CN115252622B - 醛糖还原酶阻化剂及其在制备用于治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种醛糖还原酶阻化剂，所述阻化剂的有效成分包括奥氮平、槲皮素和黄芩苷中的一种或多种；还提供了其在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。本发明首次发现奥氮平作为醛糖还原酶阻化剂能够显著抑制肺癌细胞活性，引起细胞凋亡，其作用机制是抑制肺癌细胞谷氨酸代谢、糖酵解和TCA循环的代谢通路导致ATP供应不足所致。联合天然产物醛糖还原酶阻化剂(槲皮素或黄芩苷)使用均能显著抑制醛糖还原酶的活性，且效果更好。更重要的是，醛糖还原酶阻化剂中奥氮平已为上市药物，安全性高，临床主要用于治疗精神***症和躁狂发作。本发明首次发现奥氮平单用或结合天然产物醛糖还原酶阻化剂可用于治疗肺癌，将使更多肺癌患者获益。

Description

醛糖还原酶阻化剂及其在制备用于治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药用途技术领域，具体涉及一种醛糖还原酶阻化剂及其在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。
背景技术
肺癌主要分为两大类小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌是肺癌的主要一个亚型，约占全部肺癌的80%-85%。针对早期和局部晚期的非小细胞肺癌患者，手术切除或联合放化疗是目前的一线治疗方式，但是有效率较低。迄今为止，在肺癌的治疗效果只有免疫疗法比较好，鉴于价格昂贵，很多肺癌患者一线治疗依然选择化疗。肺癌的生存预后也仍不容乐观，尝试和开发新的药物是迫在眉睫之事。
醛糖还原酶(aldose reductase， AR) 属于醛酮还原酶超家族的成员，为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosohate， NADPH）依赖性氧化还原酶，是多元醇代谢通路的关键限速酶。该类酶在不同物种的多种细胞和组织中表达，广泛存在于神经、肌肉、晶状体、脑、肾脏、肺脏等动物体组织器官中。AR会催化饱和的和不饱和的醛(包括醛糖和单糖，以及大量其它底物)的还原，例如催化葡萄糖还原成山梨醇。由于山梨醇自身极性强不易通过细胞膜，会在细胞内蓄积，使细胞通透性发生改变，并使细胞中的Na+-K+-ATP酶活性下降，造成肌醇流失，导致细胞代谢与功能的损伤。综上，AR在癌症、糖尿病并发症、缺血/再灌注诱导的肝损伤和心脏脂质积聚中发挥着重要作用。寻找经济、高效、低毒的AR阻化剂对于癌症、糖尿病、心肌梗塞和缺血性损伤、哮喘、移植和有害的炎性应答等疾病的治疗具有极其重要的意义。
AR阻化剂按来源分为3类：植物来源的天然产物、微生物来源的抗生素和人工合成化合物。大多数人工合成的AR阻化剂由于疗效低、毒副作用大而未通过临床试验。目前，可供临床使用的AR阻化剂非常少。因此，寻找新的高效、低毒AR阻化剂迫在眉睫。
发明内容
针对上述存在的技术局限性，本发明提出了一种醛糖还原酶阻化剂及其在制备用于治疗肺癌的药物中的应用，克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的发明点是提供了一种醛糖还原酶阻化剂，所述阻化剂的有效成分包括奥氮平、槲皮素和黄芩苷中的一种或多种。
奥氮平已为上市20余年的药物，临床主要用于治疗精神***症和躁狂发作，不良反应较少。本发明首次发现该药物可有效抑制醛糖还原酶AR活性，可以作为治疗肺癌的候选药物。此外，植物是AR阻化剂的丰富来源，天然产物很少引起严重的不良反应。目前，天然产物AR阻化剂越来越广泛地应用于疾病治疗，并成为人工合成药物之外的最佳选择。
进一步的，上述的一种醛糖还原酶阻化剂，所述阻化剂的有效成分为奥氮平、奥氮平复配榭皮素、奥氮平复配黄芩苷、奥氮平复配榭皮素和黄芩苷。
在本发明的实施例中，针对奥氮平的有效剂量进行了相关细胞实验和动物实验，细胞实验中奥氮平的有效剂量为25-200μM（25μM、50μM、75μM、100μM 、125μM、150μM、175μM、200μM），动物实验中奥氮平的有效剂量为3-6 mg/kg；细胞实验中榭皮素和黄芩苷的有效剂量分别为槲皮素25-150μM（25μM、50μM、75μM、100μM、125μM、150μM）、黄芩苷50-200μM（50μM、75μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM），选择最佳有效剂量分别为槲皮素150μM、黄芩苷200μM。
奥氮平、榭皮素以及黄芩苷的有效剂量符合临床用药安全和功效的要求。
本发明的第二个发明点是提供了上述一种醛糖还原酶阻化剂在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。
利用奥氮平与天然产物AR阻化剂联用的方式来治疗肺癌是一种新方法，具有重大的社会学和经济学意义。
进一步的，上述的应用，所述肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺鳞癌、非小细胞肺腺癌、非小细胞腺鳞癌和大细胞肺癌中的一种或多种。
进一步的，上述的应用，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的谷氨酰胺代谢。
进一步的，上述的应用，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的糖酵解。
进一步的，上述的应用，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的三羧酸循环TCA。
进一步的，上述的应用，所述含有醛糖还原酶阻化剂的用于治疗肺癌的药物中，还包括有药学上可接受的载体辅料，药物的施用方式为口服。
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
1.奥氮平及其药物组合能够明显抑制醛糖还原酶的活性；
2.奥氮平在细胞水平能够阻碍肺癌细胞的谷氨酰胺代谢，从而抑制肺癌细胞的增殖，促进其凋亡；
3.奥氮平在细胞水平能够阻碍糖酵解过程，降低ATP能量的提供，从而抑制肺癌细胞的增殖，促进其凋亡；
4.奥氮平在细胞水平能够阻碍肺癌细胞的TCA循环，降低ATP能量的提供，从而抑制肺癌细胞的增殖，促进其凋亡。
附图说明
图 1 显示为奥氮平对AKR1B10，AKRAB1在mRNA水平的抑制情况；其中，图1中的A为奥氮平在H520细胞中对 AKR1B10 mRNA水平的抑制情况；图1中的B为奥氮平在H520荷瘤鼠中对 AKR1B10 mRNA水平的抑制情况；图1中的C为奥氮平在H520细胞中对 AKR1B1 mRNA水平的抑制情况；图1中的D为奥氮平在H520荷瘤鼠中对 AKR1B1 mRNA水平的抑制情况。
图2显示为通过 CCK8 实验检测奥氮平对 BASE-2B、H520和H226 细胞活性的影响，其中，图2中的A为奥氮平不同浓度处理H520后的24h和48h细胞活力检测结果，图2中的B为奥氮平不同浓度处理H226后的24h和48h细胞活力检测结果，图2中的C为奥氮平不同浓度处理BASE-2B后的24h和48h细胞活力检测结果。
图3显示为通过 EDU 实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞H520增殖能力的影响，其中，图3中的A为对肺鳞癌细胞 H520 进行EDU 细胞增殖实验的染色结果，图3中的B为对肺鳞癌细胞 H520 进行EDU 细胞增殖实验的统计结果。
图4显示为通过细胞划痕实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520迁移能力的影响，其中，图4中的A为细胞划痕实验的检测结果图，图4中的B为细胞划痕实验的数据统计图。
图5显示为通过 Transwell 实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520 迁移能力的影响，其中，图5中的A为Transwell 实验的检测结果图，图5中的B为Transwell 实验的检测数据统计图。
图6显示为通过 Annexin-7AAD 双染实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520 凋亡程度，其中，图6中的A为Annexin-7AAD 双染实验的流式细胞的检测结果图，图6中的B为Annexin-7AAD 双染实验的流式细胞的检测数据统计图。
图7 显示为Western Blot 实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520细胞凋亡蛋白，其中，图7中的A为Western Blot 实验的检测结果图，图7中的B为Western Blot 实验的检测数据统计图。
图 8显示为奥氮平在 H520 荷瘤鼠的抗肿瘤作用，其中，图8中的A为奥氮平作用于 H520 荷瘤鼠的裸鼠体重数据统计图，图8中的B为奥氮平作用于 H520 荷瘤鼠的瘤体积数据统计图，图8中的C为奥氮平作用于 H520 荷瘤鼠的瘤组织测量结果图，图8中的D为奥氮平作用于 H520 荷瘤鼠的瘤重量数据统计图。
图9通过 CCK8 实验检测槲皮素、黄芩苷、对 BASE-2B、H520细胞活性的影响。
图10通过 CCK8 实验检测奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对 BASE-2B、H520细胞活性的影响。
图11通过 EDU 实验检测奥氮平+黄芩苷对肺鳞癌细胞H520增殖能力的影响。
图12通过 EDU 实验检测奥氮平+槲皮素对肺鳞癌细胞H520增殖能力的影响。
图13通过 EDU 实验检测奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞H520增殖能力的影响。
图14通过细胞划痕实验检测奥氮平+黄芩苷对肺鳞癌细胞 H520迁移能力的影响。
图15通过细胞划痕实验检测奥氮平+槲皮素对肺鳞癌细胞 H520迁移能力的影响。
图16通过细胞划痕实验检测奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞 H520迁移能力的影响。
图17通过 Annexin-7AAD 双染实验检测奥氮平+黄芩苷对肺鳞癌细胞 H520 凋亡程度的影响。
图18通过 Annexin-7AAD 双染实验检测奥氮平+槲皮素对肺鳞癌细胞 H520 凋亡程度的影响。
图19通过 Annexin-7AAD 双染实验检测奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞H520 凋亡程度的影响。
图20 对照组-药物组的细胞内化合物PCA得分图。
图21 对照组-药物组的细胞内化合物PLS-DA模型图。
图22 对照组-药物组的细胞内化合物代谢通道分析图。
图23 奥氮平对谷氨酸代谢、糖酵解和TCA循环通路关键酶的mRNA表达的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种醛糖还原酶阻化剂，所述阻化剂的有效成分包括奥氮平、槲皮素和黄芩苷中的一种或多种。
阻化剂的有效成分为奥氮平、奥氮平复配榭皮素、奥氮平复配黄芩苷、奥氮平复配榭皮素和黄芩苷。
细胞实验中奥氮平的有效剂量为25-200μM（25μM、50μM、75μM、100μM 、125μM、150μM、175μM、200μM），动物实验中奥氮平的有效剂量为3-6 mg/kg；细胞实验中榭皮素和黄芩苷的有效剂量分别为槲皮素25-150μM（25μM、50μM、75μM、100μM、125μM、150μM）、黄芩苷50-200μM（50μM、75μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM），选择最佳有效剂量分别为槲皮素150μM、黄芩苷200μM。
奥氮平、榭皮素以及黄芩苷的最佳有效剂量符合临床用药安全和功效的要求。
还提供了醛糖还原酶阻化剂在制备用于治疗肺癌的药物中的应用。
肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺鳞癌、非小细胞肺腺癌、非小细胞腺鳞癌和大细胞肺癌中的一种或多种。
药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的谷氨酰胺代谢。
药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的糖酵解。
药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的三羧酸循环TCA。
用于治疗肺癌的口服药物中，还包括有药学上可接受的载体辅料。
本发明发现肺癌细胞中醛糖还原酶的mRNA表达水平显著升高。本发明以肺癌细胞（H520细胞株）为细胞模型和H520荷瘤鼠作为动物模型，使用奥氮平进行体外细胞和动物体内实验，实验结果表明，奥氮平能够明显抑制肺鳞癌细胞H520和H520荷瘤鼠醛糖还原酶的mRNA表达水平。
CCK8 实验表明奥氮平能够明显抑制肺鳞癌细胞H520的增殖，并且呈现剂量依赖效应。细胞划痕实验和Transwell实验表明奥氮平能明显抑制肺鳞癌细胞H520的迁移，并且呈现剂量依赖效应。用流式细胞术实验和凋亡通路调控蛋白水平检测表明奥氮平能够明显促进肺鳞癌细胞H520的凋亡。H520荷瘤鼠的实验表明在奥氮平在体内显著抑制H520肿瘤的生长。
本发明发现奥氮平作为醛糖还原酶阻化剂可以通过抑制肺癌细胞中c-Myc、GLUD、GLS和GS的基因抑制谷氨酰胺代谢。
本发明发现奥氮平作为醛糖还原酶阻化剂可以通过抑制肺癌细胞中HKII、GAPDHS、PK、PDH和LDH的基因抑制糖酵解过程。
本发明发现奥氮平作为醛糖还原酶阻化剂可以通过抑制肺癌细胞中的SDH、 MDH、CS和IDH基因抑制TCA循环。
因此，奥氮平可作为醛糖还原酶阻化剂应用于肺癌发病的治疗。
本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
实施例2
奥氮平对肺鳞癌细胞H520和H520荷瘤鼠醛糖还原酶mRNA表达的研究：
主要试剂：反转录试剂盒KR116-02（天根生化科技有限公司）；荧光定量试剂盒P205-02（天根生化科技有限公司）；引物序列（华大基因有限公司），具体如表1所示。
表1
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实验方法：
细胞培养：
（1）细胞准备：取正处于对数生长期的状态较好的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，同时吹打成单个细胞，然后把单个的细胞悬浮在含有10%胎牛血清的培养基中，等待使用。
（2）接种细胞：按照20000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔2000 μL，每组细胞设3个复孔。
（3）细胞加药：待细胞贴壁12小时后，再分别添加对照组0.1%DMSO和不同梯度浓度的奥氮平，置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养72H。
（4）细胞收集：细胞刮刀刮取各组细胞。离心1000rpm，5min，弃去培养液，用PBS洗涤细胞一次离心1000rpm，5min，弃去上清液。
动物实验：
将H520细胞（每只小鼠1×10 6 /0.2ml PBS）皮下注射到小鼠的右侧。接种后 7天，肿瘤生长到 80-100 mm 3的体积。将小鼠随机分为三组（每组 3 只小鼠），每天通过胃内注射给药注射 PBS（媒介物组）或奥氮平3mg/kg，6mg/kg，持续 21 天。在肿瘤出现后每3-4 天测量一次肿瘤体积，并通过公式V=a*b 2/2（a=最长轴；b=最短轴）。治疗后第21天处死小鼠，分离肿瘤，测量体积并称重。
总 RNA 提取：
将收集的细胞和肿瘤组织转移至1.5mL无酶离心管中，每管加入 1mL Tirzol 充***解。每1mL TRIzol中加200μL氯仿，剧烈震荡离心管15s，室温孵育5min后，4°C离心12000rpm，15min。离心后，分离为下层红色的有机相、中间的白色相以及上层透明的水相。转移含有RNA的水相到新离心管。加入 600ul 异丙醇上下颠倒混匀，室温孵育10min后，4°C离心 ，12000rpm，10min。弃去上清，可见白色沉淀。加入1ml 75%乙醇，4°C反向离心， 7500rpm，5min。尽量吸管内的所有的上清，室温干燥10min，以 20μL DEPC水溶解，-80°C 保存。
的合成：
（1）5×gDNA Buffer 2 μL；Total RNA 2μg；RNase-Free ddH2O 补足到 10μL，彻底混匀。简短离心，并置于 42℃，孵育 3 min，然后置于冰上放置；
（2）10×King RT Buffer 2 μL；FastKing RT Enzyme Mix 1 μL；FQ-RT PrimerMix 2 μL；RNase-Free ddH2O 补足到 10 μL。将其加入步骤（1）的得到的产物中，充分混匀。
（3）42℃，孵育15分钟，95℃，孵育3分钟。
实时荧光定量 PCR：
以上述 cDNA 为模板，按照下列反应体系和程序进行定量。反应体系：10uL 2×SuperReal PreMix Plus，1μL 引物 F，1μL 引物 R，2μL cDNA，18μL ddH2O。采用三步法反应程序：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 32s 后收集荧光信号，40个循环。
实验结果：
如图1结果显示，奥氮平可以抑制肺鳞癌细胞H520和H520荷瘤鼠醛糖还原酶mRNA的表达。
实施例3：
奥氮平对肺鳞癌细胞H520增殖和迁移能力的研究：
实验方法：
1.1通过CCK8实验测量细胞活力。
取生长状态良好的H520细胞制备成一定浓度的细胞悬液，每孔100ul加入96孔细胞培养板中。孵育过夜。再分别添加0.1%DMSO和不同梯度浓度的奥氮平，共孵育24和48小时。取10ul CCK-8溶液加入96孔细胞培养板，在37℃培养箱中继续孵育2小时。使用波长为450 nm 的自动荧光酶标仪获取每孔的吸光度。
1.2通过EDU 细胞增殖实验评估细胞的增殖能力
将H520细胞用不同浓度的奥氮平处理 24 小时和 48 小时，将培养基替换为含有10 μM EdU 的新鲜培养基并再孵育 2 小时。细胞用 4% 中性多聚甲醛固定，用 0.5%Triton X-100 透化，并根据制造商的说明用反应混合物和 Hoechst 33342 染色。用荧光倒置显微镜对细胞进行成像。
1.3细胞划痕实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520迁移能力的影响。
当 H520细胞在六孔板中达到 90% 汇合时，用无菌 200 μl 移液管尖端在细胞单层上损伤细胞，并用无血清培养基洗涤以去除分离的细胞，使用显微镜拍摄划痕间隙的图像。接下来，将细胞用不同浓度的奥氮平处理 24 小时和 48 小时。最后，使用显微镜拍摄伤口间隙的图像。
1.4通过 Transwell 实验检测奥氮平对肺鳞癌细胞 H520 迁移能力的影响。
H520细胞饥饿过夜，然后在上室（24 孔 transwell 室，8 μm）中用无血清培养基培养，而高血清培养基（含有不同浓度的奥氮平的10% FBS) 添加到下室。在 37°C 下孵育48 小时后，用甲醇固定细胞并用 0.1% 结晶紫染色。最后，使用显微镜拍摄图像。
实验结果：
为了奥氮平研究能否有效抑制人肺鳞癌细胞增殖活性，采用 CCK8 法检测细胞增殖抑制率。奥氮平以不同浓度分别对 BASE-2B（人正常肺细胞），H520（肺鳞癌细胞），H226（肺鳞癌细胞）进行处理。如图2，24h 和 48h 的数据都显示，相比空白对照，处理组的细胞增殖抑制率明显增高，并呈剂量依赖效应。而且，奥氮平对肺鳞癌的细胞的增殖抑制的程度明显比肺正常细胞的要高。24小时后。BASE-2B 的 IC50 为 211.7μM； H226 的 IC50 为155.0μM；H520 的IC50 为 162.9μM。为了进一步研究奥氮平对肺鳞癌细胞活性的影响，对肺鳞癌细胞 H520 进行EDU 细胞增殖实验。如图3所示，和对照组相比，奥氮平能明显降低肺鳞癌细胞 H520 的生长速率，细胞增殖数目明显较少，EDU 阳性率降低，可以抑制细胞的增殖能力，且成浓度依赖性（P<0.05）。这个结果进一步支持奥氮平是能够抑制肺鳞癌细胞H520 增殖。为了研究奥氮平对于抑制细胞迁徙能力的影响，采用细胞划痕实验，如图4显示，加入奥氮平后细胞迁徙及能力明显受到抑制（P<0.05）。为了进一步验证奥氮平对于抑制细胞迁徙能力的影响，采用 Transwell 实验，如 图5显示，加入奥氮平后细胞迁徙及能力明显受到抑制（P<0.05）。这个结果进一步支持奥氮平是能够抑制肺鳞癌细胞 H520的迁移。
实施例4：
奥氮平对肺鳞癌细胞H520的凋亡程度的研究：
实验方法：
1.1 Annexin-7AAD 双染实验检测奥氮平促进肺鳞癌细胞H520 凋亡程度
H520细胞在6孔板中生长并孵育过夜，将H520细胞用不同浓度的奥氮平处理 24小时和 48 小时。收集细胞并用 200 μL 结合缓冲液重悬，然后与 5 μL Annexin V-FITC和10 μL 7AAD在室温下避光孵育 15 分钟。每管共采集 10000 个细胞用于数据分析。
1.2 Western Blot实验检测奥氮平促进肺鳞癌细胞H520 凋亡程度
H520细胞在6孔板中生长并孵育过夜，将细胞用不同浓度的奥氮平处理 24 小时和 48 小时。收集细胞并用 PBS 洗涤，然后用含有蛋白酶阻化剂混合物的冷裂解缓冲液裂解。12 000rpm 离心15分钟后，提取蛋白质上清液，并通过 BCA 蛋白质检测试剂盒测量蛋白质浓度。每个样品的等量蛋白质在 12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，然后转移到PDVF膜上。PDVF膜在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭4小时，清洗干净后与一抗在4°C孵育过夜。第二天洗涤PDVF膜后与二抗孵育1小时。将膜洗涤干净后用奥德赛红外成像***检测印迹。
实验结果：为了研究奥氮平抑制肺鳞癌细胞增殖的机制，对肺鳞癌 H520 进行了Annexin-7AAD 双染，通过流式细胞仪分析，如图6所示，随着药物浓度的增大，H520 细胞的凋亡率升高明显（P<0.05）。为了进一步研究奥氮平诱导细胞诱导细胞凋亡的机制，采用 WB检测了细胞凋亡通路调控蛋白。如图7结果表明 BCL-2/BAX 的表达比例明显降低（P<0.05）。
实施例5：
奥氮平在 H520 荷瘤鼠的抗肿瘤作用的研究：
实验方法：同实施例2.
实验结果：我们评估了奥氮平对体内肺鳞癌细胞 H520 生长的影响。如图 8所示，处理基本上不影响小鼠的平均体重，但是能明显降低 H520 荷瘤的重量和体积（P<0.05）。
实施例6：
槲皮素、黄芩苷、奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对BASE-2B、H520细胞活性的影响。
实验方法：同实施例3。
实验结果：为了槲皮素、黄芩苷研究能否有效增加奥氮平抑制人肺鳞癌细胞增殖活性的效果，我们采用 CCK8 法检测细胞增殖抑制率。槲皮素、黄芩苷以不同浓度分别对BASE-2B（人正常肺细胞），H520（肺鳞癌细胞），H226（肺鳞癌细胞）进行处理。如图9，24h 和48h 的数据都显示，相比空白对照，处理组的细胞增殖抑制率明显增高，并呈剂量依赖效应。而且，我们采用 CCK8 法检测细胞增殖抑制率。对肺鳞癌的细胞的增殖抑制的程度明显比肺正常细胞的要高。我们选择槲皮素150μM、黄芩苷200μM做为接下来实验的浓度。为了研究奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞活性的影响，我们采用 CCK8 法检测细胞增殖抑制率。如图10所示，奥氮平和槲皮素、黄芩苷合并使用48H后，对肺鳞癌细胞H520的增殖抑制率效果显著。为了进一步研究奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞活性的影响，我们对肺鳞癌细胞 H520 进行EDU细胞增殖实验。如图11，12，13所示，和对照组相比，奥氮平和槲皮素、黄芩苷合并使用48H后能明显降低肺鳞癌细胞 H520 的生长速率，细胞增殖数目明显较少，EDU 阳性率降低，可以抑制细胞的增殖能力，且成浓度依赖性（P<0.05）。
实施例7：
奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对肺鳞癌细胞H520增殖和迁移能力的研究
实验方法：同实施例3。
实验结果：为了研究奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷对于抑制细胞迁徙能力的影响，采用细胞划痕实验，如图14，15显示，奥氮平和槲皮素、黄芩苷合并使用48H后细胞迁徙及能力明显受到抑制（P<0.05）。图16中我们可以发现奥氮平+槲皮素+黄芩苷合并使用后，细胞直接大面积悬浮，考虑可能是在低血清情况下，奥氮平+槲皮素+黄芩苷加剧抑制细胞活性，导致细胞不再贴壁。
实施例8：
奥氮平+槲皮素、奥氮平+黄芩苷、奥氮平+槲皮素+黄芩苷使肺鳞癌细胞H520肺的凋亡程度的研究
实验方法：同实施例4。
实验结果：为了研究奥氮平抑制肺鳞癌细胞增殖的机制，我们对肺鳞癌 H520 进行了Annexin-7AAD 双染，通过流式细胞仪分析，如图17，18，19所示，奥氮平和槲皮素、黄芩苷合并使用后，H520 细胞的凋亡率升高明显（P<0.05）。
实施例9：
奥氮平对肺鳞癌细胞的细胞代谢组学的研究：
实验方法：H520细胞在6孔板中生长并孵育过夜，将细胞用不同浓度的奥氮平处理72小时。然后，用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，用 1 mL 的10%甲醇+1%的甲酸的冰冷水溶液固定。从板上刮下细胞超声 30min，离心 10000rpm 1min。取上清 50μL 加入 450μL 的样品前处理液，混匀后离心，12000rpm，10min。取上清 5 μL 用于基于 LC-MS/MS 的代谢组测定。
实验结果：在 MetaboAnalyst5.0 软件正式分析前，对数据组进行 Paretoscaling 格式化处理，以获得更加直观且可靠的结果。为了判别两组之间是否具有差异，采用 PCA 建模方法对样本进行分析。对其进行主成分分析，见图20。为了获得导致这种显著差异的代谢物信息，进一步采用偏最小二乘方判别分析（PLS-DA）对 4 组样本进行分析见图21。VIP 是 PLS-DA 模型中各变量重要性评价的主要参数，VIP 值越大，对分类模型的贡献越大。以 VIP>1，筛选出代谢产物，定义为差异代谢物，用于对照和实验组的区分，对照组-药物组的细胞中内源性物质变化（VIP>1）如表2所示。利用 MetaboAnalyst5.0 软件分析 VIP 值大于 1 的主要具有差异的内源性代谢物，选择 P 值大于0.1的作为影响的主要代谢通路，见表3和图22。表3为对照组-药物组的细胞内化合物代谢通路分析结果。
表2
No 代谢物 VIP 15um/0um(%) 50um/0um(%) 150um/0um(%)
1 苯乙胺 12.248 85.31±35.36 76.15±31.21 46.8±17.49
2 精胺 5.5181 164.15±11.48 159.67±8.05 148.21±7.78
3 肌酸 5.4879 94.3±5.29 79.56±3.1 51.01±2.08
4 磷酸胆碱 4.6051 71.27±9.14 47.74±4.04 20.32±1.31
5 乳酸 3.8248 85.26±15.17 107.07±20.59 192.8±7.82
6 组胺 3.2534 108.65±39.82 126.92±41.22 166.69±49.27
7 缬氨酸 2.6627 86.48±36.93 91.33±31.15 67.69±35.28
8 L-脯氨酸 2.2792 113.79±11.47 143.56±12.12 200.97±9.67
9 L-精氨酸 2.2743 17.7±1.66 17.8±1.83 2.08±1.46
10 亚精胺 2.0203 104.25±2.93 94.03±3.16 85.85±5.03
11 PC(14:0/22:1(13Z)) 1.8592 121.1±38.13 205.97±133.35 254.11±192.41
12 PC(14:0/18:1(9Z)) 1.8446 69.7±32.73 636.88±490.98 263.03±405.94
13 左旋肉碱 1.7773 151.98±10.66 48.09±2.34 15.7±2.43
14 咖啡因 1.6564 35.28±16.83 19.36±9.39 20.71±7.67
15 柠檬酸 1.5398 271.18±50.97 286.98±64.55 192.46±18.21
16 丙酰肉碱 1.5244 55.43±27.92 128.8±58.57 234.79±72.19
17 N-乙酰-L-天冬氨酸 1.4791 165.63±14.27 201.76±34.47 122.79±11.96
18 PC(o-16:1(9Z)/18:0) 1.4153 169.72±131.74 163.71±104.02 230.32±162.07
19 PC(O-16:0/18:2(9Z，12Z)) 1.4086 96.04±49.8 219.44±220.49 204.24±250.83
20 丙酰肉碱 1.3934 59.55±25.75 151.51±82.07 268.97±114.34
21 油酰胺 1.3673 96.18±15.04 109.66±18.5 93.93±41.46
22 SM(d18:0/24:1(15Z)) 1.3301 327.77±149.1 622.42±227.82 1108.34±422.02
23 PC(o-18:1(9Z)/18:2(9Z，12Z)) 1.3255 134.92±188.12 270.37±283.8 222.4±266.7
24 7-酮石胆酸 1.3135 106.28±8.64 122.72±17.24 113.67±23.65
25 4-甲基苯丙*** 1.2014 122.8±50.77 140.93±41.17 166.85±51.91
26 PC(14:0/P-18:0) 1.1994 142.65±195.68 261.11±230.23 230.84±212.5
27 硬脂酸 1.186 107.75±10.19 95.28±11.24 104.16±13.93
28 2，4-二氨基丁酸 1.1764 87.6±51.48 125.71±73.78 129.09±22.18
29 L-乙酰肉碱 1.1518 192.74±13.64 106.55±15.75 40.34±2.85
30 PC(o-18:0/18:2(9Z，12Z)) 1.1509 114.45±59.02 165.03±103.7 259.43±218.27
31 L-组氨酸 1.1503 287.32±124.65 334.71±137.36 260.13±251.88
32 L-乙酰肉碱 1.1489 192.98±13.7 107±15.33 40.04±2.22
33 烟酰胺 1.1292 153.81±12.64 141.02±13.48 131.31±12.47
34 L-亮氨酸 1.1243 84.96±9.09 86.53±7.42 103.93±5.85
35 肌酐 1.1001 89.3±5.72 85.95±8.12 45.62±3.84
36 D-葡萄糖 1.0878 12.47±3.87 9.1±3.71 6.63±2.16
37 腺嘌呤 1.0434 143.22±30.24 108.78±18.58 81.85±29.57
38 3-羟基-3-甲基-2-氧代丁酸 1.0161 90.06±16.61 147.36±72.56 193.03±87.74
39 PC(16:1(9Z)/22:2(13Z，16Z)) 1.004 92.75±66.76 101.84±73.86 105.85±65.94
表3
NO 代谢通路 Total Hits FDR Impact
1 组氨酸代谢 16 2 0.5070 0.4098
2 苯丙氨酸代谢 10 1 1.0000 0.2381
3 烟酸和烟酰胺代谢 15 1 1.0000 0.1943
4 精氨酸和脯氨酸代谢 38 5 0.0310 0.1818
5 甘油磷脂代谢 36 2 1.0000 0.1038
实施例10：
奥氮平对肺鳞癌细胞中关键酶的mRNA表达的影响：
主要试剂：反转录试剂盒KR116-02（天根生化科技有限公司）；荧光定量试剂盒P205-02（天根生化科技有限公司）；引物（华大基因有限公司）。具体如表4所示。
表4
名称 引物序列
c-MYC F:5-GTGCCACGTCTCCACACATCAG-3
R:5-CCTTGGGGGCCTTTTCATTGTTTTC-3
GS F:5- AAAATGTCCCTCCGTTCTTATGG -3
R:5- CTGAAGTTGAGCGTAATACCAGT-3
GLS F:5- AGGGTCTGTTACCTAGCTTGG-3
R:5-ACGTTCGCAATCCTGTAGATTT-3
R:5- AGTCATCCGTGCGATATGCTC -3
GLUD F:5- GGGATTCTAACTACCACTTGCTCA-3
R:5- AACTCTGCCGTGGGTACAAT-3
HKII F:5-GAGCCACCACTCACCCTACT-3
R:CCAGGCATTCGGCAATGTG-3
GAPDHS F:5-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3
R:CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3
PK F:5-TCAAGGCCGGGATGAACATTG-3
R:CTGAGTGGGGAACCTGCAAAG-3
PDH F:5-AAGAGGCGCTTTCACTGGAC-3
R:ACTAACCTTGTATGCCCCATCA-3
CS F:5-AACTGCTACCCAAGGCTAAGG-3
R:CTTTTGAGAGCCAAGATACCTGT-3
IDH F:5-TGTGGTAGAGATGCAAGGAGA-3
R:TTGGTGACTTGGTCGTTGGTG-3
SDH F:5-CAAACAGGAACCCGAGGTTTT-3
R:CAGCTTGGTAACACATGCTGTAT-3
Mdh F:5-GGTGCAGCCTTAGATAAATACGC-3
R:AGTCAAGCAACTGAAGTTCTCC-3
LDH F:5-ATGGCAACTCTAAAGGATCAGC-3
R:CCAACCCCAACAACTGTAATCT-3
β-actin F:5-C TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3
R:5- TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3
实验方法：同实施例1。
实验结果：
对谷氨酰胺代谢通路的关键酶： c-Myc、GLUD、GLS、谷氨酰胺合成酶(GlutamineSynthetase ，GS) 进行了mRNA表达水平的检测，如图23结果显示，在将肺鳞癌细胞H520和奥氮平共培养72h后，C-MYC、GLUD、GLS和GS的表达显著性下降且有剂量依赖性。
对糖酵解和TCA循环通路的关键酶：己糖激酶（Hexokinase，HKII）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDHS）、丙酮酸激酶（PyruvateKinase ， PK）、丙酮酸脱氢酶（Pyruvate Dehydrogenase ， PDH）、柠檬酸合成酶（CitroylSynthetase ，CS）、异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydrogenase ， IDH）、琥珀酸脱氢酶（Succinodehydrogenase ，SDH）、苹果酸脱氢酶（Malic Dehydrogenase ， MDH）、乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase ，LDH）、进行了mRNA表达水平的检测，在将肺鳞癌细胞H520和奥氮平共培养72h后，相关基因的表达显著性下降且有剂量依赖性。最终奥氮平通过抑制谷氨酸代谢、糖酵解和TCA循环通路引起细胞凋亡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种醛糖还原酶阻化剂在制备用于治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述醛糖还原酶阻化剂的有效成分为奥氮平复配榭皮素和黄芩苷，所述肺癌为非小细胞肺鳞癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的谷氨酰胺代谢。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的糖酵解。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中的醛糖还原酶阻化剂能够抑制肺癌细胞的三羧酸循环TCA。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述用于治疗肺癌的药物中，还包括有药学上可接受的载体辅料，药物的施用方式为口服。
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