CN115261242A - 一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用 - Google Patents

一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用。海洋红酵母为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginsoa)RMXS‑1805，保藏编号为：CGMCCNO.25049。发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂由海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌组成。本发明通过筛选保存了一株海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术方式，在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充一定的碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节适宜的料水比和温度，实现了将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成可再循环利用的饲料资源。

Description

一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用。
背景技术
当前我国工厂化循环水产养殖正迅猛发展，其经济效益相对于传统的室外土池养殖有着显著的增加，但是这种高密度的养殖方式势必带来更高负荷的固体废弃物排放。这些固体废弃物主要是养殖过程中水产动物***的粪便和未被摄食的多余残饵。这些残饵粪便具有较高的营养成分，其粗蛋白和粗脂肪分别高达26％和14％以上。这些有机物如果较长时间浸泡在养殖水体中，其营养物质将溶失于养殖水体，在水体中形成悬浮的微小颗粒，不仅会导致养殖水体氮磷超标，致使水质恶化，而且这些飘浮在水体中细小的悬浮颗粒还对鱼类的呼吸器官—鳃有很大影响，降低苗种的成活率与生长率，严重者导致鱼类死亡。并且养殖水体中的残饵粪便如果得不到及时的清理，会腐败变质，产生有毒物质，同时水体中的氨氮、亚硝氮等对水产动物具有毒害作用的物质会迅速上升，达到一定浓度时，直接导致水产动物的死亡。水产动物在水质污染严重的水体中生长，必然导致自身发育受到严重影响，免疫力下降，生长速度变慢，更容易感染各种疾病，致使水产品不仅在质上不达标，在产量上也严重下降，最终使得经济效益受到严重损失。基于此背景，工厂化水产养殖的固体废弃物问题亟待解决。
然而目前在畜禽上以微生物发酵的方式发酵粪便的技术已经很成熟，但是迄今为止，该技术在水产养殖固体废弃物上没有应用案例，在海水养殖上更是没有。而海水养殖上的固体废弃物含盐量较高，很多能在畜禽上发酵粪便的微生物，但是用在在海水养殖固体废弃物的发酵过程中时生长受到抑制，其发酵效果较差，因此需要寻找一些耐盐菌对海水养殖固体废弃物进行发酵处理。
海洋红酵母是一种广泛存在于海洋环境的真菌，具有较强的抗逆性，还能合成大量类胡萝卜素，含有较高蛋白含量、维生素、微量元素和一定量的不饱和脂肪酸，并且在生长过程中产生一些生长因子和消化酶类，这些物质可以促进水产养殖动物对饲料的消化吸收，从而提高饲料的利用率。
已有的近似技术方案：专利号CN109170193A鸡粪72-75份、玉米粉15-20份、谷糠12-14份、麦麸6-8份、酒糟5-12份、水适量。步骤如下：
第一步，将麦麸加温水浸泡30-36个小时，浸泡过后的麦麸表层产生很多气泡，有香味即可；
第二步，鸡粪倒入水泥发酵池，加入25-40％热水后用塑料薄膜密封2～5天，薄膜内层布满水珠，鸡粪发酵结束，打开塑料薄膜的同时加入玉米粉和谷糠搅拌均匀，再将浸泡的麦麸倒入发酵池里搅匀密封24-30小时，有麦麸香味完成二次发酵，其形成为发酵混合物。
第三步，将发酵混合物和酒糟混合搅拌的同时喷洒热水，使其含水量不能高于60份，也不能低于55份，鸡粪发酵猪饲料制备完成。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中没有添加发酵菌剂，而是让其自然发酵，发酵速度比较慢，发酵工艺也较为繁琐。
解决以上问题及缺陷的难度为：难以找到发酵效果好的菌种以及合适的发酵工艺条件。
解决以上问题及缺陷的意义为：可快捷方便的对残饵粪便进行发酵，可操作性强，可广泛推广应用。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种海洋红酵母、发酵制剂、制备方法、发酵饲料及应用。具体涉及一种水产动物残饵粪便微生物发酵饲料的制备方法。
所述技术方案如下：一种海洋红酵母，所述海洋红酵母为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginsoa)RMXS-1805，保藏日期为2022年06月10日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25049。
本发明的另一目的在于提供一种所述的海洋红酵母作为耐盐菌在水产养殖固体废弃物发酵处理上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种海洋红酵母，所述海洋红酵母发酵制剂培养的培养方法包括：
通过平板划线，将海洋红酵母分别接种到YPD液体培养基中并进行培养；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基A中，培养得到海洋红酵母的发酵制剂。所述培养基A按质量计由葡萄糖30g～35g、牛肉膏1g～4g、氯化铵1g～5g、酵母膏10g～15g和陈海水1000g～1500g组成，pH值为7～7.5。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述海洋红酵母复合的发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂由海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌组成，按菌落数量添加量比海洋红酵母(1～6×109cfu/g)：粪肠球菌(1～6×109cfu/g)：植物乳杆菌(1～6×109cfu/g)。
本发明的另一目的在于提供一种所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂在水产养殖固体废弃物发酵以及海水养殖环境调控中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法包括：
步骤一，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养；
步骤二，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各个组分混合比例的优化。
在一个实施例中，在步骤一发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养中包括海洋红酵母发酵制剂培养，植物乳杆菌和粪肠球菌发酵制剂培养；
所述植物乳杆菌和粪肠球菌发酵制剂培养包括：通过平板划线，将植物乳杆菌和粪肠球菌分别接种到LB液体培养基中进行培养；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基B中，培养得到植物乳杆菌和粪肠球菌的发酵制剂；
所述培养基B按质量计由蛋白胨10g～15g、葡萄糖20g～25g、酵母膏5g～10g、牛肉膏10g～15g、硫酸镁0.1g～0.5g、磷酸氢二钾2g～5g、硫酸锰0.05g～0.1g、吐温-801ml～3ml、乙酸钠5g～8g、柠檬酸铵2g～5g和1000g～1500g蒸馏水组成，pH为7～7.5；
所述步骤二中，海洋红酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌的菌液分别按照菌落数量进行以下优化：
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(6×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(6×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(6×109cfu/g)。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述海洋红酵母制备的海水养殖发酵饲料，海水养殖发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
利用筛选保存的海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节料水比和温度，将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成能再循环利用的海水养殖发酵饲料；所述碳氮比(12～14)：1，发酵温度29℃，料水比中含水量55～65％，海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌按菌落数量比为海海洋红酵母(1～6×109cfu/g)：粪肠球菌(1～6×109cfu/g)：植物乳杆菌(1～6×109cfu/g)，发酵时间96h，优选的海洋红酵母：粪肠球菌：植物乳杆菌＝(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述海水养殖发酵饲料在制备对虾养殖饲料或卤虫养殖饲料中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明采用海洋红酵母与乳酸菌结合的发酵方式进行发酵水产养殖过程中的残饵粪便，使得营养价值增高。
本发明海洋红酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌的复合发酵的菌落数量比例为(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)。
本发明海洋红酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌的发酵残饵粪便的发酵工艺条件为：所述碳氮比(12～14)：1，发酵温度29℃，料水比中含水量55～65％，优选碳氮比为12：1，发酵水分55％，发酵时间为96h。
本发明发酵产物的营养价值(粗蛋白、粗脂肪以及氨基酸)得到提高，养殖卤虫的效果远远好于不发酵的处理组。
具体地，本发明海洋红酵母菌体内含有丰富的蛋白质、维生素、消化酶、糖类、氨基酸、不饱和脂肪酸以及免疫增强等营养因子。本发明采用了海洋红酵母与植物乳杆菌和粪肠球菌结合作为复合发酵菌剂，相较于传统的只采用乳酸菌作为发酵菌剂而言，该复合发酵菌剂具有使得发酵产物的营养价值提高的优点；并且该发酵工艺简单，操作方便。
该发酵饲料粉碎后用于卤虫养殖，与直接投喂未发酵的残饵粪便饲养卤虫相比，投喂该微生物发酵饲料养殖的卤虫成活率、体长和体重都高于投喂未发酵的残饵粪便处理组，而且养殖水质也好于投喂残饵粪便的处理组。
本发明进行了发酵效果评估，对发酵后的产物进行了测定，粗蛋白、粗脂肪与发酵前相比都有增加，粗灰分与粗纤维都有降低，总氨基酸含量相比发酵前有提高。
表1鱼粪发酵前后pH及气味儿变化
Figure BDA0003816377240000051
表2常规营养物质变化
Figure BDA0003816377240000052
表3发酵鱼粪氨基酸的变化(％)
Figure BDA0003816377240000053
Figure BDA0003816377240000061
第二，把技术方案看作一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明的植物乳杆菌和粪肠球菌为商业菌种，购自于青岛根源生物技术集团有限公司。
本发明通过筛选保存了一株海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术方式，在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充一定的碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节适宜的料水比和温度，实现了将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成可再循环利用的饲料资源。
本发明该发酵产物投喂于水产养殖时，相比于直接投喂没有发酵的残饵粪便，水质会更好。
本发明的目的是为了采用微生物发酵技术的生物技术方式，将水产养殖过程中产生的残饵粪便变成可以加以利用的饲料资源循环利用，实现变废为宝。
第三、作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：在凡纳对虾养殖上，100斤正常商业饲料产75-85斤虾，成本约为800块人民币，而100斤粪便微生物发酵饲料与商业饲料1：1混合产50-60斤虾，而成本约为400块人民币左右，因此具有很大的商业价值。并且该粪便微生物发酵饲料在卤虫商业养殖上具有重要的意义，与传统投喂鸡粪饲喂卤虫相比，饲喂粪便微生物发酵饲料的卤虫长得更快。100斤粪便微生物饲料能产60-70斤卤虫，对水质污染较小；而100斤粪便能产40-50斤，但对水质污染较严重。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明技术填补了国内外水产养殖业上固体废弃物资源化利用的空白，具有重大的意义。
(3)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：本发明技术方案解决了在水产养殖上，人们一直想将水产养殖过程中的残饵粪便资源化利用的技术难题。
(4)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：本发明技术方案克服了过去只能在畜禽粪便上进行微生物发酵的技术偏见。
当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明实施例提供的菌株RMXS-180518S rDNA序列构建的***发育树示意图。
图2是本发明实施例提供的取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于葡萄糖浓度为10、20、40、60和80g/L的YPD液体培养基中，在25℃，160rpm的摇床中培养48h，然后测定其生物量示意图。
图3是本发明实施例提供的取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，在转速为160、180、200、220rpm条件下培养48h，然后测定其生物量示意图。
图4是本发明实施例提供的取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的YPD液体培养基中培养48h，然后测定其生物量示意图。
图5是本发明实施例提供的取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，分别放置在18、22、26、30℃的摇床中培养48h，然后测定其生物量示意图。
图6是本发明实施例提供的取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，分别培养48、72、96、120、144h，然后测定其生物量示意图。
图7是本发明实施例提供的海水养殖固体废弃物资源化利用制剂的制备方法流程图。
图8是本发明实施例提供的复合菌制剂配方比例优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度示意图。
图9是本发明实施例提供的发酵后的产品效果图。
图10是本发明实施例提供的碳氮比优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度示意图。
图11是本发明实施例提供的发酵温度优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度示意图。
图12是本发明实施例提供的发酵水分含量优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度示意图。
图13是本发明实施例提供的发酵时间优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度示意图。
图14是本发明实施例提供的养殖期间氨氮变化情况示意图。
图15是本发明实施例提供的养殖期间亚硝氮变化情况图。
图16是本发明实施例提供的养殖期间硝氮变化情况图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供一种海洋红酵母，所述海洋红酵母保藏编号为：CGMCCNO.25049；请求保***为：田相利，中国海洋大学，山东省青岛市市南区鱼山路5号中国海洋大学水产学院；保藏日期为：2022年06月10日；保藏地址为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；该生物材料为：RMXS-1805；分类命名为：胶红酵母Rhodotorula mucilaginsoa，于2022年06月10日检测，结果为存活。
本发明实施例还提供一种利用所述海洋红酵母复合的发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂由海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌组成，按菌落数量比为海洋红酵母：粪肠球菌：植物乳杆菌＝海洋红酵母(1～6×109cfu/g)：粪肠球菌(1～6×109cfu/g)：植物乳杆菌(1～6×109cfu/g)。其中，粪肠球菌和植物乳杆菌为商业菌株，从青岛根源生物技术集团有限公司获取。
本发明实施例还提供一种发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法包括：发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养；
发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各个组分混合比例的优化。
本发明实施例还提供一种利用所述海洋红酵母制备的海水养殖发酵饲料，海水养殖发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
利用筛选保存的海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节料水比和温度，将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成能再循环利用的海水养殖发酵饲料；所述碳氮比(12～14)：1，发酵温度29℃，料水比中含水量55～65％海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌按菌落总数比为海洋红酵母：粪肠球菌：植物乳杆菌＝海洋红酵母(1～6×109cfu/g)：粪肠球菌(1～6×109cfu/g)：植物乳杆菌(1～6×109cfu/g)，发酵时间96h。
在本发明实施例中，所述碳氮比12：1，发酵温度29℃，料水比中含水量55％；
或采用碳氮比14：1，发酵温度29℃，料水比中含水量65％；
或采用碳氮比13：1，发酵温度29℃，料水比中含水量60％。
下面结合不同实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1一株海洋红酵母菌种的筛选和分离
海洋红酵母的分离纯化：从红鳍东方鲀养殖池塘采集的底泥样品中取一部分底泥加入到无菌的YPD液体培养基中，于25℃培养3天，然后用移液枪准确吸取1ml的上述菌培养液于灭菌的离心管中，用无菌生理盐水进行梯度稀释，制备10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的稀释溶液。用移液枪吸取体积0.2ml的稀释液均匀涂布于YPD固体培养基上，然后置于28℃培养箱遮光培养72h，待平板上长出单个菌落后，再用接种环挑取平板上疑似(橙色或红色的)单菌落于YPD固体培养上划线，进一步获得高纯度的单菌落，进行分离纯化培养后，将得到的单菌落保存于4℃保存备用。
实施例2一株海洋红酵母菌的分类鉴定
1.海洋红酵母的形态鉴定：菌体为单细胞，细胞呈卵圆或球形，无鞭毛，细胞直径约3～8μm，无假菌丝，出芽生殖；该菌株的菌落呈红色或橙红色，菌落直径3～5mm，表面光滑，中间***，不透明，易挑起，边缘整齐。
2.海洋红酵母的生理生化特征：海洋红酵母的生理生化特征如表4所示：
表4海洋红酵母菌株RMXS-1805的生理生化特性
Figure BDA0003816377240000101
3.分子遗传学特征
提取海洋红酵母RMXS-1805的DNA，采用PCR扩增采用通用引物(来自上海生工生物技术有限公司)ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物ITS4：5’T-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’对其进行扩增。PCR反应体系：模板DNA2μL，引物ITS11μL，引物ITS41μL，Taq酶25μL，ddH2O21μL；PCR反应过程：预变性(95℃5min)，变性(95℃45s)，复性(56℃45s)，延伸(72℃30s)，30个循环；最后温育72℃10min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，检验合格后至青岛华大基因生物科技有限公司测序，并将最后得到的测序结果输入网址：www.NCBI.nlm.gow，点击BLAST分析软件，把测得的基因序列与GenBank数据库的序列进行同源性比对；最后采用MEGA7中的Neighbor-Joining法进行***发育树的构建，结果显示其与胶红酵母序列高度相似(如图1菌株RMXS-180518S rDNA序列构建的***发育树所示)，最终确定其属于胶红酵母菌属(Rhodotorula mucilaginosa)。
实施例3海洋红酵母RMXS-1805生长条件的测定
1.取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于葡萄糖浓度为10、20g、40、60和80g/L的YPD液体培养基中，在25℃，160rpm的摇床中培养48h，然后测定其生物量。如图2所示，葡萄糖浓度为40g/L时生物量最高，因此选择40g/L作为最佳浓度。
2.取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，在转速为160、180、200、220rpm条件下培养48h，然后测定其生物量。如图3所示，转速为200rpm时，生物量最高，因此选择200rpm为最佳转速。
3.取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的YPD液体培养基中培养48h，然后测定其生物量。如图4所示，pH为4.5时，生物量最高，因此选择pH为4.5作为最佳培养pH。
4.取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，分别放置在18、22、26、30℃的摇床中培养48h，然后测定其生物量。如图5所示，当温度为26℃时，生物量最高，因此选择26℃为最佳培养温度。
5.取海洋红酵母RMXS-1805菌液，接种于YPD液体培养基中，分别培养48、72、96、120、144h，然后测定其生物量。如图6所示，培养时间为48h时，生物量最大，因此选择48h作为最佳培养时间。
综上实验表明，海洋红酵母RMXS-1805，在葡萄糖浓度为40g/L，转速200rpm，pH4.5，温度26℃，时间为48h时生长最好。
实施例4
如图7所示，本发明实施例提供的海水养殖固体废弃物资源化利用制剂的制备方法包括：
S101，发酵水产养殖固体废弃物复合菌制剂配方优化。
菌株：海洋红酵母(RMXS-1805)、植物乳杆菌(ZW)、粪肠球菌(FC)。
(1)海洋红酵母(RMXS-1805)发酵制剂培养：通过平板划线，将海洋红酵母分别接种到YPD液体培养基中，26℃，200r/min条件下培养48h；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基A中，于26℃，200r/min条件下培养48h，得到海洋红酵母(RMXS-1805)的发酵制剂，此时发酵制剂浓度可达108cfu/ml。
所述培养基A按质量计由葡萄糖30～35g、牛肉膏1g～4g、氯化铵1g～5g、酵母膏10g～15g和陈海水1000～1500g组成，pH为7～7.5。
(2)植物乳杆菌(ZW)和粪肠球菌(FC)发酵制剂培养：通过平板划线，将植物乳杆菌(ZW)和粪肠球菌(FC)分别接种到LB液体培养基中，28℃，遮光培养24-48h；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基B中，于28℃，180r/min条件下培养48h，得到ZW和FC的发酵制剂，此时发酵制剂浓度可达109cfu/ml。
所述培养基B按质量计由蛋白胨10g～15g、葡萄糖20g～25g、酵母膏5g～10g、牛肉膏10g～15g、硫酸镁0.1g～0.5g、磷酸氢二钾2g～5g、硫酸锰0.05g～0.1g、吐温-801ml～3ml、乙酸钠5g～8g、柠檬酸铵2g～5g和1000g～1500g蒸馏水组成，pH为7～7.5；
S102，复合菌制剂配方比例优化。
将培养好的海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW、粪肠球菌FC的菌液分别按照以下比例(菌落数量)进行混合：
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(6×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(6×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(6×109cfu/g)。
然后将其混匀制成4种不同配比的复合菌制剂。然后将其作为发酵菌剂与残饵粪便混匀进行后续发酵。
每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，加入相应的麸皮将碳氮比调整为12：1，将水分控制在55％，加入4个不同配比的复合菌制剂，每个配比的制剂设置3个平行，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入26℃恒温培养箱中发酵96h，发酵完毕后，通过记录发酵产物的感官效果以及结合海洋红酵母菌浓度，来确定最佳的复合菌制剂配方。
实验结果：
(1)发酵产物感官效果，见表5。
表5发酵产物感官效果
复合菌配比 颜色及感官气味
(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g) 颜色较亮，有浓郁的酒糟味和青草味
(6×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g) 颜色较亮，有较浓的酒糟味和青草味
(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(6×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g) 颜色偏暗，有较浓的酒糟味和青草味
(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(3×10<sup>9</sup>cfu/g):(6×10<sup>9</sup>cfu/g) 颜色偏暗，有较浓的酒糟味和青草味
(2)复合菌制剂配方比例优化中，发酵产物中海洋红酵母菌浓度，见图8。
综合感官发酵效果以及海洋红酵母菌浓度可以看出，复合菌配比为(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)可作为最佳配比。图9是本发明实施例提供的发酵后的产品效果图。
实施例5
在本发明一优选实施例中，本发明提供的发酵饲料制备方法包括：通过筛选保存了一株海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术方式，在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充一定的碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节适宜的料水比和温度，实现了将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成可再循环利用的饲料资源。
具体包括：
发酵饲料工艺条件优化过程。
收集工厂化循环水养殖池中的残饵粪便，将多余的水分沥干(放置24小时左右)，并最终将残饵粪便的水分浓缩至60％左右(大概残饵粪便可自然成形的状态)，残饵粪便的碳氮比约为10：1。
A.碳氮比优化：
每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，然后按设定的碳氮比加入相应量的麸皮，加入适量的水，将该体系水分控制在55％，碳氮比设定为10：1，11：1，12：1，13：1，14：1五个梯度，每个梯度3个平行，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)比例添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入26℃恒温培养箱中发酵96h，发酵完毕后，通过记录发酵产物的感官效果以及结合海洋红酵母菌浓度，综合确定发酵底物的最佳碳氮比。
实验结果：
发酵产物感官效果，见表6。
表6发酵产物感官效果
碳氮比 颜色及感官气味
10：1 颜色发黑，有浓烈的臭味
11：1 颜色偏黑褐色，有臭味，一点酒糟味
12：1 颜色为发亮黄色，无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
13：1 颜色为发亮黄色，无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
14：1 颜色为发亮黄色，无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
(2)碳氮比优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度，见图10。
综合感官发酵效果以及海洋红酵母菌浓度可以看出，随着碳氮比的增大，菌浓度也随着增加，并且从发酵气味的角度评价，随着碳氮比的升高，发酵物的臭味也越来越淡直至无臭味且逐渐变成酒糟味和清草香味；其中碳氮比10：1为不添加辅料麸皮的一组，发酵产物具有恶臭味，颜色偏黑，而碳氮比12：1组与碳氮比13：1和14:1组无臭味且具有酒糟味和青草味，颜色较亮，但无明显差别。综合发酵成本考虑，选择麸皮添加量相对较少一些的碳氮比12：1为最佳碳氮比。
B.发酵温度优化。
每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，加入相应的麸皮将碳氮比调整为12：1，将水分控制在55％，发酵温度设置20℃、23℃、26℃、29℃、32℃五个温度梯度，每个梯度3个平行，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)比例添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入相应的恒温培养箱中发酵96h，发酵完毕后，通过记录发酵产物的感官效果以及结合海洋红酵母菌浓度，综合确定最佳发酵温度。
实验结果：
(1)发酵产物感官效果，见表7。
表7发酵产物感官效果
温度℃ 颜色及感官气味
20 颜色发黑，有浓烈的臭味
23 颜色偏黑，有较浓的臭味
26 颜色为褐色，臭味不明显，有一点酒糟味和青草香味
29 颜色为黄色，无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
32 颜色为黄褐色，无臭味，酒糟味和青草香味较29℃淡
(2)发酵温度优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度，见图11。
综合感官发酵效果以及海洋红酵母菌浓度可以看出，在29℃时，发酵产物具有浓烈的酒糟味和青草味，同时在29℃时，海洋红酵母菌浓度达到最高水平。因此选择29℃作为最佳发酵温度。
C.发酵水分含量优化。
每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，加入相应的麸皮将碳氮比调整为12：1，含水率设置35％、45％、55％、65％四个梯度，每个梯度3个平行，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照菌落数量(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)比例添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入29℃恒温培养箱中发酵96h，发酵完毕后，通过记录发酵产物的感官效果以及结合海洋红酵母菌浓度，综合确定发酵底物的最佳发酵水分含量。
实验结果：
(1)发酵产物感官效果，见表8。
表8发酵产物感官效果
水分含量％ 颜色及感官气味
35 颜色发黑，有较浓烈的臭味，并且有结块、干瘪的现象
45 颜色偏黑，有较浓的臭味，并且有结块、干瘪的现象
55 色泽较亮，无臭味，相对蓬松且湿润，有较浓酒糟味和青草香味
65 颜色较暗，具有臭味，发酵产物较稀
(2)发酵水分含量优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度，如图12所示。
综合感官发酵效果以及海洋红酵母菌浓度可以看出，在含水率为55％时，发酵产物的感官效果最好，且海洋红酵母菌浓度达到最高，因此选择含水率为55％作为最佳发酵含水率。
D.发酵时间优化。
每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，加入相应的麸皮将碳氮比调整为12：1，将水分控制在55％，发酵温度为29℃，发酵时间设置为48h、72h、96h、120h，共5个时间段，每个时间段3个平行，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照菌落数量(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入29℃恒温培养箱中发酵，发酵完毕后，通过记录发酵产物的感官效果以及结合海洋红酵母菌浓度，综合确定最佳发酵时间。
实验结果
(1)发酵产物感官效果，见表9。
表9发酵产物感官效果
发酵时间h 颜色及感官气味
48 颜色偏黑，有较浓的臭味
72 颜色为褐色，臭味不明显，有一点酒糟味和青草香味
96 颜色为褐色，基本无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
120 颜色为褐色，基本无臭味，具有浓烈酒糟味和青草香味
(2)发酵时间优化中发酵产物中海洋红酵母菌浓度，见图13。
综合感官发酵效果以及海洋红酵母菌浓度可以看出，96h可作为最佳发酵时间。
综上：发酵方案为：碳氮比12：1，发酵温度29℃，含水量55％，复合菌配比(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)，发酵时间96h。
在本发明一优选实施例中，步骤S103后，还需进行发酵效果评估：每个样品袋中装入固定质量的鱼粪25g(含10g干物质)，加入相应的麸皮将碳氮比调整为12：1，将水分控制在55％，发酵温度为29℃，发酵时间96h，设置3个平行，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照菌落数量(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入29℃恒温培养箱中发酵。将发酵好的产物放入干燥机烘干并用粉碎机粉碎过60目，即可得到微生物发酵饲料，用来养殖卤虫。对发酵后的产物进行了测定，粗蛋白、粗脂肪与发酵前相比都有增加，粗灰分与粗纤维都有降低，总氨基酸含量相比发酵前有提高。
表10鱼粪发酵前后pH及气味儿变化
Figure BDA0003816377240000171
表11常规营养物质变化
发酵前 发酵后
粗蛋白 23.32％ 25.38％
粗脂肪 9.85％ 10.15％
粗灰分 14.62％ 13.46％
粗纤维 7.52％ 6.44％
表12发酵鱼粪氨基酸的变化(％)
Figure BDA0003816377240000172
Figure BDA0003816377240000181
实施例7
本发明提供一种利用所述海洋红酵母复合的发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂由海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌组成，按菌落数量海洋红酵母：粪肠球菌：植物乳杆菌＝(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)。
实施例8
本发明还提供一种发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法包括：
步骤1，海洋红酵母菌种的筛选和分离，一株海洋红酵母菌的分类鉴定，分子遗传学特征，以及海洋红酵母生长条件的测定；
步骤2，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养；
步骤3，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各个组分混合比例的优化。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
收集工厂化循环水养殖池中的残饵粪便，将多余的水分沥干(放置24小时左右)，并最终将残饵粪便的水分浓缩至60％左右(大概残饵粪便可自然成形的状态)，残饵粪便的碳氮比约为9：1，添加麸皮将碳氮比调至为12：1，加入适量水，将该体系的水分控制在55％左右，然后将海洋红酵母RMXS-1805、植物乳杆菌ZW和粪肠球菌FC按照(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)比例添加，加入菌液后并将整个体系混匀，然后装入密封袋内密封好，放入恒温箱内，将发酵温度维持在29℃，发酵96h。发酵结束后，将发酵好的产物烘干并用粉碎机粉碎过60目，即可得到微生物发酵饲料。
应用例1
养殖凡纳滨对虾：将对照组的正常对虾饲料命名为DO组，将烘干粉碎的微生物发酵饲料与正常对虾饲料按1：1混合命名为D1组。
具体步骤如下：健康的凡纳滨对虾购自于青岛宝荣水产有限公司，养殖用水盐度为17‰左右，在水族箱中驯化暂养，暂养期间每天将养殖用水每天提升2‰的盐度直到30‰左右，稳定两天用于养殖实验。暂养结束后，对虾进行饥饿处理24h，然后挑选健康、个体大小均匀的对虾150尾(初始体重3.57±0.01g)，均匀分配于10个50L的玻璃缸中，每个玻璃缸中放置15尾。10个玻璃缸随机分为2个实验组，每个组5个重复。进行为期42天的养殖实验，实验期间，每天投喂2次，分别为上午8：00和下午5：00各投喂一次，每天的投喂量为对虾体重的4％-5％，每次投喂前用虹吸法吸出残饵和粪便。每天换一次水，换水量为原水位的1/3到2/3左右，水温23℃左右，盐度28‰-30‰，pH7.8-8.0，溶氧量5mg/L以上，每日检查并记录对虾的摄食及死亡情况。
实验结束后，饥饿24h，称重并记录虾的末体重。并计算以下各生长指标：
成活率＝(实验后对虾数量/实验前放养数量)×100％
增重率(WGR)＝(W末-W初)×100％/W初
特定生长率(SGR)＝[(lnW末-lnW初)/t]×100％
式中：W末—末体重，W初—初体重
实验结果如表13所示：
表13凡纳滨对虾的生长、特定生长率、成活率和增重率
Figure BDA0003816377240000191
注：不同字母表示相互之间差异显著(P<0.05)。
从表中的生长数据可知，与正常饲料组相比，在饲料中添加部分粪便微生物发酵饲料并不影响凡纳对虾的生长，因此在实践养殖生产中可在正常饲料中添加部分粪便微生物发酵饲料以节约养殖成本，同时又能达到将废弃资源再循环利用的目的。
应用例2
养殖卤虫：将残饵粪便烘干粉碎命名为饲料D0组，烘干粉碎的微生物发酵饲料组为D1。
具体步骤如下：6个玻璃缸(35×35cm)分成2组，每组3个缸，分别为D0组和D1组。每个玻璃缸放同等规格的卤虫幼体100尾，每天8：00、13：00、19：00向D0组和D1组分别定时投喂等量的未发酵残饵粪便和微生物发酵饲料，饲养15天，每天清理一次缸底，全程不换水，每隔3天测定水体中氨氮NH4 +-N、亚硝氮NO2 --N、硝氮NO3 --N的含量并记录，饲养结束后将每个缸的卤虫全部捞出分别计数，统计各自的成活率。并且每个缸随机抽取10尾称重和量体长，算出平均体重和平均体长，最后测定养殖结束后的水质指标，结果如下表14所示：
表14卤虫的生长情况
处理组 成活率/％ 体长/mm 体重/mg
D0 47.88％<sup>a</sup> 2.95<sup>a</sup> 12.19<sup>a</sup>
D1 83.65％<sup>b</sup> 4.23<sup>b</sup> 17.56<sup>b</sup>
养殖期间氨氮变化情况，见图14。养殖期间亚硝氮变化情况，见图15。养殖期间硝氮变化情况，见图16。
从图14-图16中数据可以看出，投喂微生物发酵饲料的D1组，卤虫的成活率、体长和体重都优于投喂未发酵残饵粪便的D0组；并且水质也比直接投喂未发酵的残饵粪便D0组好。
总之，本发明提供地发酵饲料粉碎后用于卤虫养殖，与直接投喂未发酵的残饵粪便饲养卤虫相比，投喂该微生物发酵饲料养殖的卤虫成活率、体长和体重都高于投喂未发酵的残饵粪便处理组，而且养殖水质也好于投喂残饵粪便的处理组。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海洋红酵母，其特征在于，所述海洋红酵母为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginsoa)RMXS-1805，保藏日期为：2022年06月10日，保藏编号为：CGMCC NO.25049。
2.一种如权利要求1所述的海洋红酵母作为耐盐菌在水产养殖固体废弃物发酵处理上的应用。
3.一种用权利要求2所述的水产养殖固体废弃物发酵处理的海洋红酵母发酵制剂，其特征在于，所述海洋红酵母发酵制剂的培养方法包括：
通过平板划线，将海洋红酵母接种到YPD液体培养基中并进行培养；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基A中，培养得到海洋红酵母的发酵制剂。
4.根据权利要求3所述的海洋红酵母发酵制剂，其特征在于，所述培养基A按质量计由葡萄糖30g～35g、牛肉膏1g～4g、氯化铵1g～5g、酵母膏10g～15g和陈海水1000g～1500g组成，pH值为7～7.5。
5.一种利用权利要求1所述海洋红酵母复合的发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂，其特征在于，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂由海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌组成，按菌落数量添加量比为：海洋红酵母：粪肠球菌：植物乳杆菌＝(1～6×109cfu/g)：(1～6×109cfu/g)：(1～6×109cfu/g)。
6.一种如权利要求5所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂在水产养殖固体废弃物发酵以及海水养殖环境调控中的应用。
7.一种如权利要求5所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法包括：
步骤一，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养；
步骤二，发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各个组分混合比例的优化。
8.根据权利要求7所述发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂的制备方法，其特征在于，在步骤一发酵海水养殖固体废弃物复合菌制剂各组分的发酵培养中包括海洋红酵母发酵制剂培养、植物乳杆菌和粪肠球菌发酵制剂培养；
所述植物乳杆菌和粪肠球菌发酵制剂培养包括：通过平板划线，将植物乳杆菌和粪肠球菌分别接种到LB液体培养基中进行培养；然后按体积比为1％的接种量接种到液体发酵培养基B中，培养得到植物乳杆菌和粪肠球菌的发酵制剂；所述培养基B按质量计由蛋白胨10g～15g、葡萄糖20g～25g、酵母膏5g～10g、牛肉膏10g～15g、硫酸镁0.1g～0.5g、磷酸氢二钾2g～5g、硫酸锰0.05g～0.1g、吐温-801ml～3ml、乙酸钠5g～8g、柠檬酸铵2g～5g和1000g～1500g蒸馏水组成，pH为7～7.5；
所述步骤二中，海洋红酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌的菌液分别按照菌落数量进行以下优化：
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(6×109cfu/g):(3×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(6×109cfu/g):(3×109cfu/g)；
(3×109cfu/g):(3×109cfu/g):(6×109cfu/g)。
9.一种利用权利要求1所述海洋红酵母制备的海水养殖发酵饲料，其特征在于，海水养殖发酵饲料的制备方法包括以下步骤：
利用筛选保存的海洋红酵母，通过微生物发酵的生物技术在海水养殖过程产生的残饵粪便中补充碳源和氮源，调节碳氮比，然后加入海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌，调节料水比和温度，将海水养殖过程中产生的残饵粪便发酵成能再循环利用的海水养殖发酵饲料；所述碳氮比(12～14)：1，发酵温度29℃，料水比中含水量55％～65％，海洋红酵母、粪肠球菌和植物乳杆菌按菌落数量添加，海洋红酵母(1～6×109cfu/g)：粪肠球菌(1～6×109cfu/g)：植物乳杆菌(1～6×109cfu/g)，发酵时间96h。
10.一种利用权利要求9所述海水养殖发酵饲料在制备对虾养殖饲料或卤虫养殖饲料中的应用。
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CN117417853A (zh) * 2023-10-09 2024-01-19 中国海洋大学 一种海水罗塞略莫拉氏菌、菌剂及其制备方法和应用

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