48h，使用Biotek对其AmCyan阳性细胞数进行计数，得到SARS-CoV-2-Spike假病毒滴度(FFU/ml)。
基于透明384孔板进行滴定试验，首先使用INTEGR VIAFL0384仪器对384孔板四周进行无菌水封边，每孔80ul，防止内部液体蒸发而导致的边缘效应。之后使用透明96孔U型板在A-G行进行假病毒的稀释，取收获的假病毒SARS-CoV-2-S上清，首列加入原倍病毒上清液，之后纵向2倍梯度稀释假病毒，共7个稀释度。使用INTEGR ASSIST PLUS移液工作站将U型板中液体转移至384孔板，每个样品设置两个平型对照，加液量为每孔10ul，转板完毕后，使用INTEGR ASSIST PLUS仪器自动化加入3x103细胞/孔的AF细胞，每孔20ul，37℃5％CO2孵箱中培养24h后使用Biotek对其AmCyan阳性细胞数进行计数，以其计算测得阳性点数与细胞数的比值，得到SARS-CoV-2-Spike假病毒滴度。
2、基于假病毒的中和试验
基于透明96孔板的中和试验，将待测的样品进行1：30初始稀释，之后3倍梯度稀释，每孔加入MOI＝0.025的SARS-CoV-2-Spike假病毒，37℃孵育1小时，每孔接种2.5x104细胞/孔AF细胞，于37℃5％CO2孵箱孵育36-48h后使用Biotec对其AmCyan阳性细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算ID50值，以评估样本的中和抗体水平。
基于透明384孔板的中和试验，取96孔U型板，于A2-G11孔中进行待测样品的稀释，每板加入10个样品，首行进行15倍稀释，使用INTEGR ASSIST PLUS移液工作站进行3倍梯度稀释，共7个梯度，稀释完毕后使用INTEGR ASSIST PLUS移液工作站将U型板中待测样品转移至384孔板，设置两个复孔，每孔10ul。用DMEM完全培养基将假病毒稀释至每孔约400个GFP阳性颗粒数，于第B3-O23孔，每孔加10μl，37℃5％CO2孵箱中孵育1h，将AF细胞终浓度调整为1.5x 105个/ml悬液，每孔加入20ul，即每孔细胞加入量为3x 103个，再次将384孔板置于37℃5％CO2孵箱中培养24h，在免疫斑点读板仪Biotek对其AmCyan阳性细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算ID50值，以评估样本的中和抗体水平。
3、软件和数据分析
使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad，San Diego，CA)和Microsoft Excel对数据进行处理。使用GraphPad Prism 8软件对样本稀释倍数与抑制率绘制四参曲线，绘制荧光体系与化学发光体系中和试验数据线性回归曲线，IBS 1.0软件绘制SARS-CoV-2与C端截短21个氨基酸的模式图。
实施例2.假病毒构建的优化
为了探究SARS-CoV-2-Spike假病毒构建过程中骨架质粒的影响，本实施例构建了不同的骨架质粒，按照实施1所描述的方法进行中和实验，比较了不同骨架质粒的效果。其中，构建假病毒所使用的骨架质粒如下：
1、pSG3-△env-CMV+Kozac+AmCyan骨架质粒
为包装携带SARS-CoV-2Spike蛋白的HIV体系假病毒，使用Hpa I单酶切pSG3-△env骨架质粒，通过pcr技术将如SEQ ID NO:1所示(青色荧光报告基因(AmCyan)起始序列处添加CMV启动子和Kozac序列)的核苷酸序列***所述pSG3-△env骨架质粒中(获赠自中国食品药品检定研究院艾滋病性病病毒疫苗室)，得到pSG3-△env-CMV+Kozac+AmCyan骨架质粒(图1)。
构建假病毒所使用的膜质粒与假病毒包装过程均相同，具体如下：
膜质粒是将D614G(GISAID:EPI_ISL_766872)构建在pcDNA3.1载体上，并根据哺乳动物真核细胞进行密码子优化，得到pcDNA3.1-SARS-CoV-2-D614G质粒，在此基础上，将其C端截断21个氨基酸(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，得到pcDNA3.1-SARS-CoV-2-D614Gdel21质粒(图2)。
包装SARS-CoV-2-Spike假病毒的过程是用如上所构建的骨架质粒分别与SARS-CoV-2Spike蛋白表达质粒以2:1比例在Lipofilter转染试剂的作用下共转染293T细胞。转染过程中将293T细胞培养基由完全培养基换为血清浓度为2％的DMEM，在48小时后收获含有假病毒的上清液，并加入新鲜的2％的DMEM，再次收获的上清与48h前收获的上清混合，4℃4000rpm/min离心20min，离心上清分装后储存在-80℃备用。
实施例3.假病毒包装过程的优化
本实施例对包装荧光假病毒时pSG3-△env-CMV+Kozac+AmCyan骨架质粒与SARS-CoV-2-D614Gdel21膜质粒加入量进行了优化。
通过pSG3-△env-CMV+Kozac+AmCyan骨架质粒与SARS-CoV-2-D614Gdel21和SARS-CoV-2-D614G膜质粒以不同的比例转染293T细胞，得到SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan和SARS-CoV-2-D614G-AmCyan假病毒，具体步骤按照程序所示(图3)。
使用293T细胞包装SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan假病毒，我们在6孔板中探究骨架质粒与膜质粒的加入量比例(表2，图4)，每孔质粒总量为6ug。收获的假病毒上清滴定结果显示(图5)，在五种骨架质粒与膜质粒比例中，荧光假病毒在3倍梯度稀释下，36h后检测AmCyan阳性荧光细胞数，发现在骨架质粒：膜质粒＝2:1和3:1时AmCyan阳性荧光颗粒数相差不大，但骨架质粒：膜质粒＝2:1时AmCyan阳性细胞数略多(图6)。
表2.骨架质粒与膜质粒的加入量比例
实施例4.中和实验过程的优化
1、靶细胞的探索
为了探究SARS-CoV-2-Spike假病毒在中和实验中靶细胞的影响，本实施例按照实施例1所描述的方法进行中和实验，比较了不同靶细胞(均获赠自中国食品药品检定研究院艾滋病性病病毒疫苗室)的效果。
具体如下：
我们进一步研究了荧光假病毒(SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan、SARS-CoV-2-D614G-AmCyan)在不同靶细胞中的感染性。我们发现在AF细胞中AmCyan荧光信号最强，其次是ACE2(图7)，表明在293T细胞上稳定转染ACE2受体和Furin受体的AF细胞为敏感细胞。SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan在AF细胞中的AmCyan的阳性数约为C端不截断21个氨基酸的SARS-CoV-2-D614G-AmCyan假病毒的65倍，表明C端截断21个氨基酸可以显著增强其感染效力。
2、感染时间的探索
为了探究SARS-CoV-2-Spike假病毒在中和实验中感染靶细胞时间的影响，本实施例按照实施1所描述的方法进行中和实验，比较了不同感染时间的效果。具体如下：
为了确定最佳的检测时间，我们在滴定实验中荧光假病毒SARS-CoV-2-Spike和细胞37℃孵育后0h、8h及每间隔12h检测其AmCyan阳性细胞数(图8)，在中和试验中监测三份代表样品：单克隆抗体AM180(获赠于北京百普赛斯生物科技有限公司)、新冠疫苗人异源免疫后阳性血清(获赠于广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室)和豚鼠D614G蛋白(获赠自中国食品药品检定研究院艾滋病性病病毒疫苗室)三针免疫血清，在不同时间检测的ID50值(图9)。
滴定试验结果所示在12h前观察不到荧光现象，在感染后24h-48h阳性细胞数量迅速增加，在48h内达到平台期，并在36h-60h之间保持稳定。中和试验不同时间检测的结果显示36-48h的样品ID50值较为稳定。由于假病毒不能产生子代病毒，被感染的细胞数量将是感染效率的一个较好的指标。因此，通过计数36-48h的AmCyan阳性细胞的数量，可以定量假病毒的感染效率及中和抗体水平。
3、细胞、病毒加入量的探索
为了探究新冠荧光假病毒SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan中和试验中细胞、病毒加入量的影响，本实施例按照实施1所描述的方法进行中和实验，并进行了比较。具体如下：
我们对SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan中和试验的细胞和病毒加入量进行了优化，选取了三份有代表性的新型冠状病毒阳性样本：针对新型冠状病毒的单克隆抗体AM180、新冠疫苗人异源免疫后阳性血清和豚鼠D614G蛋白三针免疫血清。为了确定最佳的细胞接种量，将细胞加入量定在1.5625x 103-5x 104细胞/孔之间、在病毒加入量为MOI＝0.0125条件下进行假病毒中和试验，计算样本在不同稀释度下(log10)与抑制率的拟合四参曲线(图10ABC)，R2均大于0.99，表明曲线拟合较好，当细胞加入量为2.5x 104细胞/孔时，三份样品的检测值ID50最高，根据上述结果最终选择2.5x 104细胞/孔作为最佳细胞接种量。
为了确定最佳的病毒加入量，我们将加入病毒的MOI范围定在0.00625-0.2之间，细胞加入量为2.5x 104细胞/孔，同样计算样本在不同稀释度下(log10)与抑制率的拟合四参曲线(图11ABC)，R2均大于0.99，表明曲线拟合较好，当病毒MOI＝0.025-0.0125，样本ID50值趋于稳定，在MOI＝0.025时，三份样品的ID50值最高，高于或低于上述MOI范围时，ID50值呈现下降趋势，因此将病毒的加入量确定为MOI＝0.025，控制AmCyan的阳性细胞数约在800左右。
新冠荧光假病毒SARS-CoV-2-D614Gdel21中和试验中孵育时间的优化
为了确定中和试验时样本与荧光假病毒的孵育时间，将孵育时间定为0h、0.5h、1h、2h、4h，分别检测了不同孵育时间对假病毒样品ID50值的影响(图12)。结果发现孵育时间为0.5-1h时，检测的ID50值无明显差异，孵育时间大于2h时，ID50值会随之降低，因此我们确定最佳孵育时间范围为0.5-1h。
实施例5.方法学验证
1、准确度
将本研究建立的HIV体系SARS-CoV-2-Spike-AmCyan荧光假病毒中和试验方法与实验室现有的VSV体系SARS-CoV-2-Spike-Fluc假病毒中和试验方法进行对比，我们选取7只以三针免疫D614G Spike-Trimer 14天后取血的豚鼠血清为试验样本，使用上述两种中和试验方法同时测定得到的ID50值进行线性回归分析(图13)，得到线性方程为y＝1.8414x+857.45R2＝0.9933(X轴为VSV化学发光体系ID50值，Y轴为HIV荧光体系ID50值)，表明本研究建立的荧光SARS-CoV-2-Spike-AmCyan假病毒中和试验方法与实验室现有的化学SARS-CoV-2-Spike-Fluc假病毒中和试验方法间具有良好的相关性。
2、检出限
为了确定此中和方法的cutoff值，样本为50份人新冠阴性血清和50份豚鼠阴性血清，初始2倍稀释，然后进行2倍连续稀释，计算50％抑制稀释倍数(ID50)(图14A)。结果显示人阴性血清的置信区间(平均值±SD)为24.59±6.50，豚鼠阴性血清样本的置信区间(平均值±SD)为30.98±7.11，检出限＝平均值+1.96SD，因此人血清检出限为37.33，豚鼠血清的检出限为44.92。最终人血清样本和鼠血清样本的cutoff值分别定为40和50。
3、重复性
为证明该方法的重复性，我们选择了20份三针spike蛋白免疫的豚鼠血清，用D614G假病毒检测中和抗体滴度ID50，在不同时间重复检测3次，每次实验分别对样本进行2次重复检测(图14B)，试验内的CV在0.04％-14.2％值在之间，试验间的变异度CV值在4.20％-19.90％之间，显示该检测方法具有良好的重复性。
4、特异性
为证明该方法的特异性，我们选取了4份SARS阳性血清、4份MERS阳性血清、4份RSV阳性血清、4份SARS-CoV-2阳性血清，用SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒进行中和试验，测定其ID50值(图14C)结果显示，SARS、MERS、RSV阳性血清并不能中和SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒，只有SARS-CoV-2阳性血清对SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒有良好的抑制作用，因此该方法具有良好的专属性和特异性。
实施例6.应用
对优化后的SARS-CoV-2-S-AmCyan荧光假病毒中和试验方法应用，我们用6种免疫原(D614G(GISAID:EPI_ISL_766872)；VOC Alpha(GISAID:EPI_ISL_1164753)、VOC Beta(GISAID:EPI_ISL_2695882)、VOC Gamma(GISAID:EPI_ISL_4536760)、VOC Delta(GISAID:EPI_ISL_11890620)、VOC Omicron(GISAID:EPI_ISL_11890623)对雌性豚鼠进行三针spike-trimer蛋白免疫，每组7只，共得到42份血清样本。使用SARS-CoV-2-D614Gdel21-AmCyan荧光假病毒在上述优化后的96孔板中和试验方法和化学发光中和试验方法同时进行，并绘制线性回归方程，得到两者的线性关系为y＝1.7922x+936.55R2＝0.9825(图15)，再次印证该荧光假病毒中和试验方法与化学发光方法的一致性，此外我们测定了9株单克隆抗体，其中10D12表现出显著的中和活性(图14B)。我们将上述9株单克隆抗体假病毒中和试验结果与活毒结果进行比对，发现趋势是一致的(表3，图14C)，表明该研究建立的HIV体系假病毒中和试验方法可以一定程度上反应活病毒的结果。
表3.9株单克隆抗体真/假病毒中和试验IC50值对比
为了解决传统PRNT和96孔板的PBNA试验(基于假病毒的中和抗体试验)测定法通量低，无法实现自动化等局限性，我们在96孔板基础上发展了384孔板的新型冠状病毒中和抗体测定方法，该方法与96孔板方法同时测定了48份新型冠状病毒人临床血清，结果显示两者ID50值无显著性差异(p＝0.29>0.05)(图16)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
<130> IDC220167
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 骨架质粒的***片段
<400> 1
tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact agttattaat 60
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 120
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 180
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 240
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 300
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 360
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 420
ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 480
tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 540
aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 600
tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa 660
ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg tttaaactta agcttggtac 720
cgagctcggc cacctcggcc accatggccc tgtccaacaa gttcatcggc gacgacatga 780
agatgaccta ccacatggac ggctgcgtga acggccacta cttcaccgtg aagggcgagg 840
gcagcggcaa gccctacgag ggcacccaga cctccacctt caaggtgacc atggccaacg 900
gcggccccct ggccttctcc ttcgacatcc tgtccaccgt gttcatgtac ggcaaccgct 960
gcttcaccgc ctaccccacc agcatgcccg actacttcaa gcaggccttc cccgacggca 1020
tgtcctacga gagaaccttc acctacgagg acggcggcgt ggccaccgcc agctgggaga 1080
tcagcctgaa gggcaactgc ttcgagcaca agtccacctt ccacggcgtg aacttccccg 1140
ccgacggccc cgtgatggcc aagaagacca ccggctggga cccctccttc gagaagatga 1200
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<210> 2
<211> 3822
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 膜质粒的***片段
<400> 2
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa tctgaccacc 60
agaacccagc tgcctcctgc ctacaccaat agcttcacca gaggagttta ttatcccgat 120
aaggtgttca gaagtagtgt attacatagt acccaggacc tgttcctacc tttcttcagt 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcaccaa gagattcgac 240
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ctgggtgttt attatcataa gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt ccgcgtatat 480
tcgtcggcta ataattgcac cttcgagtac gtgagccagc ctttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaatctgaga gagttcgtgt tcaagaatat cgacggctac 600
ttcaagatct acagcaagca cacacccatt aatctggtga gagacctgcc tcagggcttc 660
agcgccctgg agcctctggt ggacctgcct atcggcatca atatcaccag attccagacc 720
ctgctggccc tgcacagatc atatcttaca ccaggcgatt cgtcaagcgg ttggaccgct 780
ggagctgcgg catattacgt gggctacctg cagcctagaa ccttcctgct gaagtacaat 840
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cctgtggcca tccacgccga ccagctgact cccacttgga gggtatattc cacgggaagc 1920
aatgtgttcc agaccagagc cggctgcctg atcggcgccg agcacgtgaa taatagctac 1980
gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgcgccagct accagaccca gaccaatagc 2040
cctagaagag ccagaagcgt ggccagccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100
gccgagaata gcgtggccta cagcaataat agcatcgcca tccctaccaa tttcaccatc 2160
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ctacctcctc tgctgaccga cgagatgata gcacaatata cgtcggcatt gctcgctggc 2640
acgatcacat cgggctggac tttcggcgcc ggagcagcgt tgcaaatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct acagattcaa tggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaatcag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt caatagcgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc 2820
accgccagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaatc agaatgccca ggccctgaat 2880
accctggtga agcagctgag cagcaatttc ggcgccatca gtagtgtact caacgacatc 2940
ctgagcagac tggacaaggt ggaggccgag gtgcaaattg atcgtcttat tactggcaga 3000
ctgcagagcc tgcagaccta cgtgacccag cagctgatca gagccgccga gatcagagcc 3060
agcgccaatc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagag caagagagtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg agcttccctc agagcgctcc acatggcgtg 3180
gtgttcctgc acgtgaccta cgtgcctgcc caggagaaga atttcaccac cgcacccgca 3240
atctgccacg acggcaaggc ccacttccct agagagggcg tgttcgtgag caatggcacc 3300
cactggttcg tgacccagag aaatttctac gagcctcaga tcatcaccac cgacaatacc 3360
ttcgtgagcg gcaattgcga cgtggtgatc gggatagtca ataatactgt ctacgaccct 3420
ctgcagcctg agctggacag cttcaaggag gagctggaca agtacttcaa gaatcacacc 3480
agccctgacg tggacctcgg tgatatttcg ggaatcaatg ccagcgtggt gaatatccag 3540
aaggaaattg atcggctcaa cgaagtggcc aagaatctga atgagagcct gatcgacctg 3600
caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gacctcctgt 3720
tgttcctgtt tgaaagggtg ttgttcgtgt gggtcctgct gcaagttcga cgaggacgac 3780
agcgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct aa 3822

Claims (15)

1.一种SARS-CoV-2类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将骨架质粒与膜质粒以2：1至3：1的比例转入宿主细胞中；其中，所述骨架质粒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述膜质粒含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
其中，所述方法包括如下步骤：
(1)将所述的骨架质粒与膜质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中；
(2)所述骨架质粒是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列***pSG3-△env质粒所获得的；
(3)所述膜质粒是将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列***pcDNA3.1载体所获得的；
(4)所述宿主细胞为人的细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述细胞选自人的造血细胞，人的上皮细胞，人的肝细胞，人的肿瘤细胞，人的神经细胞，或其任意组合。
3.权利要求1所述的方法，所述方法包括：将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。
4.一种SARS-CoV-2类病毒颗粒，其是通过权利要求1-3任一项所述的方法制备获得的。
5.一种筛选抗SARS-CoV-2抗体或者检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
6.权利要求5所述的方法，所述方法包括：
步骤(i)：将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；
步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述抗体是否是抗SARS-CoV-2的抗体；或者，在免疫斑点读板仪中对所述宿主细胞的阳性细胞数进行计数，并计算ID50值，以检测抗体的中和活性。
7.一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。
8.权利要求7所述的方法，所述方法包括：
步骤(i)：将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述候选药物接触；
步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述候选药物能否抑制SARS-CoV-2感染细胞。
9.权利要求5-8任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞选自人的造血细胞，人的上皮细胞，人的肝细胞，人的肿瘤细胞，人的神经细胞，或其任意组合。
10.权利要求5-8任一项所述的方法，所述宿主细胞为表达ACE2的细胞。
11.权利要求5-8任一项所述的方法，所述宿主细胞为表达ACE2和Furin的细胞。
12.权利要求6或8所述的方法，其中，在步骤(i)中，将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触36h-48h。
13.权利要求6所述的方法，其中，在步骤(i)中，将所述宿主细胞与所述抗体接触0.5h-1h。
14.权利要求6或8所述的方法，其中，在步骤(i)中，将MOI的值为0.025的权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒与宿主细胞接触。
15.权利要求6所述的方法，其中，所述方法的步骤(i)和(ii)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：
步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，每孔加入10μl所述抗体；
步骤(b)：每孔加入MOI＝0.025的SARS-CoV-2-Spike假病毒，孵育1h；
步骤(c)：每孔接种2.5x104细胞/孔的表达ACE2和Furin的细胞，孵育36-48h；
步骤(d)：使用Biotec对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算50％中和滴度(NT50)，以评估样本的中和抗体水平；
或者，
所述方法的步骤(i)和(ii)通过下述步骤(a)至步骤(d)进行：
步骤(a)：在96孔板中进行抗体的梯度稀释，稀释后将所述抗体转移至384孔板中，每孔加入10μl所述抗体；
步骤(b)：用DMEM完全培养基将权利要求4所述的SARS-CoV-2类病毒颗粒稀释至每孔约400个GFP阳性颗粒数，每孔加10μl所述类病毒颗粒，孵育1h；
步骤(c)：将表达ACE2和Furin的细胞浓度调整为1.5x 105个/ml悬液，每孔加入20μl所述细胞，即每孔细胞加入量为3x 103个，孵育24h；
步骤(d)：在免疫斑点读板仪Biotek对AmCyan阳性的所述细胞数进行计数，并使用Reed-Muench方法计算ID50值，以评估样本的中和抗体水平。
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