CN110150457A - 一种抑菌型酵母培养物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑菌型酵母培养物及其应用，该酵母培养物由酿酒酵母菌HKB‑36在特定条件下特定培养基上充分发酵而成。本发明的酵母培养物，可显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌的生长，特别可用于提高畜禽的肠道健康和改善生长性能，减少饲料中抗生素的使用。

Description

一种抑菌型酵母培养物及其应用

技术领域

本发明涉及真菌领域，特别涉及一种抑菌型酵母培养物及其应用。

背景技术

中国作为养殖大国，养殖量和畜产品数量均占世界前列，但面临着疫病频发、饲料抗生素滥用和畜产品质量下降等诸多问题困扰。中国的抗生素消费量约占全球消费总量的50％，每年约为11万吨，其中养殖业用抗生素6.5万吨，约占全国抗生素总用量的60％。抗生素的过度使用已使中国成为全球抗菌素耐药性问题最为严重的国家之一。

鉴于此，2016年8月5日国家卫计委、国家***、科技部、农业部等14部委联合发布了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》(国卫医发〔2016〕43号)。严格限制抗菌素在养殖业上的使用是遏制细菌耐药性蔓延、确保“人医有药可用”的最重要的措施之一。农业部规定自2017年4月30日起，禁止硫酸粘杆菌素在饲料中的使用。2018年4月农业农村部公布了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案(2018-2021年)。方案指出要力争通过3年时间，实施养殖环节兽用抗菌药使用减量化行动试点工作，药物饲料添加剂将于2020年全部退出。这一行动对我国畜牧养殖业生产效率是一大冲击，充分开发能促进畜禽健康水平、提高生产性能的饲料资源迫在眉睫。

酵母培养物是一种在特定工艺条件下由酵母菌在特定的培养基(如玉米、麦麸和燕麦等谷物)上经过充分的厌氧发酵后形成的微生态制品，主要由细胞外代谢产品、经过发酵后变异的培养基和少量的已无活性的酵母细胞所构成。由于其富含蛋白质，且含有肽类、有机酸、寡糖、增味物质、芳香物质和未知生长因子，在改善饲料适口性、提高动物采食量、改善动物肠道健康和生长上具有重要作用。近年来，酵母培养已越来越受到国内外饲料和养殖业的重视。但是，现有技术中，酵母培养物的质量高低主要强调其肽类、有机酸、增味物质、芳香物质和未知生长因子等成分的含量，还未有关于具有抑菌活性酵母培养物的报道。并且，现阶段我国的酵母培养产品多为国外引进，本国的有关研究相对粗放。如何提高酵母培养物的产品品质，提高其作用效果，并降低其生产成本是目前国内研究亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为解决以上问题，本发明提供一株酿酒酵母菌HKB-36及其应用。

根据本发明的第一方面，提供一种抑菌型酵母培养物，该酵母培养物由该酿酒酵母菌HKB-36厌氧发酵而成。

根据本发明的第二方面，提供该酵母培养物在抑制细菌生长方面的应用。

其中，细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

根据本发明的第三方面，提供抑菌型酵母培养物的制备方法，该制备方法包括斜面菌种活化、种子液制备、液体有氧发酵和固体厌氧发酵步骤：

其中，种子液制备步骤中，液体培养基包括麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，液体培养基pH值为5.8-6.8。

其中，种子液制备步骤中，培养温度为28℃-36℃，转速为120-200r/min；培养时间为18-30h。

其中，液体有氧发酵步骤中，液体培养基包括麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，液体培养基pH值为5.8-6.8。

其中，液体有氧发酵步骤中，发酵温度为28℃-36℃，发酵时间为24-36h，通气量为1-4L/min。

其中，固体厌氧发酵步骤中，发酵培养基包括酒糟2-4份、玉米皮2-4份、麸皮1-3份和苹果渣1-3份，培养基碳氮比为2-7:1，水分含量为35％-70％。

其中，固体厌氧发酵步骤中，发酵温度为28℃-36℃，发酵时间18-48h。

其中，该制备方法还包括位于菌种液固体厌氧发酵后的制备发酵培养物成品的步骤：

调节发酵温度至60℃-75℃，对所述酿酒酵母菌HKB-36灭活破壁，然后粉碎干燥，制成酵母培养物成品。

1.本发明提供的酿酒酵母菌HKB-36的酵母培养物可显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌的生长，特别可用于提高畜禽的肠道健康和改善生长性能，减少饲料中抗生素的使用。

2.除具备抑菌能力外，本发明制备的酵母培养物，粗蛋白质和甘露聚糖含量高且稳定，粗蛋白质含量达28％以上，甘露聚糖含量高于0.5％

3.本发明的抑菌型酵母培养物还是一种具有高营养价值的饲料原料，能改善饲料适口性、提高动物采食量和提高饲料养分消化率；而且与普通酵母培养物最大的差异就是具有抗菌活性，能起到显著的改善动物肠道健康和生长性能的效果；采用的原料(酒糟、玉米皮、麸皮和苹果渣)成本低廉，充分利用这些资源，创造高附加值。

4.本发明采用液体-固体联合发酵制备工艺，研制出作用效果良好、价位低的抑菌型酵母培养物，过程简单，易操作。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1示出了根据本发明实施方式的酿酒酵母菌HKB-36的菌落形态电镜图片；

图2示出了根据本发明实施方式的酿酒酵母菌HKB-36的发育树图片；

图3示出了根据本发明实施方式的不同酿酒酵母菌的发酵代谢产物的抑菌效果图片；

图4示出了根据本发明实施方式的不同酿酒酵母菌的酵母培养物的抑菌效果图片；

图5示出了根据本发明实施方式的酿酒酵母菌HKB-36的抑菌型酵母培养物对断奶仔猪生长性能的影响图片；

图6示出了根据本发明实施方式的酿酒酵母菌HKB-36的抑菌型酵母培养物对断奶仔猪腹泻的影响图片。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1酿酒酵母菌HKB-36的分离筛选

(1)培养基：麦芽汁培养基。取500g麦芽，将其粉碎后放入烧杯中，加入2000mL蒸馏水，搅拌下45℃水浴30min，温度调高至70℃，保持1h；8层纱布过滤，并用正刘树洗涤烧杯和滤槽，使滤液达到2000mL，煮沸后再过来，冷却，10℃保存备用。

(2)酵母菌的分离：以啤酒、葡萄酒、泡菜、发酵果蔬汁、面团和马奶酒等为原料，分别采集400mL或400g原料样品(固体的捣碎)，置于无菌锥形瓶中，盖8层纱布于25℃-30℃自然发酵2-3d。无菌条件下，将发酵培养液样品摇匀，用无菌移液器吸取适量发酵液于经过灭菌的麦芽汁培养液中，25℃培养。待有酒味时采用梯度稀释法稀释至浓度为10^-4和10^-5，吸取0.1-0.2mL稀释后的培养液均匀涂布于麦芽汁培养基(麦芽汁培养液+2％琼脂)上，25℃倒置48h，待长出菌落后，选择具有典型单菌落(酵母菌菌落)进一步划线纯化2-3次，经镜检为纯培养物后分别转入麦芽汁固体斜面培养基上，4℃保存备用。

(3)酵母筛选：通过麦芽汁培养基进行培养，观察期生长情况，选择存活率最高、生长最茂盛的菌进行下一步的抑菌试验筛选。采用牛津杯法，在培养有大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄糖球菌的培养基中分别加入保存备用的酵母菌，不同酵母菌对着三株有害菌的抑杀效果如表1，选择抗菌/抑菌活性最佳的单一菌株，将其命名为HKB-36。

表1：不同酵母菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑杀试验

菌株鉴定：

1.菌落特征：麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、椭圆形、腊肠形，大小为(5.6-9.3)×(4.3-5.2)μm，有沉淀形成。麦芽汁琼脂斜面培养1个月，菌落奶酪状，乳白色，表面光滑，边缘整齐。玉米琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝，具体如图1所示。

2.菌株***发育分析

挑去纯化的HKB-36单菌落接种于pH为5.8的筛选培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速120r/min；培养30h，然后以其菌液为模板做PCR扩增菌株的ITS序列，进行测序，并将测序结果用分子进化遗传分析软件做其发育树，具体如图2所示，发现HKB-36与已登记的酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae的序列同源性最高，达到99％，因此确定其为酿酒酵母菌属Saccharomyces cerevisiae。

4.分子鉴定：测定的HKB-36的ITS序列如SED ID NO：1所示，将其在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行序列比对，基于同源性角度分析，酿酒酵母菌HKB-36是酿酒酵母菌属的新成员，将其命名为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiaeHKB-36。

实施例2抑菌型酵母培养物1的制备

(1)斜面菌种活化：将冷冻保藏的酿酒酵母HKB-36接种到含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L和琼脂2％的斜面培养基上，静置恒温30℃，培养48h，得到活化后的酵母菌种。

(2)种子液的制备：将活化后的酵母菌种用1环接种至含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，pH值为5.8的液体培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速200r/min；培养18h。

(3)液体有氧发酵：将制备好的种子液以15％接种量接种到装有新的含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，pH值为6.8的液体培养基的发酵罐中进行扩大培养，控制通气量为4L/min，温度为28℃，发酵时间为36h。得到扩大培养的液体菌种液。

(4)固体厌氧发酵：将液体菌种液以25％的接种量接种至质量份数为酒糟2份、玉米皮4份、麸皮3份和苹果渣1份的无菌固体培养基中，添加尿素控制碳氮比为2:1，于可控温发酵罐中进行厌氧发酵，控制水分含量为70％，发酵温度为36℃，发酵时间18h。得到固体发酵产物。

(5)酵母培养物产品的获得：固体发酵结束后，调节发酵罐的温度至60℃，对培养物中的酵母菌进行灭活和破壁，使其充分释放酵母细胞内容物中的甘露聚糖、核酸等物质，灭活破壁1h，随后将培养物转移至气流粉碎干燥机中进行粉碎干燥，即得到酵母培养物成品。

实施例3抑菌型酵母培养物2的制备

(1)斜面菌种活化：将冷冻保藏的酿酒酵母HKB-36接种到含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L和琼脂2％的斜面培养基上，静置恒温30℃，培养48h，得到活化后的酵母菌种。

(2)种子液的制备：将活化后的酵母菌种用1环接种至含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，pH值为6.8的液体培养基中，在36℃恒温摇床培养，转速120r/min；培养30h。

(3)液体有氧发酵：将制备好的种子液以15％接种量接种到装有新的含有麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，pH值为5.8的液体培养基的发酵罐中进行扩大培养，控制通气量为1L/min，温度为36℃，发酵时间为24h。得到扩大培养的液体菌种液。

(4)固体厌氧发酵：将液体菌种液以25％的接种量接种至质量份数为酒糟4份、玉米皮2份、麸皮1份和苹果渣3份的无菌固体培养基中，添加尿素控制碳氮比为7:1，于可控温发酵罐中进行厌氧发酵，控制水分含量为35％，发酵温度为28℃，发酵时间48h。得到固体发酵产物。

(5)酵母培养物产品的获得：固体发酵结束后，调节发酵罐的温度至75℃，对培养物中的酵母菌进行灭活和破壁，使其充分释放酵母细胞内容物中的甘露聚糖、核酸等物质，灭活破壁1h，随后将培养物转移至气流粉碎干燥机中进行粉碎干燥，即得到酵母培养物成品。

实施例4抑菌型酵母培养物的体外抑菌实验

以本发明的HKB-36，以及实施例1中分离的其他5株酵母菌分别为发酵菌株，根据实施例2的工艺制备得到不同的酵母培养物产品。采用牛津杯法进行抑菌试验，分别观察每株酵母菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果，且除了以生理盐水作为空白对照，增加氨苄青霉素作为阳性对照。

实验结果如图4所示。图4中，d3表示本发明的酿酒酵母菌HKB-36发酵所得的酵母培养物，d3H、d5、d5H、d10和d10H分别为酵母菌HKB-6、HKB-10、HKB-27、HKB-33和HKB-46分别发酵所得的酵母培养物。中间氨苄青霉素下方未标注的为生理盐水空白对照。

由图4可知，氨苄青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均具有良好的抑菌效果。本发明酿酒酵母HKB-36所发酵的酵母培养物也能明显抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生长，抑菌效果略弱于氨苄青霉素，且根据抑菌圈直径，对这3株菌的抑菌效果为大肠杆菌＞沙门氏菌＞金黄色葡萄球菌。而其他5株酿酒酵母发酵产生的酵母培养物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌几乎没有抑菌活性。

实施例5抑菌型酵母培养物对断奶仔猪生长性能的影响

取3周龄左右，平均体重6.8kg左右的断奶仔猪共计96头，每24头断奶仔猪分为一组，共计4组，分别为空白组(饲料不添加酵母培养物)和添加了200g/t、400g/t或600g/t的实施例2中本发明抑菌型酵母培养物的试验组。试验期28d，测定其平均日增重和料重比。

图5为酵母培养物对断奶仔猪生长性能的影响，由图5可知，断奶仔猪饲料中添加本抑菌型酵母培养物可显著提高其平均日增重，并改善其料重比，其中以400g/t的添加水平效果最佳，平均日增重较对照组提高11.04％、料重比降低2.4％。

实施例6抑菌型酵母培养物对断奶仔猪腹泻的影响

取4周龄左右，平均体重7.8kg左右的断奶仔猪共计36头，每12头断奶仔猪分为一组，共计3组，分别为空白组(饲料不添加酵母培养物)和添加了400g/t的实施例3中本发明抑菌型酵母培养物或市售普通酵母培养物的试验组。试验期4周，每周记录断奶仔猪腹泻情况。

图6为各种酵母培养物对断奶仔猪腹泻的影响分析图。由图6可知，与对照组相比，两个酵母培养物试验组均能改善断奶仔猪的腹泻情况，但本发明抑菌型酵母培养物的效果明显优于市售的普通酵母培养物。这也间接说明，本发明酿酒酵母HKB-36在发酵过程中产生了大量抑菌物质，所生产的酵母培养物能有效抑菌断奶仔猪肠道菌有害菌的生长，改善其肠道健康，进而实现防治腹泻的作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中农弘科生物技术有限公司

<120> 一株酿酒酵母菌HKB-36及其应用

<130> 20180705

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 554

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

aaaagctcaa atttgaaatc tggtaccttc ggtgcccgag ttgtaatttg gagagggcaa 60

ctttggggcc gttccttgtc tatgttcctt ggaacaggac gtcatagagg gtgagaatcc 120

cgtgtggcga ggagtgcggt tctttgtaaa gtgccttcga agagtcgagt tgtttgggaa 180

tgcagctcta agtgggtggt aaattccatc taaagctaaa tattggcgag agaccgatag 240

cgaacaagta cagtgatgga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtga aaaagtacgt 300

gaaattgttg aaagggaagg gcatttgatc agacatggtg ttttgtgccc tctgctcctt 360

gtgggtaggg gaatctcgca tttcactggg ccagcatcag ttttggtggc aggataaatc 420

cataggaatg tagcttgcct cggtaagtat tatagcctgt gggaatactg ccagctggga 480

ctgaggactg cgacgtaagt caaggatgct ggcataatgg ttatatgccg cccgtcttga 540

accaccggac caaa 554

Claims (8)

1.一种抑菌型酵母培养物，其特征在于，所述酵母培养物由酿酒酵母菌HKB-36发酵而成。

2.如权利要求1所述的酵母培养物在抑制细菌生长方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

4.一种如权利要求1所述的抑菌型酵母培养物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括斜面菌种活化、种子液制备、液体有氧发酵和固体厌氧发酵步骤。

5.如权利要求4所述的抑菌型酵母培养物制备方法，其特征在于，

种子液制备步骤中，液体培养基包括麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，液体培养基pH值为5.8-6.8；培养温度为28℃-36℃，转速为120-200r/min，培养时间为18-30h。

6.如权利要求4所述的抑菌型酵母培养物制备方法，其特征在于，

液体有氧发酵步骤中，液体培养基包括麦芽浸出粉145g/L、氯霉素0.08g/L，液体培养基pH值为5.8-6.8；发酵温度为28℃-36℃，发酵时间为24-36h，通气量为1-4L/min。

7.如权利要求4所述的抑菌型酵母培养物的制备方法，其特征在于，

固体厌氧发酵步骤中，发酵培养基包括酒糟2-4份、玉米皮2-4份、麸皮1-3份和苹果渣1-3份，培养基碳氮比为2-7:1，水分含量为35％-70％；发酵温度为28℃-36℃，发酵时间18-48h。

8.如权利要求4所述的抑菌型酵母培养物制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括位于固体厌氧发酵后的制备酵母培养物成品的步骤：

调节发酵温度至60℃-75℃，对所述酿酒酵母菌HKB-36灭活破壁，然后粉碎干燥，制成酵母培养物成品。