CN115261287A - 一种复合乳酸杆菌菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合乳酸杆菌菌剂及其应用。所述复合乳酸杆菌菌剂是由植物乳杆菌冻干菌粉、嗜酸乳杆菌冻干菌粉、唾液乳杆菌冻干菌粉和罗伊氏乳杆菌冻干菌粉以1:1‑3:1‑3:1‑3的菌量比混合而成的。所述复合乳酸杆菌菌剂中的四种菌株安全可靠,在雏鸡阶段饮水添加饲喂雏鸡,能够快速占位定殖到雏鸡体内,提高雏鸡抗病能力、增强雏鸡免疫力,还能够调节肠道菌群平衡、改善血清免疫指标、促进肠绒毛发育、提高肉鸡生长性能。因此,所述复合乳酸杆菌菌剂可作为禽开口产品在雏鸡阶段安全使用,提高养殖效益,真正做到绿色无抗养殖。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种复合乳酸杆菌菌剂及其应用。
背景技术
禽类幼龄阶段(0-7日龄)是整个养殖成败的关键,所以禽开口产品的选择正确与否显得尤为重要。禽开口产品主要针对禽类出壳后在孵化场、运输过程和养殖场前7天三种情况下添加。目前市场上针对禽开口的产品主要分为两大类,一类为头孢、氧氟沙星为主的抗生素,有些产品中还会加入植物提取物,这类产品可以快速杀死雏鸡体内垂直传播的各种病原菌,某种程度上降低发病率、提高成活率,但抗生素在杀死病原菌的同时对雏鸡肠道造成损伤,且易导致抗生素残留及耐药菌的产生。另一类为多维+多种氨基酸+糖类的营养补充剂,可缓解免疫及运输应激,调节母源抗体低下,促进雏鸡对营养物质的吸收,增加日增重和发育的均匀度,但缺点是无法防止各种病原菌的危害。
禽类幼龄阶段也是肠道菌群发育的关键时期,此阶段摄入和接触到的益生菌将会影响禽类肠道菌群的建立。乳杆菌属的多个种类可在禽类生长早期定殖,并存在于禽类动物的嗉囊、消化道前端。这些乳酸杆菌可以快速在禽类体内定殖,从而使得禽类有更好的免疫力,为今后的健康成长打下良好的基础。
根据研究发现,复合益生菌的效果往往比单一菌效果要好。因此,研发一种可替代抗生素类和营养补充剂类的新型禽开口产品,能够有效的为禽类整个养殖周期保驾护航。
发明内容
本发明提供了一种复合乳酸杆菌菌剂及其应用。所述复合乳酸杆菌菌剂包含四种乳酸杆菌,植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌,其有利于动物早期菌群建立,提高动物抗病和免疫能力,进而提高家禽生产性能。
为实现上述发明目的,本发明通过下述技术方案予以实现:
本发明提供了一种复合乳酸杆菌菌剂,所述复合乳酸杆菌菌剂中包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。
进一步的,所述复合乳酸杆菌菌剂是由植物乳杆菌冻干菌粉、嗜酸乳杆菌冻干菌粉、唾液乳杆菌冻干菌粉和罗伊氏乳杆菌冻干菌粉以1:1-3:1-3:1-3的菌量比混合而成的。
进一步的,所述复合乳酸杆菌菌剂中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的菌量均为3000-6000亿CFU/g。
进一步的,所述植物乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.22078的植物乳杆菌GBW-LP001经发酵干燥制得的。
进一步的,所述嗜酸乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.10701的嗜酸乳杆菌L100经发酵干燥制得的;所述唾液乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.11386的唾液乳杆菌XJP2经发酵干燥制得的。
本发明还提供了所述的复合乳酸杆菌菌剂在作为禽类开口产品中的提高禽类免疫力的应用。
进一步的,所述复合乳酸杆菌菌剂的添加方式为饮水添加,其添加量为20亿/只/天-200亿/只/天。
进一步的,所述复合乳酸杆菌菌剂的使用时间为禽类幼龄阶段,使用时长为6天-10天。
进一步的,所述复合乳酸杆菌菌剂能够提高禽类的成活率、均重、料肉比和血清免疫指标,抑制有害菌的生长,并增加禽类肠道内总菌数量。
本发明还提供了所述的复合乳酸杆菌菌剂在制备雏禽生长促进剂中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下优点和技术效果:
1、本发明的复合乳酸杆菌菌剂中的四种乳酸杆菌均来自健康肉鸡肠道,抗生素敏感性试验证明四种菌株都是安全可靠的,符合直接饲喂菌株安全要求。生产方面,四种乳酸杆菌菌株生长较快,对培养基要求不高,可工业化大生产,其中植物乳杆菌GBW-LP001产酸量高达18.1g/L,四种乳酸杆菌发酵液抑菌效果好,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和魏氏梭菌等病原菌有较好的抑制效果。
2、本发明的复合乳酸杆菌菌剂中的唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的黏附能力、定殖能力强,可快速在动物肠道内占位定殖;复合乳酸杆菌中的嗜酸乳杆菌有助于提高幼龄动物免疫力,在肉鸡饲喂初期添加有利于整个养殖周期的成功;复合乳酸杆菌中的植物乳杆菌生长快,产酸能力强,抑制病原菌能力强,可在雏鸡阶段减少疾病。因此,复合乳酸杆菌菌剂有利于动物早期菌群建立,提高动物抗病和免疫能力,进而提高肉鸡生产性能。
3、本发明复合乳酸杆菌菌剂作为禽开口产品饮水饲喂雏鸡,动物养殖试验证明,复合乳酸杆菌菌剂可调节肉鸡肠道菌群平衡,促进肠绒毛发育,提高肉鸡抗病能力和免疫力,提高肉鸡生产性能。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌L100和罗伊氏乳杆菌在平板上的菌落形态。
图2为植物乳杆菌GBW-LP001菌株对部分抗生素的MIC结果。
图3为实施例5中案例一中部分肠道绒毛发育情况。
图4为实施例5中案例二中不同组别中的盲肠食糜。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中,如无特殊说明,所使用的试验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
下述实施例中所需培养基的配方如下:
1、MRS固体培养基:蛋白胨10.0g/L,牛肉浸粉5.0g/L,酵母浸粉4.0g/L,葡萄糖20.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸三铵2.0g/L,醋酸钠5.0g/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,琼脂15.0g/L,吐温80 1.0g/L,pH值为6.5±0.2(25℃)。
2、MRS液体培养基:蛋白胨10.0g/L,牛肉浸粉5.0g/L,酵母浸粉4.0g/L,葡萄糖20.0g/L,磷酸氢二钾2.0g/L,柠檬酸三铵2.0g/L,醋酸钠5.0g/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,吐温80 1.0g/L,pH值为6.5±0.2(25℃),L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
上述培养基在使用前,需在116℃下灭菌30min,然后室温保存。
实施例1:四种乳酸杆菌菌株的药敏性评价
在本发明中,嗜酸乳杆菌L100来源于健康肉鸡肠道,耐酸性强,生长较慢,在MRS培养基平板上37℃厌氧培养48h,形成较小、网状、表面粗糙、边缘不规则的菌落(图1左)。罗伊氏乳杆菌菌株,生长较快,在MRS培养基平板上37℃培养48h,形成较大、表面光滑、边缘规则的菌落(图1右)。
唾液乳杆菌XJP2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;保藏日期:2015年9月16日;唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius的保藏编号为CGMCC No.11386。
嗜酸乳杆菌L100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;保藏日期:2015年4月9日;嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus的保藏编号为CGMCC No.10701。
植物乳杆菌GBW-LP001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;保藏日期:2021年03月26日;植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的保藏编号为CGMCC No.22078。
罗伊氏乳杆菌为市售产品。
将四种乳酸杆菌(植物乳杆菌GBW-LP001、嗜酸乳杆菌L100、唾液乳杆菌XJP2和罗伊氏乳杆菌)接种到MRS液体培养基中,37℃培养过夜,然后将菌液稀释到0.5个麦氏单位。用无菌棉拭子蘸取稀释好的菌液,在液面上方试管内壁处挤压拭子去除多余的菌液,然后在准备好的MRS固体平板表面反复均匀涂抹3次,每涂一次旋转平板60°,最后沿平板内源涂一圈,保证涂布均匀。所用抗生素药敏条购自安图生物。
试验评价了四种乳酸杆菌对六种抗生素的敏感性。结果如表1和图2所示,发现四种乳酸杆菌菌株对氨苄西林、克林霉素和红霉素非常敏感,最小抑菌浓度(MIC)值均较低,远低于临界值,对庆大霉素的MIC值比其它偏高,嗜酸乳杆菌L100达到16,刚好在临界值上(表1和表2)。经过药敏性评价说明,四种乳酸杆菌菌株均是安全的,可在动物中放心使用。
表1:四种乳酸杆菌菌株对六种抗生素的MIC结果(μg/mL)
表2:不同乳酸杆菌对不同药物的临界值(μg/mL)
实施例2:四种乳酸杆菌菌株生长、产酸评价
将四种乳酸杆菌(植物乳杆菌GBW-LP001、嗜酸乳杆菌L100、唾液乳杆菌XJP2和罗伊氏乳杆菌)的单菌落接种到MRS液体培养基中,37℃培养过夜,然后测菌液OD600,将菌液OD600调到一致水平,然后再按1%的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中,37℃培养箱静置培养24h,再测OD600、pH和产乳酸量。其中OD600值用分光光度计测,pH值用pH计检测,产乳酸量用南京建成的乳酸(LD)测试盒检测。
试验结果如表3所示,37℃培养生长24h后,四种菌株的pH值都降到4.35以下,菌液OD600均在4.60以上,说明四种菌株都生长良好,易于培养。其中,植物乳杆菌GBW-LP001和唾液乳杆菌XJP2两株菌生长较快,因为二者为同型发酵乳酸菌;而嗜酸乳杆菌L100和罗伊氏乳杆菌两株菌生长略慢,罗伊氏乳杆菌为专性异型发酵乳酸菌,产乳酸量偏低,嗜酸乳杆菌虽然为同型发酵,但其菌株生长较慢,产乳酸量低于植物乳杆菌和唾液乳杆菌。
表3:四种乳酸杆菌菌株生长、产酸情况
实施例3:四种乳酸杆菌的抑菌性评价
(1)有益菌菌液培养:将植物乳杆菌GBW-LP001、嗜酸乳杆菌L100、唾液乳杆菌XJP2和罗伊氏乳杆菌的单菌落分别接种到MRS液体培养基中,37℃培养过夜,取菌液备用。
(2)有害菌培养:四种有害菌为大肠杆菌25922、大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌25923和魏氏梭菌ATCC13124。提前准备LB和RCM液体培养基,大肠杆菌25922、大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌25923甘油管接种到LB液体培养基中37℃,180rpm震荡培养20h左右。魏氏梭菌ATCC13124提前在RCM培养基上划出单菌落,然后接种单菌落至RCM液体培养基中,37℃静置厌氧培养20h左右。
(3)抑菌试验:用分光光度计检测有害菌OD600,稀释控制OD600值在0.3-0.4,然后按1%添加量加入到灭好菌的50℃左右的相对应的固体培养基中,混匀,倒平皿,待完全凝固后,用打孔器打孔。孔中加入50μL不同益生菌菌液,然后置37℃培养24h,观察抑菌圈大小,测定抑菌圈直径统计结果。(注:大肠杆菌用LB培养基,魏氏梭菌用RCM培养基,魏氏梭菌为严格厌氧菌,需要厌氧培养。打孔器直径为8mm。)
试验结果如表3所示:四株乳酸杆菌对四种有害菌均有抑菌性,其中植物乳杆菌抑菌效果最佳,对金黄色葡萄球菌25923抑菌直径高达19.0mm,对魏氏梭菌ATCC13124抑菌直径为15.0mm,对大肠杆菌25922和K88的抑菌直径分别为14.5mm和13.5mm。从外,在抑制大肠杆菌方面,罗伊氏乳杆菌效果也比较突出,可能和其产生的罗伊氏菌素有关。
表3:四株乳酸杆菌的抑菌性结果(抑菌直径,单位mm)
实施例4:四种乳酸杆菌菌株发酵及复合菌剂的制备
实验室摇瓶发酵四株乳酸杆菌(植物乳杆菌GBW-LP001、嗜酸乳杆菌L100、唾液乳杆菌XJP2和罗伊氏乳杆菌),发酵菌量在20-30亿CFU/mL。
再进行50L小罐发酵,发酵条件:接种量2%,培养温度37℃,转速150rpm,不通风,罐压0.5Mpa,过程中氨水控pH6.50,培养周期12-16h;四种乳酸杆菌发酵菌量均在140亿CFU/mL以上,其中植物乳杆菌GBW-LP001为200亿CFU/mL,嗜酸乳杆菌L100为140亿CFU/mL,唾液乳杆菌XJP2为179亿CFU/mL,罗伊氏乳杆菌为160亿CFU/mL。
小罐发酵基配方为:葡萄糖30-38g/L,蔗糖12-18g/L,蛋白胨14-20g/L,酵母膏10-18g/L,牛肉膏13-18g/L,醋酸钠5-10g/L,磷酸氢二钾0.5-1.0g/L,磷酸二氢钾0.5-1.0g/L,柠檬酸三铵1.2-1.8g/L,硫酸镁0.5-1.0g/L,硫酸锰0.1-0.5g/L,吐温80 1-5g/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.8g/L。
经50L小罐发酵后,将四株乳酸杆菌发酵液经冷冻干燥得到各3000-6000亿CFU/g的冻干菌粉。
将四种乳酸杆菌菌粉按相同菌量混合后,得到复合乳酸杆菌菌剂产品。
实施例5:复合乳酸杆菌在肉鸡上的应用评价
案例一、开口期使用复合乳酸杆菌对肉鸡生长的影响
试验地点:青岛根源生物平度基地动物房
试验材料:复合乳酸杆菌产品1(四种菌等菌量混合),复合乳酸杆菌产品2(植物乳杆菌GBW-LP001和唾液乳杆菌XJP2等菌量混合),复合乳酸杆菌产品3(嗜酸乳杆菌L100和罗伊氏乳杆菌等菌量混合)
试验设计:
表4:案例一试验设计
选择1日龄优质白羽肉鸡500羽,筛除体重差异明显的鸡,将剩余450羽左右的鸡,分为18个栏位(每个栏位25只鸡),要求每个栏位鸡的平均体重近似。
试验分为5个处理组,对照组和试验组1、试验组2各4个栏位,试验组3和试验组4各3个栏位(注:对照组和试验组栏位交叉配置)。
试验周期42天,1-7天,试验组饲喂复合乳酸杆菌,8-42d不饲喂。采食颗粒料自由饮水,采用人工光照,免疫新城疫和传染性支气管炎疫苗。全程不使用抗生素作为生长促进剂。试验过程中每周记录生长性能指标,42日龄时每组随机抽取8只鸡,取盲肠食糜和空肠中段。
指标测定:(1)微生物多样性指标:盲肠食糜提取粪便总DNA,采用荧光定量试剂盒用荧光定量PCR仪检测总菌数、乳酸杆菌数和大肠杆菌数;
(2)VFA指标:用气相色谱仪检测肠道食糜的VFA含量;
(3)空肠切片:取空肠中段,浸泡到多聚甲醛溶液中,交由北京中科万邦生物科技有限公司做石蜡包埋、HE染色和扫描。
所得空肠切片的图片如图3所示,试验结果如表5-表9所示,各种指标结果如下:
生产性能方面:试验组各组在成活率、均重和料肉比方面比对照组有优势,在7日龄即有体现但没有显著性差异,到42日龄,试验组2的成活率、均重和料肉比对照组和其他试验组具有明显优势,且在均重和料肉比上呈显著性差异;
微生物多样性方面:试验组各组和对照组相比可降低大肠杆菌数目,增加总菌数和乳酸杆菌数量,且试验组1在降低大肠杆菌方面最突出;
VFA方面:试验组各组在乙酸、丁酸、总VFA上均高于对照组,试验组2在乙酸和支链VFA/总VFA上表现最佳,而试验组1在丁酸含量上最高,推测可能和试验组1降低大肠杆菌数目上有关;
绒毛发育方面:试验组各组在绒毛长度、隐窝深度和绒隐比上均好于对照组,且试验组2更佳。
上述试验结果说明:
(1)在肉鸡生长早期添加复合乳酸杆菌对整个生长周期至关重要;
(2)复合乳酸杆菌产品1按添加量100亿/只/天效果好于200亿/只/天;
(3)复合乳酸杆菌产品1(四种乳酸杆菌复合物)效果好于复合乳酸杆菌产品2和复合乳酸杆菌产品3;
(4)复合乳酸杆菌种类越多越好,但是添加量并非越多越好;
(5)高添加量复合乳酸杆菌对肉鸡生长无伤害。
表5:7日龄生产性能统计
表6:42日龄生产性能统计
表7:微生物多样性分析(Lg值)
表8:盲肠食糜VFA分析
表9:肠道绒毛高度和隐窝深度分析
案例二、复合乳酸杆菌对肉鸡免疫力的影响
试验地点:青岛根源生物平度基地动物房
试验材料:复合乳酸杆菌产品(四种菌等菌量混合)
试验设计:
表10:案例二试验设计
选择1日龄优质白羽肉鸡500羽,筛除体重差异明显的鸡,将剩余450羽左右的鸡,分为18个栏位(每个栏位25只鸡),要求每个栏位鸡的平均体重近似。
试验分为3个处理组,每个处理组6个栏位(注:对照组和试验组栏位交叉配置)。
试验周期14d,1-3日龄每天连续添加,6-8日龄每天连续添加,其余时间不添加,采食颗粒料自由饮水,采用人工光照,1日龄免疫支必妥(传染性支气管炎活疫苗),7日龄免疫新支妥(新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗)。全程不使用抗生素作为生长促进剂。
取样及指标测定:14日龄每组随机抽取8只鸡,取盲肠食糜和血液。指标测定如下:
(1)生产性能统计:每周统计成活率、均重和料肉比;
(2)微生物多样性指标:盲肠食糜提取粪便总DNA,荧光定量检测总菌数、乳酸杆菌数和大肠杆菌数;
(3)血清指标:用免疫球蛋白(IgG)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)ELISA试剂盒检测IgG和GSH-Px。
在14日龄杀鸡取样的过程中,发现对照组食糜量明显比试验组少很多,且食糜颜色比试验组偏浅,如图4所示,这与饲喂复合乳酸杆菌后提高动物采食量有关。
试验结果如表11-表14所示,具体如下:
生产性能:试验组在成活率、均重和料肉比方面均比对照组要好,且试验组2最佳,14日龄优势比7日龄明显;
微生物多样性:两个试验组和对照组相比在总菌、乳酸杆菌数和大肠杆菌数上略有优势,只有试验组1在大肠杆菌数目上和对照组差异显著;
血清免疫指标:两个试验组的IgG和GSH-Px指标均高于对照,且试验组2和对照组差异极显著。
试验结论:在雏鸡阶段和应激条件下,饲喂复合乳酸杆菌有助于提高肉鸡免疫力,提高肉鸡生产性能,但添加量并非越多越好。
表11:7日龄生产性能统计
表12:14日龄生产性能统计
表13:微生物多样性分析(Lg值)
表14:血清免疫指标分析
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种复合乳酸杆菌菌剂,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂中包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的复合乳酸杆菌菌剂,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂是由植物乳杆菌冻干菌粉、嗜酸乳杆菌冻干菌粉、唾液乳杆菌冻干菌粉和罗伊氏乳杆菌冻干菌粉以1:1-3:1-3:1-3的菌量比混合而成的。
3.根据权利要求1所述的复合乳酸杆菌菌剂,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的菌量均为3000-6000亿CFU/g。
4.根据权利要求2所述的复合乳酸杆菌菌剂,其特征在于,所述植物乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.22078的植物乳杆菌GBW-LP001经发酵干燥制得的。
5.根据权利要求2所述的复合乳酸杆菌菌剂,其特征在于,所述嗜酸乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.10701的嗜酸乳杆菌L100经发酵干燥制得的;所述唾液乳杆菌冻干菌粉是由保藏编号为CGMCC No.11386的唾液乳杆菌XJP2经发酵干燥制得的。
6.权利要求1-5任一项所述的复合乳酸杆菌菌剂在作为禽类开口产品中的提高禽类免疫力的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂的添加方式为饮水添加,其添加量为20亿/只/天-200亿/只/天。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂的使用时间为禽类幼龄阶段,使用时长为6天-10天。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述复合乳酸杆菌菌剂能够提高禽类的成活率、均重、料肉比和血清免疫指标,抑制有害菌的生长,并增加禽类肠道内总菌数量。
10.权利要求1-5任一项所述的复合乳酸杆菌菌剂在制备雏禽生长促进剂中的应用。
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