CN113633764A - 一种含佐剂的新冠dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种DNA疫苗组合物及其用途。具体而言，本发明涉及针对冠状病毒的DNA疫苗组合物，以及包含所述DNA疫苗组合物的药物组合物。此外，本发明还涉及所述DNA疫苗组合物的用途。本发明的DNA疫苗组合物可用于预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。

Description

一种含佐剂的新冠DNA疫苗
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是冠状病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及针对新型冠状病毒的 DNA疫苗组合物，以及包含所述DNA疫苗组合物的药物组合物。此外，本发明还涉及所述DNA疫苗组合物的用途。本发明的DNA疫苗组合物可用于预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
背景技术
2019年冠状病毒引起的疾病(COVID-19)已在全球造成健康危机。严重急性呼吸***综合症2(SARS-CoV-2)是一种单链正义核糖核酸(RNA)病毒，其刺突蛋白(Spike蛋白)决定了病毒的传染性以及在宿主中的传播能力。病毒的Spike蛋白也非常不稳定，Spike蛋白的突变可能会导致病毒的传染性增加。由于目前没有对公众有效的治疗方法，因此迫切需要有效的预防方法，尤其是疫苗。
目前，许多研究发现SARS-CoV-2的Spike蛋白基因有多种突变，其中D614G是最重要的突变以及突变组合，例如D614G+I472V (Zhou,B.,et al.,SARS-CoV-2 spike D614Gvariant confers enhanced replication and transmissibility.bioRxiv,2020；Plante,J.A.,et al.,Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness.Nature,2020；Li,Q.,et al., The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on ViralInfectivity and Antigenicity.Cell,2020.182(5):p.1284-1294e9.)。其他研究发现，某些突变位点可以降低病毒的传染性，如L452R和V483A，但这些位点可以耐受一些中和抗体(Li,Q.,et al.,The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on ViralInfectivity and Antigenicity.Cell,2020. 182(5):p.1284-1294e9.)。此外，B.1.1.7变体以及许多遗传变化的变体在英国迅速增加，B.1.1.7变体由于N501Y的突变，可能会增加病毒与人血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合(Leung,K.,et al.,Early transmissibilityassessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2 in the United Kingdom,October to November 2020.Euro Surveill,2021. 26(1).)。独特的南非株系(501Y.V2)也包括多个可能具有功能意义的非同义spike突变，例如spike受体结合域中的K417N、E484K和 N501Y(Tegally,H.,et al.,Emergence and rapid spread of a new severeacute respiratory syndrome-related coronavirus 2(SARS-CoV-2)lineage withmultiple spike mutations in South Africa.medRxiv,2020:p.2020.12.21.20248640.)。
此前，DNA疫苗已成功的预防了多种不同的传染病，并且其与常规疫苗相比具有很大优势，因为它们的设计非常简单，只需一步就能克隆到质粒载体中。此外，抗原基因在体内的表达可以保持蛋白质的天然结构，确保其适当的加工和免疫呈递。值得注意的是，DNA疫苗在实际使用中的最大挑战是能否引发足够的免疫原性。
为了解决这个问题，许多不同的策略已应用于临床前模型中，包括用分子佐剂配制DNA疫苗。佐剂是免疫调节剂，几十年来一直用于治疗各种临床疾病。
例如，CpG ODN已被公认为多种疫苗的免疫佐剂，因为它可以辅助激活动物和人类先天性和适应性免疫反应。CPG-ODN还可以直接刺激单核细胞、巨嗜细胞和树突细胞分泌多种细胞因子，如TNF-α和 GM-CSF，进而刺激辅助T细胞产生免疫反应。
发明内容
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，构建了一种表达SARS-Cov-2 Spike蛋白的DNA疫苗，并使用BC01作为佐剂。出人意料的发现，这种组合可以引发有效的产生针对新冠的中和抗体，并产生细胞介导的免疫反应，以预防和/或治疗SRAS-CoV-2病毒的引起的感染或疾病。
在第一方面，本申请提供了一种疫苗组合物，其包含或由以下成分组成：作为佐剂成分的第一核酸分子，以及作为免疫原成分的第二核酸分子；所述第一核酸分子含有编码卡介苗(BCG)非甲基化的CpG基序的核苷酸序列，并且，所述第二核酸分子含有编码SARS-CoV-2 Spike蛋白的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述卡介苗(BCG)非甲基化的CpG基序是通过将卡介苗的菌体裂解，并提取裂解液中的核酸而获得的。
在某些实施方案中，所述SARS-CoV-2S蛋白具有如下所示的序列：GenBank：MN_908947。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子和第二核酸分子包含于同一载体中(例如，pSV10载体)，或者分别包含于不同的载体中。
所述疫苗组合物中的佐剂成分和免疫原成分，可以处于单一药用制剂中的两种成分的混合物形式，或者处于一个试剂盒中的各个成分的分离形式。并且，所述两种成分可以是分开、顺序或同时进行给药的。在某些实施方案中，两种成分基本上同时进行给药。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子是通过中国发明专利 ZL200410033878.1中记载的方法制备的，此专利内容全文引入本申请中。在某些实施方案中，所述第一核酸分子的制备方法包括：将菌种接种于适合分枝杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体经破碎后离心收集上清液；上清液经CTAB的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层，该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀，对该沉淀进行后处理。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子是通过中国发明专利 ZL201310586057.X中记载的方法制备的，此专利内容全文引入本申请中。在某些实施方案中，所述第一核酸分子的制备方法包括：利用Q Sepharose HP离子交换柱从卡介苗裂解液分离卡介苗CpG-DNA，其中卡介苗CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离可以在TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系中进行。在某些优选的实施方案中，其中卡介苗CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离在磷酸钠缓冲体系中进行时，洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5。在某些优选的实施方案中，其中所述洗脱缓冲液为pH7.5。在某些优选的实施方案中，上样时使用上样缓冲液，上样缓冲液为0-0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液， pH7.5-8.5。在某些优选的实施方案中，所述上样缓冲液为0.5M氯化钠 +50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。在某些优选的实施方案中，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。在某些优选的实施方案中，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。在某些优选的实施方案中，其中卡介苗CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离在TE缓冲体系中进行时，洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5。在某些优选的实施方案中，其中所述洗脱缓冲液为pH7.5。在某些优选的实施方案中，上样时使用如下的上样缓冲液，上样缓冲液为0- 0.5MNaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5。在某些优选的实施方案中，所述上样缓冲液为0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5。在某些优选的实施方案中，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为25-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。在某些优选的实施方案中，其中卡介苗裂解液在Q Sepharose HP 离子交换柱分离纯化前进一步进行了澄清化处理。在某些优选的实施方案中，其中所述的卡介苗裂解液澄清化处理方法是将破碎的菌体裂解液稀释到200mg/ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、8000-12000rpm/min 离心，10-20min×2次，收集上清，和/或经1.0-1.2μm的滤器过滤。
本领域技术人员已知的，所述第一核酸分子还可以由上述方法的改进方法制备获得。这些示例性的方法获得的所述第一核酸分子都能用于本发明的疫苗组合物，并产生良好的免疫佐剂效果。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子的CpG含量可以通过高效液相检测而获得。例如可以采用ZL200410033878.1中记载的通过反相- 高效液相法(RP-HPLC)，采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m5-dC)，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m5-dC检出量的差别而对CpG进行定量。
在某些实施方案中，所述卡介苗菌种为中国卡介苗制备用卡介苗株 D2PB302，由中国药品生物制品检定所菌苗室提供。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子包含或不包含于载体(例如，pSV10载体)中。
在某些实施方案中，所述第二核酸分子包含或不包含于载体中。在某些实施方案中，所述第二核酸分子包含于能够表达所述SARS-CoV-2 S蛋白的载体中(例如，pSV10载体)。
在某些实施方案中，所述DNA疫苗为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的含量比例为1：2至1：10(例如，1：2，1：3，1：4，1：5，1：6，1：7， 1：8，1：9或1：10)。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的比例为1：5。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子的含量为1μg至100μg(例如，1μg，10μg，20μg，40μg，60μg，80μg，100μg)。在某些实施方案中，所述第一核酸分子的含量为10μg。
在某些实施方案中，所述第二核酸分子的含量为5μg至500μg(例如，5μg，50μg，100μg，200μg，300μg，400μg，500μg)。在某些实施方案中，所述第二核酸分子的含量为50μg。
在另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含如前所述的疫苗组合物中的核酸分子或载体。
在某些实施方案中，所述宿主细胞包含第一核酸分子和第二核酸分子，或者，所述宿主细胞包含第一核酸分子和所述pSV10载体。
在另一方面，本申请提供了一种宿主细胞的组合，其中，第一宿主细胞包含如前所述的疫苗组合物中的第一核酸分子或载体；第二宿主细胞包含如前所述的疫苗组合物中的第二核酸分子或载体。
在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如前所述的疫苗组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)。
在另一方面，本申请提供了一种用于中和样品中冠状病毒的毒力的方法，其包括，将包含冠状病毒的样品与如前所述的疫苗组合物接触。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子或包含其的载体与所述第二核酸分子或或包含其的载体同时与样品接触，或者分别与样品接触。
在另一方面，本申请提供了一种用于预防和/或治疗受试者(例如人)的冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病的方法，其包括：给有此需要的受试者施用(例如，注射)有效量的如前所述的疫苗组合物或如前所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述第一核酸分子或包含其的载体与所述第二核酸分子或包含其的载体同时施用于受试者，或者分别施用于受试者。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述与冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19 和/或SARS。
在另一方面，本申请提供了一种诱导受试者(例如人)产生针对冠状病毒的免疫应答(例如，产生中和抗体)的方法，其包含：向所述受试者施用(例如，注射)有效量的如前所述的疫苗组合物或如前所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述注射为皮内注射或者肌肉注射。
在某些实施方案中，所述方法还包含，利用电穿孔量的电能对所述组织进行电穿孔的步骤。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述与冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19 和/或SARS。
在另一方面，本申请提供了如前所述的疫苗组合物用于预防和/或治疗冠状病毒感染的用途，或用于预防和/或治疗由冠状病毒感染所引起的疾病的用途，或用于在受试者中诱导或产生针对冠状病毒的免疫应答(例如，产生中和抗体)的用途。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述与冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19 和/或SARS。
在另一方面，本申请提供了一种制备如前所述的疫苗组合物的方法，其包括，通过有机合成反应或酶促合成反应分别合成第一核酸分子和第二核酸分子。任选地，将上述合成的第一核酸分子和/或第二核酸分别构建至载体中。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK 细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、 NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，SARS-CoV-2感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如SARS-CoV-2感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如SARS-CoV-2感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，术语“CpG基序”全称为非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤基序，其是指非甲基化的CpG二核苷酸。通常在细菌基因组中含有较多的非甲基化的CpG二核苷酸。脊椎动物的免疫***将CpG基序视为外源物质的识别分子，进而能够激发机体产生保护性免疫应答。本领域技术人员可以从现有数据库中获得CpG基序的序列。
通常来说，甲基化反应是指核酸分子中的氢被甲基(-CH3)取代的反应。术语“非甲基化的CpG基序”是指非发生所述甲基化反应的CpG 基序。
如本文中所使用的，术语“卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin， BCG)”也称为“卡介菌”，其是一种减毒的但又能使人体对其产生免疫力的活牛型结核分支杆菌(Mycobacterium bovis)，可作为儿童结核病的预防接种疫苗，接种后可使人体产生对结核病的特殊抵抗力。
如本文中所使用的，术语“BCG-CpG-DNA”是指从卡介苗(BCG)中提取的核酸(例如，双链DNA片段)，含有大量未甲基化的CpG基序。
如本文中所使用的，术语“免疫原”是指能够在宿主体内诱导免疫应答的蛋白或肽序列。
如本文中所使用的，术语“佐剂”又称免疫调节剂或者免疫增强剂，是指先于/后于抗原或与抗原混合同时注入哺乳动物体内，能非特异性的改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的一类物质。
本发明的DNA疫苗可以是可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。在某些实施方案中，所述的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂是通过本领域公知的无菌操作工艺制备的。在某些实施方案中，它们在贮藏、运输、使用过程中均呈无菌状态。
根据本发明，所述的药物组合物可以是本领域公知的任何可用于给药的药物形式，包括药物组合物、药物制剂、药盒等。虽然本发明所述用途中涉及的DNA疫苗可以经注射、粘膜等途径施用，并且这些施用方式也是本发明的一部分。但是，本领域技术人员清楚，适合于本发明所述用途的最优选施用途径是胃肠外途径或经注射方式施用。对于本发明的实施而言，所述的药物组合物优选是用于胃肠外给药的制剂，包括但不限于局部注射用制剂和全身注射用制剂，具体剂型包括但不限于注射用溶液剂和注射用粉针剂。在某些实施方案中，所述的药物是无菌的注射用含水溶液剂，或者是无菌的用于临床使用前用注射用水复溶配制的粉针剂，特别是冷冻干燥粉针剂。在制成冷冻干燥粉针剂时，其中还可以含有医药学上可接受的赋形剂，例如甘露醇。
本发明的DNA疫苗可以通过本领域公知的方法导入生物体内。所述的导入方法包括，但不限于，肌肉注射、基因枪导入法、③黏膜免疫、静脉注射法、腹腔注射法等，更详细的可以参考Alpar HO,et al. Expert Opin Drug Deliv,2005,2:829-842所公开的，该文献以其整体内容通过引用并入本文。
另外，根据下文中提供的研究结果，本领域技术人员可以容易地确定本申请的疫苗组合物在哺乳动物中使用时有效剂量，特别是用于人时的有效剂量。可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔施用。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期施用，例如一天施用一次、两天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、两年施用一次等。
如本文中所使用的，术语“ID50”是指50％抑制剂量，其通常用于评价中和抗体的效价。
发明的有益效果
与现有技术相比，本申请制备的疫苗组合物能够提早抗新冠抗体的产生，并且提高产生的中和抗体的滴度，还能够增强细胞的免疫反应。本发明的DNA疫苗组合物可用于预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
进一步的，本申请的BC01佐剂以及pSV10-SARS-CoV-2疫苗所组成的疫苗组合物优于：其余佐剂与pSV10-SARS-CoV-2疫苗组成的疫苗组合物；以及，BC01佐剂与其余疫苗组成的组合物。例如，本申请通过实验证实单独使用pSV10-SARS-CoV2疫苗仅能够产生针对D614G、 D614G+I472V和V483A毒株的中和抗体，无法产生针对L452R毒株的中和抗体。而使用带有BC01的pSV10-SARS-CoV2疫苗能够产生针对L452R、D614G、D614G+I472V和V483A毒株的中和抗体，并且，还诱导了更高滴度的中和抗体。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了SARS-Cov-2 DNA疫苗构建体的设计示意图和表达结果。其中，图1A显示了DNA疫苗的示意图，即pSV10-SARS-CoV-2 含有***的SARS-CoV-2 Spike蛋白。图1B显示了pSV10-SARS-CoV- 2和MOCK质粒转染293T细胞后，体外Spike蛋白的蛋白质印迹分析结果。
图2显示了接种了不同类型疫苗的小鼠的体液免疫反应。其中，图2A显示了不同组的中和抗体ID50的结果。图2B显示了在第4周和第6周，小鼠系列稀释血清中IgG与SARS-CoV-2S蛋白抗原结合结果。
图3显示了接种不同组试剂产生的中和抗体对不同变体的作用。其中，图3A显示了针对D614G变体的中和作用，图3B显示了针对 D614G+I472V变体的中和作用，图3C显示了针对V483A变体的中和作用，图3D显示了针对L452R变体的中和作用。
图4显示了BALB/c小鼠接种带有BC01的pSV10-SARS-CoV-2 疫苗后的T细胞表位图谱。
图5显示了在接种带有BC01的pSV10-SARS-CoV-2疫苗后小鼠的T细胞反应。其中，图5A显示了第4周产生的IFN- γELISPOT；图5B显示了第6周的IFN-γELISPOT，图5C显示了第4周的IL-2 ELISPOT，图5D显示了第6周的IL-2 ELISPOT。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0003243626520000141
Figure BDA0003243626520000151
Figure BDA0003243626520000161
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、 B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.DNA疫苗的制备与验证
DNA疫苗的制备
DNA疫苗是基于SARS-CoV-2 spike(S)蛋白Wuhan-1的序列(GenBank：MN_908947)设计的。合成了编码所述S蛋白全长的核苷酸序列。将合成的所述核苷酸序列克隆到哺乳动物表达质粒pSV10中(获自中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心)，获得所述DNA疫苗并将其命名为pSV10-SARS-CoV-2，并使用Sanger测序验证所述DNA疫苗的序列。提取合成的质粒，并溶于无菌水中备用。
BC01佐剂的制备
本实施例使用的BC01佐剂的制备方法参见中国专利申请 ZL201310586057.X，本实施例使用的BC01佐剂即为该专利中的BCG- CpG-DNA。简言之，将卡介苗菌种(中国卡介苗制备用卡介苗株 D2PB302，中国药品生物制品检定所菌苗室提供)进行菌体培养后裂解，通过离子交换纯化的方法对裂解液纯化，以除去其中的多糖、蛋白和RNA等杂质。最后通过离子交换柱从裂解液中分离出了卡介苗(BCG)CpG-DNA，将其溶于无菌水中，即获得了本申请的BC01佐剂。
Western Blot验证
将293T细胞接种至6孔板中，约70％密度时，使用 Lipofectamine 3000(Invitrogen)将pSV10-SARS-CoV-2质粒(4μg)转染所述细胞。转染48小时后收集细胞裂解物，将细胞裂解物在95℃下加热 5分钟，点样于预制的10％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)中并开始电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并将PVDF膜在4℃下，在含有0.2％Tween 20(Sigma)(V/V)和5％(W/V)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBST)中进行膜封闭。封闭过夜后，将PVDF膜在含有1:1000稀释的小鼠抗SARS-CoV-2 Spike S1单抗的5％(W/V)脱脂奶粉的PBST中孵育一小时。孵育后，PVDF膜用5％(W/V)脱脂奶粉的PBST洗涤5 次，随后与1:10,000山羊抗小鼠二抗在5％(W/V)脱脂奶粉的PBST中孵育。然后，PVDF膜再次用5％(W/V)脱脂奶粉的PBST洗涤5次，并通过Touch Imager XLI***(e-BLOT)检测。
pSV10***SARS-CoV-2 Spike蛋白后的载体图谱如图1A所示。 Spike蛋白的分子量为140-142kDa，分子量的轻微变化是由于S蛋白中22个潜在的N-连接聚糖。Spike蛋白的蛋白印迹分析如图1B所示，其证明spike蛋白转染疫苗载体后可以表达。
实施例2.小鼠体液免疫反应
动物样本的处理
39只4到6周大的雌性小鼠被分为四组，并分别注射如下试剂：第一组为带有BC01的pSV10-SARS-CoV-2(样本数量为10)，第二组为 pSV10-SARS-CoV-2(样本数量为10)，第三组为BC01(样本数量为10), 第四组为PBS(样本数量为9)。小鼠分别在第0周、第2周和第4周接受50ug DNA疫苗。在第0周、第2周和第4周用针头和注射器将以上四组试剂分别注射至各自实验组的小鼠体内，然后进行体内电穿孔。在免疫后第4周和第6周收集血清。
抗原结合ELISA
ELISA用于检测血清抗体结合滴度。在4℃下用置于1X磷酸盐缓冲液(DPBS)中的1μg/ml SARS-CoV-2 Spike蛋白包被ELISA板过夜。将ELISA板用洗涤缓冲液洗涤3次，并在室温下用置于DPBS (含0.05％Tween)中的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭两到三个小时。丢弃封闭溶液，ELISA板在室温下用连续稀释的热灭活小鼠血清温育一小时。并在室温下用1:4000稀释的抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)在黑暗中孵育一小时。然后用洗涤缓冲液将板洗涤5次。每孔加入100μL TMB溶液，5min后加入终止液终止反应。记录450nm和 630nm处的吸光度。
统计分析
使用GraphPad Prism 8.4.2(GraphPad Software)进行分析。使用单向方差分析和Holm-Sidak的多重比较检验进行组间数据的比较。P 值小于0.05认为差异是显著的。
实验结果
39只小鼠(4-6周龄)分成了4个试验组，第一组注射50μg的 pSV-10-SARS-CoV-2疫苗(接种数量为10)、第二组注射带有10μg BC01佐剂的50μg pSV-10-SARS-CoV-2疫苗(接种数量为10)、第三组注射10μg BC01佐剂(接种数量为10)，第四组注射60μg PBS(接种数量为9)。在注射后第四周，第一组接种的小鼠中观察到的中和抗体的ID50平均滴度为87，第二组接种的小鼠中检测到的中和抗体的 ID50平均滴度为141。在第三组和第四组的试验组中未检测到中和抗体。在注射后第6周，第一组的中和ID50的平均滴度为262，第二组的中和ID50的平均滴度为309，在第三组和第四组的对照组中均未检测到中和抗体(图2A)。在注射后第四周，第二组的阳性转化率为 80％，明显高于第一组的50％(即仅注射pSV-10-SARS-CoV-2疫苗的试验组)。这些结果表明BC01佐剂可以促进小鼠中和抗体的早期产生(表2)。
表2.pSV10-SARS-CoV-2对小鼠给予BC01后血清的中和活性
Figure BDA0003243626520000201
第4周时，第一组与第二组均检测到了一定滴度的结合抗体。在第三组和第四组中未检测到结合抗体。第6周时，第一组与第二组均检测到了一定滴度的结合抗体。在第三组和第四组中未检测到结合抗体(图2B)。
实施例3.假病毒中和实验
假病毒的生产和滴定
SARS-CoV-2假病毒的生产如文献(Establishment and validation of apseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.Emerg Microbes Infect,2020.9(1):p.680-686.)所述的。简言之，将SEQ ID NO:1-4的核苷酸序列分别***pSV10的多克隆位点中，将表达不同SARS-CoV-2 Spike蛋白的质粒***293T细胞，然后用浓度为7.0×104TCID 50/ml 的G*ΔG-VSV(VSV G假型病毒)感染这些细胞。
将细胞在37℃培养6-8小时，然后去除上清。将15ml新鲜细胞培养液加入烧瓶中培养24小时。最后，收集含有SARS-CoV-2假病毒的培养上清液，用滤膜过滤(0.45毫米孔径，Millipore， Cat#SLHP033RB)，并在-80℃储存，制备获得了假病毒D614G、 D614G+I472V、L452R和V483A。感染24小时后，对制备的SARS- CoV-2假病毒进行滴定，产生的相对发光单位(RLU)是阴性对照(仅细胞)的十倍以上。小鼠的分组以及接种方式与实施例2中描述的相同。
实验结果
评估了疫苗对当前流行的假病毒D614G、D614G+I472V、L452R 和V483A产生的抗体的中和水平。在每组中各取5只接种疫苗的小鼠的第6周血清用于中和试验。来自不同接种组的小鼠血清在56℃下热灭活30分钟，每次测定的小鼠血清从1:30稀释度开始连续稀释三倍。血清与50μL假病毒混合60分钟。60分钟后加入稳定表达ACE2的 Huh-7细胞，然后在37℃下孵育24小时。然后，使用britelite plus 发光报告基因分析***(Perkin Elmer目录号6066769)裂解细胞并测量RLU。使用Reed-Muench方法计算病毒中和滴度(ID50)。
注射了带有BC01的DNA疫苗的第二组可以中和D614G、D614G +I472V、L452R和V483A变异体，而仅注射DNA疫苗的第一组可以中和D614G、D614G+I472V和V483A变异体，但不能中和L452R 变异体。注射了第三组和第四组的小鼠则无法中和这些变体(图3)。
实施例4.细胞免疫反应
ELISPOT检测
收集小鼠脾脏并在含有1％青霉素/链霉素(R0)的RPMI1640培养基中研磨成单细胞悬液。将细胞沉淀重悬于5mL ACK裂解缓冲液中5 分钟，然后加入8mL PBS以停止反应。样品以1500g离心5分钟，将细胞在含有10％肽牛血清(FBS(R10))的RPMI1640培养基中重新悬浮。将小鼠IFN-γELISpotPLUS板和小鼠IL-2ELISpotPLUS板(MABTECH)由200μL R10/孔活化30分钟。每个孔中加入5x105个小鼠脾细胞，并用18聚体肽库(这些肽与来自SARS-CoV-2Spike蛋白的9 个氨基酸重叠)刺激所述细胞。此外，使用矩阵中的肽库进行定位(matrixmapping)，以识别免疫显性反应。在R10中用每孔5μg/ml 每种肽的终浓度刺激小鼠脾细胞。R10和细胞刺激物PAM+ION (Invitrogen)分别作为阴性对照和阳性对照。由ImmunoSpotCTL读数器对斑点计数。小鼠的分组以及接种方式与实施例2中描述的相同。
实验结果
使用IFN-γELISPOT来检测细胞免疫反应。对接受50μg pSV-10- SARS-CoV-2疫苗的BALB/c小鼠的脾细胞进行了表位定位。Spike蛋白被20个肽库覆盖。每个肽库包含7个肽段，每个肽段有18个氨基酸，相邻肽段重叠9个氨基酸。在多个肽库中检测到细胞免疫反应，但最强的反应是在肽库5中(图4)，该区域的位置为spike蛋白的第 234-297位氨基酸。在随后的细胞免疫实验中，肽库5被用作肽刺激剂。在疫苗注射后的第4周和第6周处死BALB/c小鼠，并收获脾细胞。用肽库5刺激单细胞悬浮液20小时。并用IFN-γELISPOT试剂盒检测。
疫苗诱导的细胞免疫反应
第4周的细胞免疫反应结果显示，第一组的平均IFN-γ为每5x 105个脾细胞154斑点形成单位(SFU)，而第二组的结果为每5x105个脾细胞179.1 SFU。在第6周，第一组的平均IFN-γ为每5x105个脾细胞253 SFU，而第二组的平均IFN-γ为每5x105个脾细胞389.9 SFU(图5A)。带有BC01的pSV-10-SARS-CoV-2疫苗增强了细胞免疫反应并增加了IFN-γ斑点的数量。
还检测到IL-2 ELISPOT的细胞免疫反应。在第一组中，IL-2斑点的平均数为每5x105个脾细胞29.3 SFU，在第二组中为每5x105个脾细胞37.7 SFU。在第6周，细胞免疫反应的结果显示，在第一组中，IL-2斑点的平均数为每5x105个脾细胞39.4 SFU，在第二组中，IL-2斑点的平均数为每5x105个脾细胞60.4SFU(图5B)。结果显示带有BC01的pSV-10-SARS-CoV-2疫苗增加了IL-2分泌细胞的数量。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> 一种含佐剂的新冠DNA疫苗
<130> IDC210273
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> D614G质粒的***片段
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
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1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (10)

1.一种疫苗组合物，其包含或由以下成分组成：作为佐剂成分的第一核酸分子，以及作为免疫原成分的第二核酸分子；所述第一核酸分子含有编码卡介苗(BCG)非甲基化的CpG基序的核苷酸序列，并且，所述第二核酸分子含有编码SARS-CoV-2Spike蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述卡介苗(BCG)非甲基化的CpG基序是通过将卡介苗的菌体裂解，并提取裂解液中的核酸而获得的。
2.权利要求1的疫苗组合物，所述疫苗组合物具有选自下列的一项或多项特征：
(1)所述第一核酸分子包含或不包含于载体(例如，pSV10载体)中；
(2)所述第二核酸分子包含或不包含于载体中；优选地，所述第二核酸分子包含于能够表达所述SARS-CoV-2S蛋白的载体中(例如，pSV10载体)；
(3)所述DNA疫苗为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂；
(4)所述第一核酸分子和第二核酸分子包含于同一载体中(例如，pSV10载体)，或者分别包含于不同的载体中。
3.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的含量比例为1：2至1：10(例如，1：2，1：3，1：4，1：5，1：6，1：7，1：8，1：9或1：10)；优选地，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的比例为1：5；
优选地，所述第一核酸分子的含量为1μg至100μg(例如，1μg，10μg，20μg，40μg，60μg，80μg，100μg)；更优选地，所述第一核酸分子的含量为10μg；
优选地，所述第二核酸分子的含量为5μg至500μg(例如，5μg，50μg，100μg，200μg，300μg，400μg，500μg)；更优选地，所述第二核酸分子的含量为50μg。
4.宿主细胞，其包含权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物中的核酸分子或载体；
优选地，所述宿主细胞包含第一核酸分子和第二核酸分子，或者，所述宿主细胞包含第一核酸分子和所述pSV10载体。
5.宿主细胞的组合，其中，第一宿主细胞包含权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物中的第一核酸分子或载体；第二宿主细胞包含权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物中的第二核酸分子或载体。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
任选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)。
7.权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物用于预防和/或治疗冠状病毒感染的用途，或用于预防和/或治疗由冠状病毒感染所引起的疾病的用途，或用于在受试者中诱导或产生针对冠状病毒的免疫应答(例如，产生中和抗体)的用途；
优选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2；
优选地，所述与冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19和/或SARS。
8.制备权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物的方法，其包括，通过有机合成反应或酶促合成反应分别合成第一核酸分子和第二核酸分子；任选地，将上述合成的第一核酸分子和/或第二核酸分别构建至载体中。
9.用于中和样品中冠状病毒的毒力的方法，其包括，将包含冠状病毒的样品与权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物接触；
优选地，所述第一核酸分子或包含其的载体与所述第二核酸分子或包含其的载体同时与样品接触，或者分别与样品接触；
优选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
10.用于诱导受试者(例如人)产生针对冠状病毒的免疫应答(例如，产生中和抗体)、或用于预防和/或治疗受试者(例如人)的冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病的方法，其包括：给有此需要的受试者施用(例如，注射)有效量的权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物或权利要求5所述的药物组合物；
优选地，所述第一核酸分子或包含其的载体与所述第二核酸分子或包含其的载体同时施用于受试者，或者分别施用于受试者；
优选地，所述注射为皮内注射或者肌肉注射；
优选地，所述方法还包含，利用电穿孔量的电能对所述组织进行电穿孔的步骤；
优选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2；
优选地，所述与冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19和/或SARS。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113957097A (zh) * 2021-09-27 2022-01-21 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN114507675A (zh) * 2022-01-29 2022-05-17 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法
CN115287271A (zh) * 2022-06-30 2022-11-04 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010034A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
CN103642794A (zh) * 2013-11-21 2014-03-19 中国食品药品检定研究院 一种大量制备BCG-CpG-DNA的方法
CN110711247A (zh) * 2019-10-28 2020-01-21 中国食品药品检定研究院 一种含有BCG-CpG-DNA佐剂的狂犬病疫苗组合物
CN111514289A (zh) * 2020-04-28 2020-08-11 天津大学 新冠病毒免疫纳米颗粒制剂的合成方法
CN111603556A (zh) * 2020-04-26 2020-09-01 中山大学 一种新型冠状病毒亚单位纳米疫苗的制备和应用
WO2021019102A2 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Acm Biolabs Pte Ltd A method of eliciting an immune response by administering a population of polymersomes having an associated antigen together with a population of polymersomes having an associated adjuvant as well as compositions comprising the two populations of polymersomes
US20210100892A1 (en) * 2018-09-11 2021-04-08 Jian Qing XU Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
EP3818989A1 (en) * 2020-03-12 2021-05-12 Universität Greifswald Peptides and oligonucleotides for a sars-cov-2 vaccine
GB202104898D0 (en) * 2020-03-01 2021-05-19 Valneva Austria Gmbh CpG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine
CN113151184A (zh) * 2020-06-15 2021-07-23 上海市公共卫生临床中心 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法
CA3101131A1 (en) * 2020-01-31 2021-07-31 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection - sars­cov-2 vaccines
WO2021163365A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sars-cov-2 vaccine
WO2021159985A1 (en) * 2020-02-13 2021-08-19 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. Vaccine agent for treating or preventing coronavirus disease

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010034A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
CN103642794A (zh) * 2013-11-21 2014-03-19 中国食品药品检定研究院 一种大量制备BCG-CpG-DNA的方法
US20210100892A1 (en) * 2018-09-11 2021-04-08 Jian Qing XU Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
WO2021019102A2 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Acm Biolabs Pte Ltd A method of eliciting an immune response by administering a population of polymersomes having an associated antigen together with a population of polymersomes having an associated adjuvant as well as compositions comprising the two populations of polymersomes
CN110711247A (zh) * 2019-10-28 2020-01-21 中国食品药品检定研究院 一种含有BCG-CpG-DNA佐剂的狂犬病疫苗组合物
CA3101131A1 (en) * 2020-01-31 2021-07-31 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection - sars­cov-2 vaccines
WO2021163365A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sars-cov-2 vaccine
WO2021159985A1 (en) * 2020-02-13 2021-08-19 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. Vaccine agent for treating or preventing coronavirus disease
GB202104898D0 (en) * 2020-03-01 2021-05-19 Valneva Austria Gmbh CpG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine
EP3818989A1 (en) * 2020-03-12 2021-05-12 Universität Greifswald Peptides and oligonucleotides for a sars-cov-2 vaccine
CN111603556A (zh) * 2020-04-26 2020-09-01 中山大学 一种新型冠状病毒亚单位纳米疫苗的制备和应用
CN111514289A (zh) * 2020-04-28 2020-08-11 天津大学 新冠病毒免疫纳米颗粒制剂的合成方法
CN113151184A (zh) * 2020-06-15 2021-07-23 上海市公共卫生临床中心 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZEHUA ZHOU等: "Unmethylated CpG motif-containing genomic DNA fragments of bacillus calmette-guerin improves immune response towards a DNA vaccine for COVID-19", VACCINE, vol. 39, no. 41, XP086788820, DOI: 10.1016/j.vaccine.2021.08.103 *
李彦伸;戴建君;庾庆华;: "黏膜免疫佐剂的研究进展", 中国畜牧兽医, no. 12 *
郭振宇;刘珏;刘霞;: "新型冠状病毒疫苗研究进展", 中国病毒病杂志, no. 04, 20 July 2020 (2020-07-20) *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113957097A (zh) * 2021-09-27 2022-01-21 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN113957097B (zh) * 2021-09-27 2023-11-28 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN114507675A (zh) * 2022-01-29 2022-05-17 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法
CN115287271A (zh) * 2022-06-30 2022-11-04 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
CN115287271B (zh) * 2022-06-30 2024-04-09 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法

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