CN115244401A - 用于在休克患者中进行nt-adm抗体的治疗指导、监测和分层的dpp3 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法。具体来说，所述方法包括提供来自所述患者的样品，测定所述样品中的DPP3水平，其中所述样品中的DPP3水平指示是否需要用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架进行治疗。在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括另外测定来自所述患者的样品中的ADM‑NH2水平。

Description

用于在休克患者中进行NT-ADM抗体的治疗指导、监测和分层 的DPP3

技术领域

本发明涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法。具体来说，所述方法包括提供来自所述患者的样品，测定所述样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，其中所述样品中的DPP3水平指示是否需要用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架进行治疗。在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括另外测定来自所述患者的样品中的ADM-NH₂水平。此外，本发明还涉及一种用于进行本发明方法的药盒。

背景技术

二肽基肽酶3也称为二肽基氨基肽酶III、二肽基芳基酰胺酶III、二肽基肽酶III、脑啡肽酶B或红细胞血管紧张肽酶，简称为DPP3、DPPIII，是一种可从生理活性肽如脑啡肽和血管紧张肽除去二肽的金属肽酶。Ellis和Nuenke 1967在纯化的牛垂体前叶提取物中首次鉴定出DPP3并测量了它的活性。作为EC 3.4.14.4列出的酶具有约83kDa的分子质量，并且在原核生物和真核生物中高度保守(Prajapati和Chauhan 2011)。人类变体的氨基酸序列描述于SEQ ID NO 1中。二肽基肽酶III是一种遍在表达的主要胞质肽酶。尽管缺少信号序列，但数项研究报告了膜活性(Lee和Snyder 1982)。

DPP3是一种属于肽酶家族M49的锌依赖性外肽酶。它对从三/四个至十个氨基酸的不同组成的寡肽具有广泛的底物特异性，并且还能够在脯氨酸后切割。已知DPP3从其底物，包括血管紧张肽II、III和IV、Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽、内啡肽1和2的N端使二肽水解。金属肽酶DPP3在pH 8.0-9.0下具有其最佳活性，并且可以通过添加二价金属离子如Co²⁺和Mg^{2 +}来激活。

DPP3的结构分析揭示了催化基序HELLGH(hDPP3 450-455)和EECRAE(hDPP3 507-512)以及对底物结合和水解来说重要的以下氨基酸：Glu316、Tyr318、Asp366、Asn391、Asn394、His568、Arg572、Arg577、Lys666和Arg669(Prajapati和Chauhan 2011；Kumar等, 2016；编号是指人DPP3的序列，参见SEQ ID NO.1)。考虑到参与底物结合和水解的所有已知氨基酸或序列区域，可以将人DPP3的活性位点定义为氨基酸316与669之间的区域。

DPP3的最主要底物是血管紧张肽II(Ang II)，即肾素-血管紧张肽***(RAS)的主要效应子。RAS在心血管疾病(Dostal等,1997.《分子与细胞心脏病学杂志》(J Mol Cell Cardiol)29:2893-902；Roks等,1997.《心血管》(Heart Vessels).增刊12:119-24)、脓毒症和脓毒性休克(Corrêa等,2015.《重症监护》(CritCare)19:98)中被激活。具体来说，已经证明Ang II调节许多心血管功能，包括血压控制和心脏重塑。

最近，产生、表征并验证了特异性检测人类体液(例如血液、血浆、血清)中的DPP3的两种测定法：检测DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(LIA)和检测特异性DPP3活性的酶捕获活性测定法(ECA)(Rehfeld等,2019.JALM3(6):943-953)。在对DPP3活性进行真正检测之前进行洗涤步骤以除去所有干扰物质。两种方法都是高度特异的，并且允许重复检测血液样品中的DPP3。

心源性休克患者的循环DPP3水平被证明有所升高，并且与短期死亡率和严重器官功能障碍风险增加相关(Deaniau等,2020.《欧洲心力衰竭杂志》(Eur J Heart Fail.)22 (2):290-299)。此外，在纳入时测量的DPP3可区分确实发生了难治性休克与非难治性休克且DPP3浓度>59.1ng/mL的心源性休克患者与更高的死亡风险相关(Takagi等,2020.《欧洲 心力衰竭杂志》22(2)：279-286)。

1993年首次描述了肽肾上腺髓质素(ADM)(Kitamura等,1993.《生物化学和生物物 理研究通讯》(Biochem Biophys Res Comm)192(2):553-560)为从人嗜铬细胞瘤细胞系分离的包含52个氨基酸的新型降血压肽(SEQ ID No.:20)。同年，还描述了编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA和这种前体肽的完整氨基酸序列。所述前体肽尤其在N端包含21个氨基酸的信号序列，被称为“前肾上腺髓质素前体”(pre-proADM)。在本说明书中，指定的所有氨基酸位置通常都与包含所述185个氨基酸的pre-proADM有关。肽肾上腺髓质素(ADM)是包含52个氨基酸(SEQ ID No:20)并且包含pre-proADM的氨基酸95至146的肽，它是由蛋白水解切割形成。迄今为止，切割pre-proADM时形成的肽片段中基本上仅数个片段得到了更准确的研究，特别是生理活性肽ADM和“PAMP”，一种包含20个氨基酸(22-41)的肽，它跟在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸之后。1993年，ADM的发现和表征引发了密集的研究活动，其结果已经在各种综述文章中进行了总结，具体来说，在本说明书的上下文中，特别提到了《肽》专门针对ADM的一期中找到的文章(Takahashi2001.《肽》(Peptides)22:1691； Eto2001.《肽》22:1693-1711)。另一综述为Hinson等,2000(Hinson等,2000.《内分泌学综 述》(Endocrine Reviews)21(2):138-167)。在迄今为止的科学研究中，尤其已经发现ADM可以被视为多功能调节肽。它以通过甘氨酸延长的非活性形式释放到循环中(Kitamura等, 1998.《生物化学和生物物理研究通讯》244(2):551-555)。还有一种结合蛋白(Pio等,2001. 《生物化学杂志》(The Journal of Biological Chemistry)276(15):12292-12300)，它对ADM特异并且同样可能调节ADM的作用。ADM以及PAMP的那些生理效应是影响血压的效应，它们在迄今为止的研究中最为重要。

因此，ADM是一种有效的血管扩张剂，因此有可能将降压作用与ADM C端部分的特定肽区段相关联。此外已经发现，由pre-proADM形成的上述生理活性肽PAMP同样表现出了降压作用，即使它似乎具有不同于ADM的作用机制(除了上述综述文章Eto等,2001和Hinson 等,2000以外，还参见Kuwasaki等,1997.《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS Lett)414(1): 105-110；Kuwasaki等,1999.《临床生物化学年鉴》(Ann.Clin.Biochem.)36:622-628； Tsuruda等,2001《生命科学》(Life Sci.)69(2):239-245和EP-A2 0 622 458)。此外已经发现，在多种病理状态下，可以在循环和其他生物液体中测量的ADM浓度明显高于在健康对照受试者中发现的浓度。因此，充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾脏疾病、高血压病症、糖尿病、休克急性期以及脓毒症和脓毒性休克患者的ADM水平显著升高，但程度不同。PAMP浓度在一些所述病理状态中也升高，但血浆水平相对于ADM较低(Eto 2001.《肽》22:1693-1711)。据报告，在脓毒症中观测到异常高浓度的ADM，并且在脓毒性休克中观测到最高浓度(Eto 2001. 《肽》22:1693-1711；Hirata等,《临床内分泌学和代谢杂志》(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)81(4):1449-1453；Ehlenz等,1997.《实验和临床内分泌 学和糖尿病》(Exp Clin Endocrinol Diabetes)105:156-162；Tomoda等,2001.《肽》22: 1783-1794；Ueda等,1999.《美国呼吸与重症医学杂志》(Am.J.Respir.Crit.CareMed.)160: 132-136；以及Wang等,2001.《肽》22:1835-1840)。

ADM的血浆浓度在心力衰竭患者中升高并且与疾病严重程度相关(Hirayama等, 1999.《内分泌学杂质》(J Endocrinol)160:297-303；Yu等,2001.《心脏》(Heart)86:155- 160)。在这些受试者中，高血浆ADM是一个独立的负面预后指标(Poyner等,2002.《药理学综 述》(Pharmacol Rev)54:233-246)。

WO2004/097423描述了针对肾上腺髓质素的抗体用于心血管病症的诊断、预后和治疗的用途。本领域还描述了通过阻断ADM受体来治疗疾病(例如WO2006/027147、PCT/EP2005/012844)，所述疾病可以是脓毒症、脓毒性休克、心血管疾病、感染、皮肤疾病、内分泌疾病、代谢疾病、肠胃疾病、癌症、炎症、血液疾病、呼吸***疾病、肌肉骨骼疾病、神经***疾病、泌尿***疾病。

据报告，对于脓毒症的早期阶段，ADM改善了心脏功能以及肝脏、脾脏、肾脏和小肠的血液供应。抗ADM中和性抗体在脓毒症早期阶段期间中和了前述作用(Wang等,2001.《肽》 22:1835-1840)。

对于其它疾病，阻断ADM可能在一定程度上有益。然而，如果ADM被完全中和，也可能有害，因为若干生理功能可能需要一定量的ADM。在许多报告中都强调ADM的施用可能对某些疾病有益。相比之下，在其它报告中，据报告ADM在某些疾患下施用时会危及生命。

WO2013/072510描述了一种用于治疗患者的严重慢性或急性疾病或急性疾患以降低所述患者的死亡风险的非中和性抗ADM抗体。

WO2013/072511描述了一种用于治疗患者的慢性或急性疾病或急性疾患以预防或减轻器官功能障碍或器官衰竭的非中和性抗ADM抗体。

WO2013/072512描述了一种非中和性抗ADM抗体，它是一种可提高肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t_1/2半保留时间)的ADM稳定性抗体。这种ADM稳定性抗体将ADM的生物活性阻断了少于80％。

WO2013/072513描述了一种用于治疗患者的急性疾病或疾患以稳定循环的非中和性抗ADM抗体。

WO2013/072514描述了一种用于调节患有慢性或急性疾病或急性疾患的患者的体液平衡的非中和性抗ADM抗体。

WO2017/182561描述了用于测定患者样品中的总量或活性DPP3以诊断与坏死过程有关的疾病的方法。它还描述了一种通过针对DPP3的抗体治疗坏死相关疾病的方法。

本发明的令人惊讶的发现是在休克患者和将要休克的患者中，将体液样品中的DPP3水平用于抗ADM抗体和/或抗ADM抗体片段和/或抗ADM非Ig支架的治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层。此外，本发明的结果清楚地表明，如果体液样品中的DPP3水平低于阈值，则休克患者会最受益于用抗ADM抗体进行的治疗。

发明内容

本发明的主题是一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·其中所述样品中的DPP3水平指示是否需要用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架进行治疗，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

本发明的主题是一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·向所述患者施用抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中如果所述测定的DPP3水平低于预定阈值，则用所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架治疗所述患者，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

本申请的主题是一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·向所述患者施用抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，

其中如果所述测定的DPP3水平低于预定阈值，则对所述患者进行治疗，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

本申请的一个实施方式涉及一种用于在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。

本申请的一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中

·在心源性休克的情况下，所述患者可能已经患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述患者患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者

·在低血容量性休克的情况下，所述患者可能已经患有出血性疾病，包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂情形下的自发性出血，或者非出血性疾病，包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/无感失水(例如烧伤、中暑)、或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤情形下的第三间隙体液丧失，或者

·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已经患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者

·在分布性休克的情况下，所述患者可能患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述受试者的体液样品中DPP3的所述预定阈值在20和120ng/mL之间，更优选在30和80ng/mL之间，甚至更优选在40和60ng/mL之间，最优选所述阈值为50ng/mL。

本申请的另一个具体实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中测定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并且与预定阈值进行比较。

本申请的另一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至DPP3的捕获结合剂接触来测定DPP3水平。

本申请的一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂是抗体。

本申请的一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂被固定在表面上。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，其中所述分离步骤是从所捕获的DPP3除去所述样品中未与所述捕获结合剂结合的成分的洗涤步骤。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性的方法包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3底物添加到所述分离的DPP3，

·通过测量和定量DPP3底物的转化来定量所述DPP3活性。

本申请的另一个具体实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中通过选自以下的方法检测DPP3底物转化：产荧光底物(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)的荧光、发色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(PromegaProtease-Glo^TM测定法)、质谱法、HPLC/FPLC(反相色谱法、尺寸排阻色谱法)、薄层色谱法、毛细管区带电泳、凝胶电泳后进行活性染色(固定的活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

本申请的另一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性并且其中所述底物可以选自：血管紧张肽II、III和IV、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、内啡肽1和2、valorphin、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中二肽为Arg-Arg。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中所述底物可以选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中二肽为Arg-Arg。

本申请的一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的特征还在于具有高于阈值的ADM-NH₂水平。

本申请的一个具体实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品中的ADM-NH₂的所述阈值在40和100pg/mL之间，更优选在50和90pg/mL之间，甚至更优选在60和80pg/mL之间，最优选所述阈值为70pg/mL。

本申请的一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至ADM-NH₂的捕获结合剂接触来测定ADM-NH₂水平。

本申请的另一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。

本申请的另一个具体实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中组合测定DPP3水平和ADM-NH₂水平。

本申请的另一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中同时测定DPP3水平和ADM-NH₂水平。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中使用即时医护(point-of-care)装置测定DPP3水平和ADM-NH₂水平。

本申请的另一个优选实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述即时医护装置是微流体装置。

如本文所用，微流体装置具有布置在不同位置的多个腔室，这些腔室并联连接并且可以在不使用单独驱动源的情况下有效地分配固定量的流体到其中，其中所述装置包括具有旋转中心并包括至少一个微流体结构的平台。微流体装置用于通过操纵少量流体来进行生物或化学反应。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至ADM的N端末端(氨基酸1)。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体、抗体片段或非Ig支架不结合至ADM的C端部分，所述ADM的C端部分具有ADM的氨基酸43-52序列：PRSKISPQGY-NH₂(SEQID NO:24)。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段是结合至ADM的单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:1

GYTFSRYW

CDR2：SEQ ID NO:2

ILPGSGST

CDR3：SEQ ID NO:3

TEGYEYDGFDY

并且其中轻链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY

CDR2：

RVS

CDR3：SEQ ID NO:5

FQGSHIPYT。

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列作为VH区：

SEQ ID NO:6(AM-VH-C)

SEQ ID NO:7(AM-VH1)

SEQ ID NO:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID NO:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

并且包含选自以下序列的序列作为VL区：

SEQ ID NO:11(AM-VL-C)

SEQ ID NO:12(AM-VL1)

SEQ ID NO:13(AM-VL2-E40)

本申请的另一个实施方式涉及一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为重链：

SEQ ID NO:32

并且包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为轻链：

SEQ ID NO:33

在本发明的一个实施方式中，测定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并且与阈值水平进行比较。

在本发明的一个具体实施方式中，所述患者的体液样品中的DPP3阈值在20和120ng/mL之间，更优选在30和80ng/mL之间，甚至更优选在40和60ng/mL之间，最优选所述阈值为50ng/mL。

在本发明的一个具体实施方式中，DPP3水平的阈值为正常健康人群的5倍中值浓度，优选为4倍中值浓度，更优选为3倍中值浓度，最优选为2倍中值浓度。

所述受试者的体液样品中作为DPP3蛋白的量和/或DPP3活性的DPP3水平可以通过不同的方法来测定，例如免疫测定法、活性测定法、质谱法等。

可以通过检测DPP3特异性底物的切割产物来测量DPP3活性。已知的肽激素底物包括Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、内啡肽1和2、valorphin、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH(促肾上腺皮质激素)和MSH(黑素细胞刺激激素；

等,2000；

等,2007；Dhanda等, 2008)。可以通过检测相应的切割产物来监测上述肽激素以及其它无标签寡肽(例如Ala-Ala-Ala-Ala，Dhanda等,2008)的切割。检测方法包括但不限于HPLC分析(例如Lee和Snyder 1982)、质谱(例如

等,2000)、Hl-NMR分析(例如Vandenberg等,1985)、毛细管区带电泳(CE；例如

等,2007)、薄层色谱(例如Dhanda等,2008)或反相色谱(例如Mazocco等,2006)。

检测由于产荧光底物被DPP3水解而产生的荧光是监测DPP3活性的标准程序。那些底物是与荧光团偶联的特定二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)。荧光团包括但不限于β-萘基酰胺(2-萘基酰胺、βNA、2NA)、4-甲氧基-β-萘基酰胺(4-甲氧基-2-萘基酰胺)和7-酰氨基-4-甲基香豆素(AMC、MCA；

等,2000,Ohkubo等,1999)。这些产荧光底物的切割分别导致荧光β-萘基胺或7-氨基-4-甲基香豆素的释放。在液相测定法或ECA中，将底物和DPP3以例如96孔板形式温育，并使用荧光检测器测量荧光(Ellis和 Nuenke,1967)。此外，可以将携带DPP3的样品固定在凝胶上并通过电泳加以分离，用产荧光底物(例如Arg-Arg-βNA)和Fast Garnet GBC将凝胶染色，并且通过荧光读取器检测荧光蛋白条带(Ohkubo等,1999)。同样的肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)可以与发色团如Asp-硝基苯胺二乙酸酯偶联。检测由于发色底物水解引起的颜色变化可用于监测DPP3活性。

用于检测DPP3活性的另一个选项是Protease-Glo^TM测定法(可以从Promega商购)。在所述方法的这个实施方式中，DPP3特异性二肽或三肽(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)与氨基荧光素偶联。在被DPP3切割后，氨基萤光素被释放出来，并充当发出可检测发光的偶联荧光素酶反应底物。

在一个优选实施方式中，通过添加产荧光底物Arg-Arg-βNA并实时监测荧光来测量DPP3活性。

在所述测定受试者体液样品中的活性DPP3的方法的一个具体实施方式中，将与DPP3具有反应性的所述捕获结合剂固定在固相上。

使测试样品通过固定结合剂，而DPP3如果存在则结合至所述结合剂并且本身被固定以供检测。然后可以添加底物，并且可以检测反应产物以指示测试样品中DPP3的存在或量。出于本说明书的目的，术语“固相”可用于包括可以在其中或其上进行测定的任何材料或容器，并且包括但不限于：多孔材料、无孔材料、试管、孔、载片、琼脂糖树脂(例如来自GEHealthcare Life Sciences的Sepharose)、磁性粒子(例如来自于Thermo FisherScientific的Dynabeads^TM或Pierce^TM磁珠)等。

在本发明的另一个实施方式中，通过使所述体液样品与特异性结合至DPP3的捕获结合剂接触来测定DPP3水平。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述用于测定DPP3水平的捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

在本发明的一个具体实施方式中，所述捕获结合剂是抗体。

可以例如通过以下方法之一来测定所述受试者的体液样品中的DPP3蛋白的量和/或DPP3活性：

1.用于定量DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(LIA)(Rehfeld等,2019 JALM 3(6): 943-953)。

所述LIA是使用白色高结合性聚苯乙烯微量滴定板作为固相的一步化学发光夹心免疫测定法。将这些板用单克隆抗DPP3抗体AK2555(捕获抗体)包被。将示踪剂抗DPP3抗体AK2553用MA70-吖啶-NHS-酯标记，并以每孔20ng的浓度使用。将二十微升样品(例如源自于患者血液的血清、肝素-血浆、柠檬酸盐-血浆或EDTA-血浆)和校准物吸取到经过包被的白色微量滴定板中。在添加示踪剂抗体AK2553后，将所述微量滴定板在室温和600rpm下温育3小时。然后通过4个洗涤步骤(每孔350μL)除去未结合的示踪剂。使用微量滴定板发光计测量每个孔的剩余化学发光ls。用6点校准曲线来测定DPP3浓度。校准物和样品优选以一式两份运作。

2.用于定量DPP3活性的酶捕获活性测定法(ECA)(Rehfeld等,2019 JALM 3(6): 943-953)。

ECA是一种使用黑色高结合性聚苯乙烯微量滴定板作为固相的DPP3特异性活性测定法。将这些板用单克隆抗DPP3抗体AK2555(捕获抗体)包被。将二十微升样品(例如血清、肝素-血浆、柠檬酸盐-血浆、EDTA-血浆、脑脊液和尿液)和校准物吸取到经过包被的黑色微量滴定板中。在添加测定缓冲液(200μL)后，将所述微量滴定板在22℃和600rpm下温育2小时。样品中存在的DPP3通过结合到所述捕获抗体而被固定。通过4个洗涤步骤(每孔350μL)除去未结合的样品组分。通过在反应缓冲液中添加产荧光底物Arg-Arg-β-萘基酰胺(Arg2-βNA)，然后在37℃下温育1小时来测量固定的DPP3的比活性。DPP3将Arg2-βNA特异性切割成Arg-Arg二肽和荧光β-萘基胺。利用荧光计，使用340nm激发波长并在410nm检测发光来测量荧光。用6点校准曲线来测定DPP3活性。校准物和样品优选以一式两份运作。

3.用于定量DPP3活性的液相测定法(LAA)(从Jones等,《分析生物化学》 (Analytical Biochemistry),1982修改而来)。

LAA是一种使用黑色非结合性聚苯乙烯微量滴定板来测量DPP3活性的液相测定法。将二十微升样品(例如血清、肝素-血浆、柠檬酸盐-血浆)和校准物吸取到非结合性黑色微量滴定板中。在测定缓冲液(200μL)中添加产荧光底物Arg2-βNA后，在荧光计中使用340nm激发波长并在410nm检测发光测量初始βNA荧光(T＝0)。然后将板在37℃下温育1小时。测量(T＝60)的最终荧光。计算最终荧光和初始荧光之间的差。用6点校准曲线来测定DPP3活性。校准物和样品优选以一式两份运作。

在一个具体实施方式中，使用测定法来测定DPP3水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的DPP3并且为<20ng/ml，优选为<30ng/ml，更优选为<40ng/ml。

在一个具体实施方式中，所述结合剂表现出对DPP3的结合亲和力为至少10⁷M^-1，优选为10⁸M^-1，更优选亲和力为大于10⁹M^-1，最优选为大于10¹⁰M^-1。本领域技术人员知道可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低亲和力，并且这种措施不会导致超出本发明的范围。

在本发明的另一个实施方式中，所述体液样品选自全血、血浆和血清。

成熟ADM、bio-ADM和ADM-NH₂在本申请中作为同义词使用并且是根据SEQ ID No.:20的分子。

在一个具体实施方式中，根据本发明的体液是血液样品。血液样品可以选自全血、血清和血浆。在所述方法的一个具体实施方式中，所述样品选自人柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA血浆。

在一个具体实施方式中，使用测定法来测定ADM-NH₂水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的成熟ADM-NH₂并且为<70pg/ml，优选为<40pg/ml，更优选为<10pg/ml。

在本发明的一个具体实施方式中，ADM-NH₂的阈值在40和100pg/mL之间，更优选在50和90pg/mL之间，甚至更优选在60和80之间，最优选应用阈值70pg/ml。

在本发明的一个具体实施方式中，血浆ADM-NH₂阈值为正常健康人群的5倍中值浓度，优选为4倍中值浓度，更优选为3倍中值浓度，最优选为2倍中值浓度。

在一个具体实施方式中，所述结合剂表现出对ADM-NH₂的结合亲和力为至少10⁷M^-1，优选为10⁸M^-1，更优选亲和力为大于10⁹M^-1，最优选为大于10¹⁰M^-1。本领域技术人员知道可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低亲和力，并且这种措施不会导致超出本发明的范围。

为了测定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，使用Biacore 2000***(GE HealthcareEurope有限公司，德国弗莱堡)通过无标记表面等离子体共振测定肾上腺髓质素与固定抗体的结合动力学。使用以高密度与CM5传感器表面共价偶联的抗小鼠Fc抗体，根据制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)进行抗体的可逆固定(Lorenz等,2011.《抗 微生物剂和化学疗法》(Antimicrob Agents Chemother.) 55(1):165-173)。

在一个具体实施方式中，所述结合剂选自结合至ADM-NH₂的抗体或抗体片段或非Ig支架。

在一个具体实施方案中，使用测定法来测定ADM-NH₂水平，其中这种测定法为夹心测定法，优选为全自动测定法。

在一个实施方式中，这种用于测定生物标志物(DPP3和/或ADM-NH₂)水平的测定法是使用任何种类的检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的夹心免疫测定法，优选为全自动测定法。在诊断方法的一个实施方式中，这种测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于以下***之一的测定法：Roche

Abbott

Siemens

Brahms

Biomerieux

Alere

多种免疫测定法是已知的并且可用于本发明的测定法和方法，这些包括：质谱法(MS)、发光免疫测定法(LIA)、放射免疫测定法(“RIA”)、均相酶放大免疫测定法(“EMIT”)、酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)、酶蛋白再激活免疫测定法(“ARIS”)、基于发光的珠阵列、基于磁珠的阵列、蛋白质微阵列测定法、快速测试形式如试纸条免疫测定法、免疫色谱试条测试、稀有穴状化合物测定法和自动***/分析仪。

在本发明的一个实施方式中，这种测定法是使用任何种类的检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物的夹心免疫测定法，优选为全自动测定法。在本发明的一个实施方式中，这种测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于以下***之一的测定法：Roche

Abbott

Siemens

Brahms

Biomerieux

Alere

在本发明的一个实施方式中，它可以是所谓的POC测试(即时医护)，即允许在患者附近在不到1小时内进行测试而不需要全自动测定***的检测技术。这种技术的一个实例为免疫色谱测试技术，例如微流体装置。

在一个优选实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。

所述测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争测定法。在一个实施方式中，所述测定法呈夹心测定法的形式，这是一种非竞争免疫测定法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。第一抗体可以与固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或试条结合，第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”涉及的一般组合物和程序是已确立的并且为专业技术人员所知(《免疫测定手册》(The Immunoassay Handbook),David Wild编,Elsevier LTD,Oxford；第3版(2005年5月),ISBN-13:978- 0080445267；Hultschig C等,《化学生物学当前观点》(Curr Opin Chem Biol.)2006年2月； 10(1):4-10.PMID:16376134)。

在另一个实施方式中，所述测定法包含两种捕获分子，优选为都作为分散系存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一标记组分连接到第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记体系的一部分，并且所述标记体系的第二标记组分连接到第二捕获分子，使得两种捕获分子与分析物结合后产生可测量的信号，允许在包含所述样品的溶液中检测所形成的夹心复合物。

在另一个实施方式中，所述标记***包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料，特别是花青型染料的组合。

在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花菁染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类如伞形酮、苯甲酰亚胺类如Hoechst 33258、菲啶类如德克萨斯红、雅吉瓦黄、AlexaFluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料，咔唑染料、吩

嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括基于以下文献中针对化学发光材料所述的物理原理来使用染料(Kirk-Othmer,《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology),第4版,执行编辑J.I.Kroschwitz；编辑M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,第15卷,第518-562页，以引用的方式并入本文，包括第551-562页的引 文)。优选化学发光染料为吖啶酯。

如本文所提到的，“测定法”或“诊断测定法”可以是诊断领域应用的任何类型。这种测定法可以基于待检测的分析物与一种或多种捕获探针以一定亲和力的结合。考虑捕获分子与靶分子或目标分子之间的相互作用，亲和常数优选地大于10⁸M^-1。

在一个具体实施方式中，标记所述两种结合剂中的至少一种以便进行检测。

已经用所述ADM-NH₂测定法测定了本发明的ADM-NH₂水平(Weber等,2017.JALM2 (2):1-4)。已经用实施例概述的所述DPP3测定法测定了本发明的DPP3水平(Rehfeld等, 2019.JALM3(6):943-953)。如果上面提到的阈值以与本发明所用的测定***不同的方式校准，则这些阈值在其它测定法中可能不同。因此，考虑到校准差异，上述截止值应当相应地适用于此类以不同方式校准的测定法。定量校准差异的一种可能性是通过使用两种方法测量样品中的相应生物标志物(例如bio-ADM、DPP3)对所讨论的测定法与本发明所用的相应生物标志物测定法进行方法比较分析(相关性)。另一种可能性是鉴于此测试具有足够的分析灵敏度，用所述测定法测定代表性正常人群的中值生物标志物水平，将结果与如文献所述的中值生物标志物水平进行比较，并在通过该比较得到差异的基础上重新计算校准。利用本发明所用的校准，测量了来自于正常(健康)受试者的样品：中值血浆bio-ADM(成熟ADM-NH₂)为24.7pg/ml，最低值为11pg/ml，第99百分位数为43pg/ml(Marino等,2014.《重症 监护》18:R34)。利用本发明所用的校准，测量了来自于5,400个正常(健康)受试者(瑞典单中心前瞻性群体研究(MPP-RES))的样品：中值(四分位距)血浆DPP3为14.5ng/ml(11.3ng/ml-19ng/ml)。

如本文所用，术语“治疗指导”是指基于一个或多个生物标志物和/或临床参数和/或临床评分的值应用某些治疗或医学干预。

在本发明的上下文中，术语“治疗监测”是指监测和/或调整所述患者的治疗性治疗，例如通过获得对治疗功效的反馈。

术语“治疗分层”具体来说是指将患者分组或分类成不同的组，诸如根据分类接受或不接受治疗性措施的治疗组。

本发明方法的一个特定优点是休克患者或将要休克的患者可以就所需治疗进行分层，其中所述治疗是施用结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)的抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架。分层的患者组可以包括需要开始治疗的患者和不需要开始治疗的患者。

本发明的另一个特定优点是所述方法可以区分更有可能受益于所述治疗的患者和不太可能受益于所述治疗的患者。

在一个优选实施方式中，在提供了表明样品中DPP3和/或ADM-NH₂水平的样品分析结果后立即开始或改变治疗。在其它实施方式中，治疗可以在收到样品分析结果后12小时、优选6、4、2、1、0.5、0.25小时内或立即开始。

在一些实施方式中，所述方法包括以下或由以下组成：在单个样品和/或在基本上相同的时间点获得的多个样品中对来自患者的样品中的DPP3和/或ADM-NH₂进行单次和/或多次测量，以便指导和/或监测和/或分层治疗，其中所述治疗是施用结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)的抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架。

在本发明方法的上下文中，特别优选测定相同的样品中的DPP3水平和ADM-NH₂水平。在这个实施方式中，可以以多重测定形式同时或者以多重测定形式或单一测定形式在不同的时间点测定同一样品中的生物标志物DPP3和ADM-NH₂两者。多重测定法可以是用于测定两种标志物的双重测定法，其中所述测定法可以是可以在遇到患者的同一地点在样品分离后立即进行的即时医护测定法。

本发明还涉及一种用于实施本发明方法的药盒，所述药盒包含用于测定DPP3水平和另外用于测定来自患者的样品中的ADM-NH₂水平的检测试剂。

它还可能优选地测定为可以在患者遇到医务人员的地方如急诊室或初级监护室直接进行的即时医护测定法。此外，用于检测DPP3和另外ADM-NH₂的测定法可以是自动或半自动测定法，优选双重测定法和/或即时医护测定法。

在一个优选实施方式中，本发明涉及在来自患者的样品中测定DPP3水平以及另外测定ADM-NH₂和任选地其他生物标志物的水平的方法和药盒。

所述其它生物标志物可以选自降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、乳酸。

本发明还涉及一种用于实施本发明方法的药盒，所述药盒包含用于测定来自患者的样品中的DPP3和另外用于测定ADM-NH₂水平的检测试剂，以及参考数据，如参考和/或阈值水平，对应于所述样品中的DPP3水平在20和120ng/mL之间，更优选在30和80ng/mL之间，甚至更优选在40和60ng/mL之间，最优选为50ng/mL，其中所述参考数据优选存储在计算机可读介质上和/或以经配置以用于对测定的DPP3和另外测定的ADM-NH₂水平与所述参考数据进行比较的计算机可执行代码的形式使用。

在本文所述的方法的一个实施方式中，所述方法还包括将在休克患者或将要休克的患者中测定的DPP3和另外的ADM-NH₂水平与参考和/或阈值水平进行比较，其中所述比较在计算机处理器中使用计算机可执行代码进行。

本发明的方法可以部分地由计算机实现。举例来说，比较标志物例如DPP3和/或ADM-NH₂的检测水平与参考和/或阈值水平的步骤可以在计算机***中执行。举例来说，可以将测定的值输入(由健康专业人员手动地或从测定相应标志物水平的装置自动地)到计算机***中。计算机***可以直接在即时医护(例如初级监护室或ED)处，或者它可以在通过计算机网络(例如，通过互联网或专门的医疗云***，任选地可与其他IT***或平台如医院信息***(HIS)组合)连接的远程位置。替代地或另外地，为使用者(通常为健康专业人员，如医师)显示和/或打印相关治疗指导和/或治疗分层。

在本发明的一个具体实施方式中，所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。

在本发明的一个具体实施方式中，所述休克选自：

·在心源性休克的情况下，所述患者已经患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者

·在低血容量性休克的情况下，所述患者可能已经患有出血性疾病，包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂情形下的自发性出血，或者非出血性疾病，包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/无感失水(例如烧伤、中暑)、或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤情形下的第三间隙体液丧失，或者

·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已经患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者

·在分布性休克的情况下，所述患者患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。

休克的特征在于氧输送减少和/或氧消耗增加或氧利用不足导致细胞和组织缺氧。它是一种危及生命的循环衰竭疾患，最常见表现为低血压(收缩压低于90mmHg或MAP低于65mmHg)。根据根本原因，休克分为四种主要类型：低血容量性休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克(Vincent和De Backer 2014.《新英格兰医学杂志》(N.Engl J Med.)370 (6):583)。

低血容量性休克的特征在于血管内容量减少，并且可以分为两大亚型：出血性和非出血性。出血性低血容量性休克的常见原因包括胃肠道出血、外伤、血管病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到主要血管中)和使用抗凝剂情形下的自发性出血。非出血性低血容量性休克的常见原因包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/无感失水(例如烧伤、中暑)、或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻、外伤情形下的第三间隙体液丧失。关于综述，参见Koya和Paul 2018.《休克》(Shock).StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing；2019-2018 10月27日。

心源性休克(CS)定义为由于心输出量减少而导致的关键终末器官灌注不足的状态。值得注意的是，CS形成了从轻度灌注不足到深度休克范围内的疾病谱。用于诊断CS的既定标准为：(i)收缩压≤90mmHg持续>30分钟，或需要血管加压剂来实现血压≥90mmHg；(ii)肺充血或左心室充盈压升高；(iii)具有以下准则中至少一项的器官灌注受损征象：(a)精神状态改变；(b)皮肤湿冷；(c)少尿(<0.5mL/kg/h或<30mL/h)；(d)血清乳酸升高(Reynolds 和Hochman 2008.《循环》(Circulation)117:686-697)。急性心肌梗塞(AMI)继发心室功能障碍是CS的最常见病因，占病例的约80％。机械性并发症如室隔膜(4％)或游离壁破裂(2％)以及急性重度二尖瓣反流(7％)为AMI后CS的较少见病因。(Hochman等,2000.《美国心 脏病学杂志》(J Am Coll Cardiol)36:1063-1070)。非AMI相关CS可能由失代偿性瓣膜心脏病、急性心肌炎、心律失常等引起，具有不同的治疗选项。这意味着美国每年有40 000至50000名患者，而欧洲则为60 000至70 000名患者。尽管主要通过早期血管重建取得了治疗进展并降低了后续死亡率，但根据最近的登记和随机试验，CS仍然是AMI的主要死亡原因，死亡率仍接近40-50％(Goldberg等,2009.《循环》119:1211-1219)。

阻塞性休克由大血管或心脏本身的物理阻塞造成。有若干种疾患会导致这种形式的休克(例如心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞、主动脉瓣狭窄)。关于综述，参见Koya和Paul 2018.《休克》.StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing； 2019-2018 10月27日。

根据病因，存在四种类型的分布性休克：神经源性休克(交感神经刺激减弱导致血管张力降低)、过敏性休克、脓毒性休克和由肾上腺危象引起的休克。除了脓毒症以外，分布性休克还可以由除感染以外的其他疾患如胰腺炎、烧伤或外伤造成的全身炎性反应综合征(SIRS)引起。其他病因包括中毒性休克综合征(TSS)、过敏反应(突发性严重过敏反应)、肾上腺功能不全(慢性肾上腺功能不全的急性恶化、肾上腺的破坏或切除、由外源类固醇造成的肾上腺功能的抑制、垂体功能减退和激素生产的代谢性障碍)、对药物或毒素的反应、重金属中毒、肝(肝脏)功能不全和中枢神经***损伤。关于综述，参见Koya和Paul 2018.《休 克》.StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing；2019-2018 10月27日。

难治性休克定义为尽管容量复苏充分，但仍需要>0.5μg/kg/min的去甲肾上腺素输注。这些患者的死亡率可高达94％，并且为了存活，这些患者的评价和管理需要更加激进的方法。术语“难治性休克”用于组织灌注不能利用最初采用的校正措施(例如血管加压剂)来恢复的情况，并且因此可以称为“高血管加压剂依赖性”或“耐血管加压剂性”休克(Udupa 和Shetty2018.《印度呼吸护理杂志》(Indian J Respir Care)7:67-72)。难治性休克患者可能具有灌注不足的特征如低血压(平均动脉压<65mmHg)、心动过速、外周冰冷、毛细血管再充盈时间延长和由缺氧和酸中毒引起的呼吸急促。发热可见于脓毒性休克。还可见其它灌注不足征象如感觉改变、高乳酸血症和少尿。这些众所周知的休克征象无助于鉴定问题是在于泵(心脏)还是线路(血管和组织)。不同类型的休克可以共存，并且所有形式的休克都可能变成难治性的，如通过对高剂量血管加压剂无反应所证明(Udupa和Shetty 2018. 《印度呼吸护理杂志》7:67-72)。

脓毒性休克是一种可能致死的医学疾患，它在作为响应于感染的器官损伤或破坏的脓毒症导致危险的低血压和细胞代谢异常时发生。脓毒症和脓毒性休克的第三次国际共识定义(Sepsis-3)将脓毒性休克定义为脓毒症的一个子集，其中与单独的脓毒症相比，特别深度的循环、细胞和代谢异常与更高的死亡风险相关。脓毒性休克患者在临床上可以通过不存在低血容量时需要血管加压剂维持65mmHg以上的平均动脉压和高于2mmol/L(>18mg/dL)的血清乳酸水平来鉴定。这种组合与高于40％的医院死亡率相关(Singer等, 2016.JAMA.315(8):801-10)。原发性感染最常见由细菌引起，但还可能由真菌、病毒或寄生虫引起。它可能位于身体的任何部位，但最常见于肺、脑、泌尿道、皮肤或腹部器官。它会导致多器官功能障碍综合征(以前称为多器官衰竭)和死亡。通常，脓毒性休克患者在重症监护室接受治疗。它最常见影响儿童、免疫功能受损的个体和老年人，因为他们的免疫***无法像健康成年人那样有效地应对感染。脓毒性休克的死亡率为约25-50％。

在本发明的一个实施方式中，所述患者是在采集所述患者的体液样品时休克或将要休克的危重患者。

“将要休克的患者”定义为在从所述患者采集体液时没有休克，但发生休克的风险增加的危重患者。

在一个具体实施方式中，所述休克是脓毒性休克或心源性休克。

在CLP诱导型脓毒症小鼠的存活率研究中研究了靶向ADM的N端的非中和性抗体的功效。用非中和性抗体进行预治疗降低了儿茶酚胺输注率、肾功能障碍，并最终提高了存活率(Struck等,2013.《重症监护医学实验》(Intensive Care Med Exp)1(1):22；Wasner等, 2013.《重症监护医学实验》1(1):21)。

由于这些积极的结果，已经开发出一种N端抗ADM抗体的人源化版本，名为阿德瑞珠单抗(Adrecizumab)，以用于进一步临床开发。最近在全身炎症和脓毒症的临床前模型中证明了阿德瑞珠单抗对血管屏障功能和存活率的有益作用(Geven等,2018.《休克》50(6): 648-654)。在这项研究中，用阿德瑞珠单抗预治疗减轻了内毒素血症大鼠以及CLP诱导型脓毒症小鼠的肾血管渗漏，这与保护性肽Ang-1的肾脏表达增加和有害肽血管内皮生长因子的表达减少相吻合。此外，用阿德瑞珠单抗进行预治疗在单剂量施用时将CLP诱导型脓毒症小鼠的7天存活率从10％提高到50％，在重复剂量施用时从0％提高到40％。此外，在I期研究中，证明了优异的安全性和耐受性(参见实施例6)：未观察到严重不良事件，未检测到在阿德瑞珠单抗治疗的受试者中更常出现的不良事件的信号，未发现其它安全性参数的相关变化(Geven等,2017.《重症监护医学实验》5(增刊2):0427)。特别关注的是所提出的阿德瑞珠单抗作用机制。动物和人类数据都揭示了施用此抗体后循环ADM的有效剂量依赖性增加。根据药代动力学数据和MR-proADM(与ADM相同的激素原衍生的无活性肽片段)没有增加，循环ADM水平升高不能用产量增加来解释。

这种增加的机制解释可能是循环中过量的抗体可能会将ADM从间质排出到循环中，因为ADM小到足以越过内皮屏障，而抗体不是(Geven等,2018.《休克》.50(2):132-140)。此外，抗体与ADM结合导致ADM半衰期延长。尽管NT-ADM抗体部分抑制ADM介导的信号传导，但循环ADM的大量增加导致血液隔室中ADM活性的整体“净”增加，它对内皮细胞(EC)发挥有益作用(主要是屏障稳定)，而减少了ADM对间质中的血管平滑肌细胞(VSMC)的不利影响(血管舒张)。

在整个说明书中，根据本发明的“抗体”或“抗体片段”或“非Ig支架”能够结合ADM，因此针对ADM，因此可以称为“抗ADM抗体”、“抗ADM抗体片段”或“抗ADM非Ig支架”。

术语“抗体”通常包括单克隆和多克隆抗体及其结合片段，特别是Fc片段以及所谓的“单链抗体”(Bird等,1988)、嵌合、人源化、特别是CDR移植抗体以及双体抗体或四体抗体(Holliser等,1993)。还包括通过诸多技术(包括例如噬菌体呈现)加以选择以特异性结合至样品中所含的目标分子的免疫球蛋白样蛋白质。在这个背景下，术语“特异性结合”是指针对目标分子或其片段产生的抗体。如果抗体对目标分子或其上述片段的亲和力比对含有目标分子的样品中所包含的其它分子的亲和力高出至少50倍、更优选高出100倍、最优选高出至少1000倍，则认为它是特异性的。本领域熟知如何制造抗体和选择具有给定特异性的抗体。

在本发明的一个实施方式中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架是单特异性的。

单特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或单特异性抗肾上腺髓质素抗体片段或单特异性抗ADM非Ig支架意指所述抗体或抗体片段或非Ig支架结合至靶标ADM内涵盖至少5个氨基酸的一个特定区域。单特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或单特异性抗肾上腺髓质素抗体片段或单特异性抗ADM非Ig支架是都对相同抗原具有亲和力的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架。单克隆抗体是单特异性的，但单特异性抗体还可以通过除了由普通的生殖细胞产生它们以外的其他手段产生。

所述结合至ADM的抗ADM抗体或抗体片段或结合至ADM的非Ig支架可以是结合至ADM的非中和性抗ADM抗体或抗体片段或者结合至ADM的非Ig支架。

在一个具体实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是非中和性抗体、片段或非Ig支架。中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了接近100％，阻断了至少超过90％，优选阻断了至少超过95％。

相比之下，非中和性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了少于100％，优选阻断了少于95％，优选阻断了少于90％，更优选阻断了少于80％，甚至更优选阻断了少于50％。这意味着ADM的生物活性降低了少于100％、95％以下、90％以下、80％以下、50％以下。这意味着与非中和性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架结合的ADM的剩余生物活性将超过0％，优选超过5％，优选超过10％，更优选超过20％，更优选超过50％。

在这个背景下，作为具有“非中和性抗ADM活性”的抗体或抗体片段或非Ig支架，这里为简单起见统称为“非中和性”抗ADM抗体、抗体片段或非Ig支架并且例如将ADM的生物活性阻断了少于80％的分子定义为

-结合ADM的一个或多个分子，所述分子在添加到表达由CRLR(降钙素受体样受体)和RAMP3(受体活性修饰蛋白3)构成的功能人重组ADM受体的真核细胞系培养物后，减少了通过平行添加的人合成ADM肽的作用由所述细胞系产生的cAMP的量，其中所述添加的人合成ADM的添加量在不存在待分析的非中和性抗体时导致cAMP合成的半最大刺激，其中即使当结合至待分析的ADM的非中和性分子的添加量是为了获得用待分析的非中和性抗体可获得的cAMP合成的最大减少所需的量的10倍以上时，通过所述分子结合至ADM而引起的cAMP减少也发生到不超过80％的程度。

同样的定义适用于其他范围；95％、90％、50％等。

根据本发明的抗体或片段是包括基本上由特异性结合抗原的免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数个免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链的长度通常为约25Kd或214个氨基酸。

全长免疫球蛋白重链的长度通常为约50Kd或446个氨基酸。轻链由NH₂末端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和COOH末端的κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其它恒定区基因之一编码。

抗体的基本结构单元通常是由两对相同的免疫球蛋白链组成的四聚体，每一对具有一个轻链和一个重链。在每一对中，轻链和重链可变区结合至抗原，恒定区介导效应子功能。免疫球蛋白还以多种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')₂以及双功能杂合抗体和单链(例如，Lanzavecchia等,1987.《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)17:105；Huston 等,1988.《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),85:5879-5883；Bird等, 1988.《科学》(Science)242:423-426；Hood等,1984,《免疫学》(Immunology),Beniamin, N.Y.,第2版；Hunkapiller和Hood 1986.《自然》(Nature)323:15-16)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括间杂三个高变区，也称为互补决定区(CDR)的框架区(参见《具有免疫学意义 的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),E.Kabat等, 1983,美国卫生与公众服务部)。如上所述，CDR主要负责与抗原的表位结合。免疫复合物是特异性结合抗原的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或功能性抗体片段。

嵌合抗体是通常通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建其轻链和重链基因的抗体。举例来说，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变片段可以连接到人类恒定区段，如κ和γ1或γ3。在一个实例中，治疗性嵌合抗体因此是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合域和来自人抗体的恒定或效应域构成的杂合蛋白，也可以使用其它哺乳动物物种，或者可以通过分子技术产生可变区。制备嵌合抗体的方法是本领域众所周知的，例如参见美国专利第5,807,715号。“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方式中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但如果它们存在，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本同一，即具有至少约85-90％，如约95％以上的同一性。因此，人源化免疫球蛋白中可能除了CDR以外的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本同一。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合至相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有有限数量的取自供体框架的氨基酸替换。人源化或其它单克隆抗体可以具有额外的保守氨基酸替换，所述替换对抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性保守替换为诸如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn，gln；ser、thr；lys、arg；以及phe、tyr。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(例如，参见美国专利第5,585,089号)。人抗体是其中轻链和重链基因来源于人的抗体。可以使用本领域已知的方法产生人抗体。可以通过使分泌目标抗体的人B细胞永生化来产生人抗体。举例来说，可以通过EBV感染或通过将人B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三瘤细胞来实现永生化。人抗体还可以通过噬菌体呈现方法产生(参见例如WO91/17271；WO92/001047；WO92/20791)，或选自人组合单克隆抗体文库(参见Morphosys网站)。人抗体还可以通过使用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如，参见WO93/12227；WO91/10741)。

因此，抗ADM抗体可以具有本领域已知的形式。实例为人抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在一个优选实施方式中，根据本发明的抗体是重组产生的抗体，例如典型全长免疫球蛋白IgG或至少含有重链和/或轻链的F可变域的抗体片段，例如化学偶联抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微型抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体，例如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚形成，例如通过dHLX结构域二聚，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')₂片段、scFv片段、多聚多价或/和多特异性scFv片段、二价和/或双特异性双体抗体、

(双特异性T细胞衔接子)、三功能抗体、多价抗体，例如来自与G不同的类别；单域抗体，例如来自骆驼或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体等等。

除了抗ADM抗体以外，其他生物聚合物支架在本领域中众所周知可复合靶分子并且已经用于产生高靶标特异性生物聚合物。实例为适体、镜像异构体、抗运载蛋白和芋螺毒素。有关抗体形式的说明，请参见图1a、1b和1c。

在一个优选实施方式中，抗ADM抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)₂片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段和其生物利用度优化缀合物，如PEG化片段。最优选形式之一为scFab形式。

非Ig支架可以是蛋白质支架并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig支架可以选自基于四连蛋白的非Ig支架(例如描述于US 2010/0028995)、纤连蛋白支架(例如描述于EP 1 266 025)、基于脂质运载蛋白的支架(例如描述于WO 2011/ 154420)；泛素支架(例如描述于WO 2011/073214)、转铁蛋白支架(例如描述于US 2004/ 0023334)、蛋白A支架(例如描述于EP 2 231 860)、基于锚蛋白重复单元的支架(例如描述于WO 2010/060748)、微生物蛋白(优选形成半胱氨酸结的微生物蛋白)支架(例如描述于EP 2314308)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如描述于WO 2011/023685)、基于EGFR-A结构域的支架(例如描述于WO 2005/040229)和基于Kunitz结构域的支架(例如描述于EP 1 941 867)。

在本发明的一个实施方式中，根据本发明的抗ADM抗体可以如实施例1所概述通过合成ADM片段作为抗原来产生。此后，使用下文所述的方法或本领域已知的其它方法鉴定所述片段的结合剂。

鼠抗体人源化可以根据以下程序进行：

对于鼠源抗体的人源化，分析抗体序列的框架区(FR)与互补决定区(CDR)和抗原的结构相互作用。基于结构模型，选择适当的人源FR，并且将鼠CDR序列移植到人FR中。可以在CDR或FR的氨基酸序列中引入变化以恢复因FR序列的物种转换而被消除的结构相互作用。这种恢复结构相互作用可以通过使用噬菌体呈现文库的随机方法或通过分子模型指导的定向方法来实现(Almagro和Fransson2008.抗体的人源化(Humanization of antibody).《生物科学前沿》(Front Biosci.)2008年1月1日:13:1619-33)。

在一个优选实施方式中，ADM抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)₂片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段和其生物利用度优化缀合物，如PEG化片段。最优选形式之一为scFab形式。

在另一个优选实施方式中，抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是全长抗体、抗体片段或非Ig支架。

在一个优选实施方式中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架针对并且可以结合至ADM中所含的长度为至少5个氨基酸的表位。

在一个更优选实施方式中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架针对并且可以结合至ADM中所含的长度为至少4个氨基酸的表位。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了结合肾上腺髓质素的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，以用于治疗或预防患者休克，其中所述抗体或片段或支架不是ADM结合蛋白1(补体因子H)。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了结合肾上腺髓质素的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig支架，以用于治疗或预防患者休克，其中所述抗体或片段或支架结合成熟人ADM的氨基酸1-21序列：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID No.:14内优选至少4个或至少5个氨基酸的区域。

在本发明的一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架结合至位于肾上腺髓质素N端部分(氨基酸1-21)中的ADM区域或表位。

在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至肾上腺髓质素的氨基酸1-14：YRQSMNNFQGLRSF(SEQ ID No.:25)内的区域或表位，意指肾上腺髓质素的N端部分(氨基酸1-14)。

在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至肾上腺髓质素的氨基酸1-10：YRQSMNNFQG(SEQ ID No.:26)内的区域或表位；意指肾上腺髓质素的N端部分(氨基酸1-10)。

在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至肾上腺髓质素的氨基酸1-6：YRQSMN(SEQ ID No.:27)内的区域或表位；意指肾上腺髓质素的N端部分(氨基酸1-6)。如上所述，所述区域或表位优选包含至少4个或至少5个氨基酸长度。

在另一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至肾上腺髓质素的N端末端(氨基酸1)。N端末端意指分别SEQ ID No.20、14或23的氨基酸1，即“Y”，对于结合是强制性的。抗体或片段或支架将既不结合N端延伸或N端修饰的肾上腺髓质素，又不结合N端降解的肾上腺髓质素。这意味着在另一个优选实施方式中，如果ADM的N端末端是游离的，则所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架仅结合成熟ADM序列内的区域。在所述实施方式中，如果所述序列例如包含在pro-ADM内，则抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或非Ig支架不结合成熟ADM序列内的区域。

为了清楚起见，ADM的特定区域的括号中的数字如“N端部分(氨基酸1-21)”被本领域技术人员理解为ADM的N端部分由成熟ADM序列的氨基酸1-21组成。

在根据本发明的另一个具体实施方式中，本文提供的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架不结合ADM的C端部分，即ADM的氨基酸43-52：PRSKISPQGY-NH₂(SEQ IDNo.:24)。

表位也称为抗原决定子，是抗原中被免疫***，具体来说被抗体识别的部分。举例来说，表位是抗体所结合的特定抗原片段。与表位结合的抗体部分称为互补位。蛋白质抗原的表位根据其结构和与互补位的相互作用分为两类，即构象表位和线性表位。

构象表位和线性表位基于表位采用的3D构象与互补位相互作用，这由相关表位残基的表面特征和其他抗原区段的形状或三级结构决定。构象表位由不连续氨基酸残基相互作用所采用的3D构象形成。线性或连续表位是抗体通过其线性氨基酸序列或一级结构识别并由连续氨基酸残基相互作用所采用的3D构象形成的表位。

在一个具体实施方式中，优选使用根据本发明的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗ADM抗体或所述抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架导致血清、血液、血浆中的ADM水平或ADM免疫反应性增加至少10％，优选至少50％，更优选>50％，最优选>100％。

在一个具体实施方式中，优选使用根据本发明的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中所述抗ADM抗体或所述抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架为ADM稳定性抗体或ADM稳定性抗体片段或ADM稳定性非Ig支架，它使血清、血液、血浆中的肾上腺髓质素半衰期(t_1/2；半保留时间)增加至少10％，优选至少50％，更优选>50％，最优选>100％。

可以分别在不存在和存在ADM稳定性抗体或ADM稳定性抗体片段或ADM稳定性非Ig支架的情况下使用免疫测定法定量ADM来测定人血清、血液或血浆中的ADM半衰期(半保留时间)。

可以进行以下步骤：

-可以分别在不存在和存在ADM稳定性抗体或肾上腺髓质素稳定性抗体片段或肾上腺髓质素稳定性非Ig支架的情况下将ADM稀释在人柠檬酸盐血浆中，并且可以在24℃温育。

-在选定时间点(例如，在24小时内)取出等分试样，并且可以通过在-20℃下冷冻来停止所述等分试样中的ADM降解。

-如果所选测定法不受稳定性抗体影响，则可以通过hADM免疫测定法直接测定ADM的数量。替代地，可以用变性剂(如HCl)处理等分试样，在清除样品后(例如通过离心)，可以中和pH，并通过ADM免疫测定法进行ADM定量。替代地，非免疫测定技术(例如RP-HPLC)可以用于ADM定量。

-针对分别在不存在和存在ADM稳定性抗体或肾上腺髓质素稳定性抗体片段或肾上腺髓质素稳定性非Ig支架的情况下温育的ADM计算ADM半衰期。

-针对稳定ADM计算半衰期增加，与已经在不存在ADM稳定性抗体或肾上腺髓质素稳定性抗体片段或肾上腺髓质素稳定性非Ig支架的情况下温育的ADM相比较。

ADM半衰期增为两倍是半衰期增加100％。

半衰期(半保留时间)定义为特定化学品或药物在特定体液或血液中的浓度降至其基线浓度的一半经过的时间段。

可用于测定血清、血液、血浆中的肾上腺髓质素半衰期(半保留时间)的测定法描述于实施例3中。

在一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架是非中和性抗体、片段或支架。中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了接近100％、阻断了至少超过90％、优选阻断了至少超过95％。换言之，这意味着所述非中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了少于100％，优选少于95％，优选少于90％。在所述非中和性抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了少于95％的一个实施方式中，将ADM的生物活性阻断了超过95％的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架在所述实施方式的范围之外。这意味着在一个实施方式中，生物活性降低了95％以下，优选90％以下，更优选80％以下，更优选50％以下。

在本发明的一个实施方式中，非中和性抗体是结合至成熟人ADM的氨基酸1-21序列(SEQ ID No.:14)内至少5个氨基酸的区域的抗体，或结合至成熟鼠ADM的氨基酸1-19序列(SEQ ID No.:17)内至少5个氨基酸的区域的抗体。

在本发明的另一个优选实施方式中，非中和性抗体是结合至成熟人ADM的氨基酸1-21序列(SEQ ID No.:14)内至少4个氨基酸的区域的抗体，或结合至成熟鼠ADM的氨基酸1-19序列(SEQ ID No.:17)内至少5个氨基酸的区域的抗体。

在根据本发明的一个具体实施方式中，使用非中和性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或ADM非Ig支架，其中所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段将ADM生物活性阻断了少于(基线值的)80％，优选少于50％。应当理解，即使在抗体、片段或支架的浓度过量(意指抗体、片段或支架相对于ADM过量)时，所述ADM生物活性的有限阻断(意指生物活性的降低)也会发生。在所述具体实施方式中，所述有限阻断是ADM结合剂本身的固有特性。这意味着所述抗体、片段或支架分别具有80％或50％的最大抑制。在一个优选实施方式中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将抗ADM的生物活性阻断/降低了至少5％。上述意味着分别仍然存在大约20％或50％甚至95％残余ADM生物活性。

因此，根据本发明，所提供的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段和抗ADM非Ig支架不中和相应的ADM生物活性。

生物活性定义为在体内或体外(例如在测定中)物质与活生物体或组织或器官或功能单元相互作用后对其产生的影响。在ADM生物活性的情况下，这可能是ADM在人重组ADM受体cAMP功能测定中的作用。因此，根据本发明，经由ADM受体cAMP功能测定来定义生物活性。可以进行以下步骤以测定ADM在这种测定中的生物活性：

-在所述人重组ADM受体cAMP功能测定中用ADM进行剂量反应曲线。

-可以计算半最大cAMP刺激的ADM浓度。

-在恒定半最大cAMP刺激的ADM浓度下，分别通过ADM稳定性抗体或ADM稳定性抗体片段或ADM稳定性非Ig支架进行剂量反应曲线(直至100μg/ml最终浓度)。

所述ADM生物测定中50％最大抑制意指所述抗ADM抗体或所述抗ADM抗体片段或所述抗ADM非Ig支架分别将ADM的生物活性阻断了基线值的50％。所述ADM生物测定中80％最大抑制意指所述抗ADM抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗肾上腺髓质素非Ig支架分别将ADM的生物活性阻断了基线值的80％。这意味着对ADM生物活性的阻断不超过80％。这意味着仍然存在大约20％残余ADM生物活性。

然而，通过本说明书和在上述背景下，与本文公开的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段和抗ADM非Ig支架相关的表述“阻断ADM的生物活性”应当理解为仅将ADM的生物活性从100％最多降到20％剩余ADM生物活性，优选将ADM生物活性从100％降到50％剩余ADM生物活性；但在任何情况下，ADM生物活性都可以如上文所详述来测定。

可以根据实施例2在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)中测定ADM的生物活性。

在一个优选实施方式中，调节性抗ADM抗体或调节性抗ADM抗体片段或调节性抗ADM非Ig支架用于治疗或预防患者休克。

“调节性”抗ADM抗体或调节性抗ADM抗体片段或调节性抗ADM非Ig支架是使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t_1/2半保留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选>50％、最优选>100％并且将ADM的生物活性阻断了少于80％、优选少于50％的抗体或抗体片段或非Ig支架，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架将ADM的生物活性阻断了至少5％。这些与半衰期和生物活性阻断相关的值必须结合为了测定这些值的前述测定法来理解。这意味着对ADM生物活性阻断分别不超过80％或不超过50％。

这种调节性抗ADM抗体或调节性抗ADM抗体片段或调节性抗ADM非Ig支架提供了便于施用的剂量调整的优点。部分阻断或部分降低ADM生物活性和增加体内半衰期(增加ADM生物活性)的组合有益地简化了抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架给药。在过量内源性ADM(最大刺激、脓毒症晚期、休克、低动力期)的情况下，活性降低作用是抗体或片段或支架的主要影响，从而限制了ADM的(负面)作用。在低或正常内源ADM浓度的情况下，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架的生物学作用是降低(通过部分阻断)和增加(通过增加ADM半衰期)的组合。因此，非中和性和调节性抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架如同ADM生物活性缓冲剂那样起作用，以便将ADM的生物活性保持在一定的生理范围内。

在本发明的一个具体实施方式中，抗体是单克隆抗体或其片段。在本发明的一个实施方式中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段是人或人源化抗体或从其衍生。在一个具体实施方式中，将一个或多个(鼠)CDR移植到人抗体或抗体片段中。

本发明的主题在一方面为结合ADM的人或人源化CDR移植抗体或其抗体片段，其中所述人或人源化CDR移植抗体或其抗体片段包含抗体重链(H链)，所述抗体重链包含：

GYTFSRYW(SEQ ID No.:1)，

ILPGSGST(SEQ ID No.:2)，和/或

TEGYEYDGFDY(SEQ ID No.:3)

和/或还包含抗体轻链(L链)，所述抗体轻链包含：

QSIVYSNGNTY(SEQ ID No.:4)，

RVS(不作为序列表的一部分)，和/或

FQGSHIPYT(SEQ ID No.:5)。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明的主题是结合ADM的人或人源化单克隆抗体或结合ADM的其抗体片段，其中重链包含至少一个选自以下的CDR：

GYTFSRYW(SEQ ID No.:1)，

ILPGSGST(SEQ ID No.:2)，

TEGYEYDGFDY(SEQ ID No.:3)

并且其中所述轻链包含至少一个选自以下的CDR：

QSIVYSNGNTY(SEQ ID No.:4),

RVS(不作为序列表的一部分),

FQGSHIPYT(SEQ ID No.:5)。

在本发明的一个更具体实施方式中，本发明的主题是结合ADM的人单克隆抗体或结合ADM的其抗体片段，其中重链包含以下序列：

GYTFSRYW(SEQ ID No.:1)，

ILPGSGST(SEQ ID No.:2)，

TEGYEYDGFDY(SEQ ID No.:3)

并且其中所述轻链包含以下序列：

QSIVYSNGNTY(SEQ ID No.:4)，

RVS(不作为序列表的一部分)，

FQGSHIPYT(SEQ ID No.:5)。

在一个非常具体的实施方式中，抗ADM抗体具有选自以下的序列：SEQ ID No.6、7、8、9、10、11、12、13、32和33。

根据本发明的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架表现出对人ADM的亲和力，使得亲和常数大于10^-7M，优选10^-8M，优选亲和力大于10^-9M，最优选高于10^-10M。本领域技术人员知道可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低亲和力，并且这种措施不会导致超出本发明的范围。可以根据如实施例1所述的方法测定亲和常数。

本发明的主题是一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的结合ADM的人或人源化单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：

SEQ ID NO:6(AM-VH-C)

SEQ ID NO:7(AM-VH1)

SEQ ID NO:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID NO:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

SEQ ID NO:11(AM-VL-C)

SEQ ID NO:12(AM-VL1)

SEQ ID NO:13(AM-VL2-E40)

本发明的另一个实施方式涉及一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的结合ADM的人或人源化单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含以下序列作为重链：

SEQ ID NO:32

并且包含以下序列作为轻链：

SEQ ID NO:33

在本发明的一个具体实施方式中，抗体包含以下序列或与它具有>95％、优选>98％、优选>99％同一性的序列作为重链：

SEQ ID NO:32

并且包含以下序列或与它具有>95％、优选>98％、优选>99％同一性的序列作为轻链：

SEQ ID NO:33

其中所述重链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:1

GYTFSRYW

CDR2：SEQ ID NO:2

ILPGSGST

CDR3：SEQ ID NO:3

TEGYEYDGFDY

并且其中所述轻链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY

CDR2：

RVS

CDR3：SEQ ID NO:5

FQGSHIPYT。

这意味着在本发明的一个实施方式中，CDR不表现出任何序列变化。上述序列的任何变化都在所述实施方式中的CDR以外。

为了评价两个氨基酸序列之间的同一性，进行了成对比对。同一性定义了比对中直接匹配的氨基酸的百分比。

在本发明的实施方式中，用于治疗或预防患者休克的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段可以以至少0.5mg/kg体重，特别是至少1.0mg/kg体重，更特别是1.0至20.0mg/kg体重，例如2.0至10mg/kg体重、2.0至8.0mg/kg体重或2.0至5.0mg/kg体重的剂量施用。

术语“药物制剂”意指药物成分与至少一种药学上可接受的赋形剂的组合，其形式使得其中所含的药物成分的生物活性有效，并且不含对会施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。术语“药物成分”意指可以任选地与药学上可接受的赋形剂组合以提供药物制剂或剂型的治疗组合物。

本发明的主题是一种用于治疗或预防患者休克的药物制剂，所述药物制剂包含根据本发明的抗体或片段或支架。

本发明的主题是一种用于治疗或预防患者休克的药物制剂，所述药物制剂包含根据本发明的抗体或片段或支架，其中所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。

本发明的主题是一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的药物制剂，其中所述药物制剂为溶液，优选为即用型溶液。

本发明的主题是一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的药物制剂，其中所述药物制剂呈冻干状态。

本发明的主题是一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内施用。

本发明的主题是一种根据本发明的用于干预和治疗患者充血的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内施用。

本发明的主题是一种根据本发明的用于干预和治疗患者充血的药物制剂，其中所述药物制剂经由输注施用。

本发明的主题是一种根据本发明的用于治疗或预防患者休克的药物制剂，其中所述药物制剂经全身施用。

在上述背景下，以下连续编号的实施方式提供了本发明的其它具体方面：

1.一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·向所述患者施用抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，

其中如果所述测定的DPP3水平低于预定阈值，则对所述患者进行治疗，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

2.根据实施方式1所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。

3.根据实施方式1和2所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中：

·在心源性休克的情况下，所述患者可能已经患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述患者患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者

·在低血容量性休克的情况下，所述患者可能已经患有出血性疾病，包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂情形下的自发性出血，或者非出血性疾病，包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/无感失水(例如烧伤、中暑)、或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻情形下的第三间隙体液丧失，或者

·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已经患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者

·在分布性休克的情况下，所述患者可能患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。

4.根据实施方式1至3所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述受试者的体液样品中DPP3的所述预定阈值在20和120ng/mL之间，更优选在30和80ng/mL之间，甚至更优选在40和60ng/mL之间，最优选所述阈值为50ng/mL。

5.根据实施方式1至4所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中测定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并且与预定阈值进行比较。

6.根据实施方式1至5所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至DPP3的捕获结合剂接触来测定DPP3水平。

7.根据实施方式1至6所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

8.根据实施方式1至7所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂是抗体。

9.根据实施方式1至8所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂被固定在表面上。

10.根据实施方式1至9所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述分离步骤是从所捕获的DPP3除去所述样品中未与所述捕获结合剂结合的成分的洗涤步骤。

11.根据实施方式1至10所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性的方法包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3底物添加到所述分离的DPP3，

·通过测量和定量DPP3底物的转化来定量所述DPP3活性。

12.根据实施方式1至11所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中通过选自以下的方法来检测DPP3底物转化：产荧光底物(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)的荧光、发色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(PromegaProtease-Glo^TM测定法)、质谱法、HPLC/FPLC(反相色谱法、尺寸排阻色谱法)、薄层色谱法、毛细管区带电泳、凝胶电泳后进行活性染色(固定的活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

13.根据实施方式1至12所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中所述底物可以选自：血管紧张肽II、III和IV、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、内啡肽1和2、valorphin、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽为Arg-Arg。

14.根据实施方式1至13所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中所述底物可以选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽为Arg-Arg。

15.根据实施方式1至14所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的特征还在于具有高于阈值的ADM-NH₂水平。

16.根据实施方式15所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品中ADM-NH₂的所述阈值在40和100pg/mL之间，更优选在50和90pg/mL之间，甚至更优选在60和80pg/mL之间，最优选所述阈值为70pg/mL。

17.根据实施方式15和16所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至ADM-NH₂的捕获结合剂接触来测定ADM-NH₂水平。

18.根据实施方式1至17所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。

19.根据实施方式1至18所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中组合测定DPP3水平和ADM-NH₂水平。

20.根据实施方式19所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中同时测定DPP3水平和ADM-NH₂水平。

21.根据实施方式19和20所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中使用即时医护装置来测定所述DPP3水平和所述ADM-NH₂水平。

22.根据实施方式21所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述即时医护装置是微流体装置。

23.根据实施方式1至22所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至ADM的N端末端(氨基酸1)。

24.根据实施方式1至23所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体、抗体片段或非Ig支架不结合至ADM的C端部分，所述ADM的C端部分具有ADM的氨基酸43-52序列：PRSKISPQGY-NH₂(SEQ IDNO:24)。

25.根据实施方式1至24所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段是结合至ADM的单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:1

GYTFSRYW

CDR2：SEQ ID NO:2

ILPGSGST

CDR3：SEQ ID NO:3

TEGYEYDGFDY

并且其中轻链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY

CDR2：

RVS

CDR3：SEQ ID NO:5

FQGSHIPYT。

26.根据实施方式1至25所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列作为VH区：

SEQ ID NO:6(AM-VH-C)

SEQ ID NO:7(AM-VH1)

SEQ ID NO:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID NO:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

并且包含选自以下序列的序列作为VL区：

SEQ ID NO:11(AM-VL-C)

SEQ ID NO:12(AM-VL1)

SEQ ID NO:13(AM-VL2-E40)

27.根据实施方式1至25所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为重链：

SEQ ID NO:32

并且包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为轻链：

SEQ ID NO:33

附图说明

图1a：

抗体形式的示例——Fv和scFv变体。

图1b：

抗体形式的示例——异源融合物和双功能抗体。

图1c：

抗体形式的示例——二价抗体和双特异性抗体。

图2：

a：人ADM的剂量反应曲线。将最大cAMP刺激调整到100％激活。

b：存在5.63nM hADM时人ADM 22-52(ADM受体拮抗剂)的剂量/抑制曲线。

c：存在5.63nM hADM时CT-H的剂量/抑制曲线。

d：存在5.63nM hADM时MR-H的剂量/抑制曲线。

e：存在5.63nM hADM时NT-H的剂量/抑制曲线。

f：小鼠ADM的剂量反应曲线。将最大cAMP刺激调整到100％激活。

g：存在0.67nM mADM时人ADM 22-52(ADM受体拮抗剂)的剂量/抑制曲线。

h：存在0.67nM mADM时CT-M的剂量/抑制曲线。

i：存在0.67nM mADM时MR-M的剂量/抑制曲线。

j：存在0.67nM mADM时NT-M的剂量/抑制曲线。

k：示出了F(ab)2NT-M和Fab NT-M对ADM的抑制作用。

l：示出了F(ab)2NT-M和Fab NT-M对ADM的抑制作用。

图3：

该图示出了典型的hADM剂量/信号曲线。以及存在100μg/mL抗体NT-H时的hADM剂量信号曲线。

图4：

该图示出了不存在和存在NT-H抗体时hADM在人血浆(柠檬酸盐)中的稳定性。

图5：

Fab与同源人框架序列的比对。

图6：NT-H以不同的剂量施用长达60天之后，健康人受试者的ADM浓度。

图7：卡普兰-梅尔存活率图与低(<40.5ng/mL)和高(≥40.5ng/mL)DPP3浓度的关系。(A)脓毒症患者的7天存活率与DPP3血浆浓度的关系；(B)心源性休克患者的7天存活率与DPP3血浆浓度的关系；(C)脓毒性休克患者的7天存活率与DPP3血浆浓度的关系。

图8：所有患者的卡普兰-梅尔存活率图(用安慰剂(Plac)或N端ADM抗体阿德瑞珠单抗(Adz)治疗的患者的14天死亡率)

图9：DPP3<50ng/mL的患者的卡普兰-梅尔存活率图(用安慰剂(Plac)或N端ADM抗体阿德瑞珠单抗(Adz)治疗的患者的14天死亡率)

图10：DPP3>50ng/mL的患者的卡普兰-梅尔存活率图(用安慰剂(Plac)或N端ADM抗体阿德瑞珠单抗(Adz)治疗的患者的14天死亡率)

具体实施方式

实施例

实施例1-抗体的产生及其亲和常数的测定

产生了若干种人抗体和鼠抗体，并测定它们的亲合常数(参见表1和2)。应当强调的是，根据本发明的实施例部分的抗体、抗体片段和非Ig支架结合至ADM，因此应当被视为抗ADM抗体/抗体片段/非Ig支架。

免疫用肽/缀合物：

合成了免疫用肽，参见表1，(JPT Technologies，德国柏林)，其中额外的N端半胱氨酸(如果所选ADM序列内不存在半胱氨酸)残基用于使所述肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合。通过使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science，德国波恩)将肽共价连接到BSA。根据Perbio的手册进行偶联程序。

小鼠单克隆抗体产生：

将Balb/c小鼠在第0天和第14天用100μg肽-BSA-缀合物(乳化在100μl完全弗氏佐剂中)并且在第21天和第28天用50μg(在100μl不完全弗氏佐剂中)进行免疫接种。在进行融合实验之前三天，动物接受溶解在100μl盐水中的50μg缀合物，作为一次腹膜内注射和一次静脉内注射给与。在37℃下用1ml 50％聚乙二醇使经免疫接种小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞融合30秒。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充有20％胎牛血清和HAT补充剂的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。两周后，将HAT培养基更换为HT培养基进行三次传代，然后返回正常细胞培养基。融合之后三周，对细胞培养物上清液进行抗原特异性IgG抗体的初步筛检。将测试呈阳性的微培养物转移到24孔板中进行繁殖。重新测试之后，使用限制稀释技术克隆和重新克隆所选培养物并测定同种型(另见Lane,R.D.1985.《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Meth.)81:223-228；Ziegler等, 1996.《激素与代谢研究》(Horm.Metab.Res.)28:11-15)。

通过标准抗体产生方法(Marx等,1997.《单克隆抗体产生》(Monoclonal Antibody Production),ATLA 25,121)产生抗体，并通过蛋白A进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度为>95％。

人抗体：

根据以下程序通过噬菌体呈现来产生人抗体：使用人天然抗体基因文库HAL7/8分离针对肾上腺髓质素肽的重组单链F可变域(scFv)。筛检抗体基因文库，所用淘选策略包括使用含有通过两个不同的间隔物连接至肾上腺髓质素肽序列的生物素标签的肽。使用非特异性结合抗原和链霉亲和素结合抗原的淘选轮的混合用于最小化非特异性结合剂的背景。第三轮淘选的洗脱噬菌体已用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌(E.coli)菌株。这些克隆菌株的培养上清液已直接用于抗原ELISA测试(另见Hust等,2011.《生物技术杂志》 (Journal of Biotechnology)152,159-170；Schütte等,2009.PLoS One 4,e6625)。已经基于针对抗原的阳性ELISA信号和针对链霉亲和素包被的微量滴定板的阴性选择了阳性克隆。为了进一步表征，已经将scFv开放阅读框克隆到表达质粒pOPE107中(Hust等,《生物技 术杂志》(J.Biotechn.)2011)，通过固定金属离子亲和色谱法从培养物上清液中捕获并通过尺寸排阻色谱法进行纯化。

亲合常数：为了测定抗体对ADM的亲和力，使用Biacore 2000***(GE HealthcareEurope有限公司，德国弗莱堡)通过无标记表面等离子体共振测定ADM与固定抗体的结合动力学。根据制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，使用以高密度共价偶联至CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体进行抗体的可逆固定(Lorenz等,2011.《抗微生物剂和 化学疗法》55(1):165-173)。

分别产生了针对下述人和鼠ADM的ADM区域的单克隆抗体。下表示出了其它实验所用的所获得的抗体的选择。基于目标区域进行选择：

表1：免疫肽

以下是另外获得的单克隆抗体的列表：

表2：

通过酶消化产生抗体片段：通过对鼠全长抗体NT-M进行酶消化来产生Fab和F(ab)₂片段。使用a)基于胃蛋白酶的F(ab)₂制备试剂盒(Pierce 44988)和b)基于木瓜蛋白酶的Fab制备试剂盒(Pierce 44985)消化抗体NT-M。根据供应商提供的说明书来进行片段化程序。在F(ab)₂片段化的情况下，在37℃进行消化8小时。Fab片段化消化分别进行16小时。

Fab产生和纯化程序：通过用0.5ml消化缓冲液洗涤树脂并且以5000×g将柱离心1分钟使固定的木瓜蛋白酶平衡。之后丢弃缓冲液。通过除去储存溶液并用消化缓冲液对它进行洗涤，之后将它每次以1000×g离心2分钟来准备脱盐柱。将0.5ml所准备的IgG样品添加到含有平衡的固定的木瓜蛋白酶的离心柱管中。消化反应的温育时间在桌上型振荡器上在37℃进行16小时。将柱以5000×g离心1分钟以分离消化物与固定的木瓜蛋白酶。之后用0.5ml PBS洗涤树脂并且以5000×g离心1分钟。将洗涤级分添加到总样品体积为1.0ml的消化抗体中。将NAb蛋白A柱在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡。将柱离心1分钟以除去储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并且通过添加2ml PBS使其平衡，再次离心1分钟并丢弃流经液。将样品施加到柱上并通过倒置重新悬浮。在室温下进行温育，翻转混合10分钟。将柱离心1分钟，保留含Fab片段的流经液。(参考文献：Coulter和Harris1983.《免疫学方法杂志》 59,199-203.；Lindner等,2010.《癌症研究》(Cancer Res.)70,277-87；Kaufmann等, 2010.PNAS.107,18950-5.；Chen等,2010.PNAS.107,14727-32；Uysal等,2009《实验医学杂 志》(J.Exp.Med.)206,449-62；Thomas等,2009.《实验医学杂志》206,1913-27；Kong等,2009 《细胞生物学杂志》(J.CellBiol.)185,1275-840)。

F(ab')₂片段的产生和纯化程序：通过用0.5ml消化缓冲液洗涤树脂并且以5000×g将柱离心1分钟使固定的胃蛋白酶平衡。之后丢弃缓冲液。通过除去储存溶液并用消化缓冲液对它进行洗涤，之后将它每次以1000×g离心2分钟来准备脱盐柱。将0.5ml所准备的IgG样品添加到含有平衡的固定的胃蛋白酶的离心柱管中。消化反应的温育时间在桌上型振荡器上在37℃进行16小时。将柱以5000×g离心1分钟以分离消化物与固定的木瓜蛋白酶。之后用0.5mL PBS洗涤树脂并且以5000×g离心1分钟。将洗涤级分添加到总样品体积为1.0ml的消化抗体中。将NAb蛋白A柱在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡。将柱离心1分钟以除去储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并且通过添加2ml PBS使其平衡，再次离心1分钟并丢弃流经液。将样品施加到柱上并通过倒置重新悬浮。在室温下进行温育，翻转混合10分钟。将柱离心1分钟，保留含Fab片段的流经液。(参考文献：Mariani等,1991.《分子免疫学》 (Mol.Immunol.)28:69-77；Beale1987.《实验和比较免疫学》(Exp Comp Immunol)11:287- 96；Ellerson等,1972.《欧洲生化学会联合会快报》24(3):318-22；Kerbel和Elliot 1983. 《免疫学方法》(Meth Enzymol)93:113-147；Kulkarni等, 985.《癌症免疫学与免疫治疗》 (Cancer Immunol Immunotherapy)19:211-4；Lamovi1986.《免疫学方法》121:652-663； Parham等,1982.《免疫学方法杂志》53:133-73；Raychaudhuri等,1985.《分子免疫学》22 (9):1009-19；Rousseaux等,1980.《分子免疫学》17:469-82；Rousseaux等,1983.《免疫学方 法杂志》64:141-6；Wilson等,1991.《免疫学方法杂志》138:111-9)。

NT-H-抗体片段人源化：通过CDR移植方法将抗体片段人源化(Jones等,1986.《自 然》321,522-525)。

进行以下步骤以实现人源化序列：

总RNA提取：使用Qiagen试剂盒从NT-H杂交瘤提取总RNA。第一轮RT-PCR：使用

OneStep RT-PCR试剂盒(目录号210210)。用对重链和轻链特异的引物组进行RT-PCR。对于各RNA样品，使用覆盖可变区前导序列的简并正向引物混合物建立了12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区中。没有将限制位点工程化到引物中。

反应设置：

OneStep RT-PCR缓冲液5.0μl，dNTP混合物(含有10mM的各dNTP)0.8μl，引物组0.5μl，

OneStep RT-PCR酶混合物0.8μl，模板RNA 2.0μl，不含RNA酶的水补充至20.0μL，总体积20.0μL PCR条件：反转录：50℃，30分钟；初始PCR激活：95℃，15分钟循环：20个循环的94℃、25秒；54℃，30秒；72℃，30秒；最终延伸：72℃，10分钟第二轮半嵌套PCR：在第二轮PCR中进一步扩增来自第一轮反应的RT-PCR产物。使用对抗体可变区特异的半嵌套引物组建立了12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。

反应设置：2×PCR混合物10μl；引物组2μl；第一轮PCR产物8μl；总体积20μl；杂交瘤抗体克隆报告PCR条件：初始变性95℃5分钟；25个循环的95℃25秒、57℃30秒、68℃30秒；最终延伸为10分钟68℃。

PCR完成之后，在琼脂糖凝胶上运作PCR反应样品以观察扩增的DNA片段。在对通过嵌套RT-PCR扩增的超过15个克隆DNA片段进行测序后，克隆了若干个小鼠抗体重链和轻链并显示为正确的。蛋白质序列比对和CDR分析鉴定了一个重链和一个轻链。与同源人框架序列比对之后，所得可变重链人源化序列如下：参见图5。由于可变重链中第26、40和55位上的氨基酸和可变轻链中第40位上的氨基酸对结合特性至关重要，因此它们可以回复到鼠源。下面描绘了所得候选物。(Padlan1991.《分子免疫学》28,489-498；Harris和 Bajorath.1995.《蛋白质科学》(Protein Sci.)4,306-310)。

抗体片段序列(SEQ ID No.:6-13；32和33)的注释：粗体加下划线为按序排列的CDR 1、2、3；斜体的是恒定区；铰链区用粗体字母突出显示；框架点突变具有灰色字母背景。

SEQ ID No.:6(AM-VH-C)

SEQ ID No.:7(AM-VH1)

SEQ ID No.:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID No.:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID No.:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

SEQ ID No.:11(AM-VL-C)

SEQ ID No.:12(AM-VL1)

SEQ ID No.:13(AM-VL2-E40)

SEQ ID NO:32(阿德瑞珠单抗重链)

SEQ ID NO:33(阿德瑞珠单抗轻链)

实施例2-所选抗ADM抗体对抗ADM生物活性的影响

在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)中测试了所选ADM抗体对ADM生物活性的影响。

在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)

中测试靶向人或小鼠肾上腺髓质素的抗体

材料：细胞系CHO-K1，受体肾上腺髓质素(CRLR+RAMP3)，受体登记号细胞株：CRLR：U17473；RAMP3：AJ001016

通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)轻轻冲洗来剥离测试前在不含抗生素的培养基中生长的表达人重组肾上腺髓质素受体的CHO-K1细胞(FAST-027C)，通过离心进行回收并重新悬浮在测定缓冲液(KRH：5mM KCl、1.25mM MgSO₄、124mM NaCl、25mM HEPES、13.3mM葡萄糖、1.25mM KH₂PO₄、1.45mM CaCl₂、0.5g/l BSA)。

剂量反应曲线与参考激动剂(hADM或mADM)平行进行。

拮抗剂测试(96孔)：对于拮抗剂测试，将6μl参考激动剂(人(5.63nM)或小鼠(0.67nM)肾上腺髓质素)与6μl不同拮抗剂稀释度的测试样品或与6μl缓冲液混合。在室温下温育60分钟之后，加入12μl细胞(2,500个细胞/孔)。在室温下将板温育30分钟。加入裂解缓冲液之后，将根据制造商的说明书估算ΔF的百分比，其中使用来自Cis-BioInternational的HTRF试剂盒(目录号62AM2 PEB)hADM 22-52作为参考拮抗剂。

抗体测试cAMP-HTRF测定

在人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)cAMP功能测定中，在存在5.63nM人ADM1-52的情况下，在以下最终抗体浓度下测试了抗h-ADM抗体(NT-H、MR-H、CT-H)的拮抗剂活性：100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml。

在人重组ADM受体(FAST-027C)cAMP功能测定中，在存在0.67nM小鼠ADM 1-50的情况下，在以下最终抗体浓度下测试了抗m-ADM抗体(NT-M、MR-M、CT-M)的拮抗剂活性：100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml。将数据绘成相对于拮抗剂浓度的相对抑制的图(参见图2a至2l)。个别抗体的最大抑制提供在表3中。

表3：bio-ADM活性的最大抑制

抗体	ADM生物活性的最大抑制(ADM-生物测定)(％)
		NT-H	38
MR-H	73
		CT-H	100
NT-M FAB	26
		NT-M FAB2	28
NT-M	45
		MR-M	66
CT-M	100
		非特异性小鼠IgG	0

实施例3-抗ADM抗体对hADM的稳定作用

使用hADM免疫测定法测试人ADM抗体对人ADM的稳定作用。

用于定量人肾上腺髓质素的免疫测定法

所用的技术是基于吖啶酯标记的夹心包被的管的发光免疫测定法。

标记化合物(示踪剂)：将100μg(100μl)CT-H(1mg/ml PBS溶液，pH 7.4，AdrenoMed股份公司，德国)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml乙腈溶液，InVent有限公司，德国)混合(EP0353971)并在室温下温育20分钟。在Bio-

SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories公司，美国)上通过凝胶过滤HPLC纯化标记的CT-H。将纯化的CT-H稀释在(300mmol/L磷酸钾、100mmol/L NaCl、10mmol/L Na-EDTA、5g/L牛血清白蛋白，pH 7.0)中。最终浓度为每200μL约800.000个相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记抗体)。通过使用AutoLumat LB953(Berthold Technologies股份有限公司)测量吖啶酯化学发光。

固相：将聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International股份公司，澳大利亚)用MR-H(AdrenoMed股份公司，德国)(1.5μg MR-H/0.3mL 100mmol/L NaCl，50mmol/L TRIS/HCl，pH 7.8)包被(室温下18小时)。用5％牛血清白蛋白阻断之后，将管用PBS pH 7.4洗涤并真空干燥。

校准：所述测定使用hADM(BACHEM AG,Switzerland)在250mmol/L NaCl、2g/LTriton X-100、50g/L牛血清白蛋白、20片/L蛋白酶抑制剂混合液(Roche Diagnostics AG,Switzerland)中的稀释液进行校准。

hADM免疫测定：将50μl样品(或校准剂)吸取到包被的管中，加入标记的CT-H(200μl)之后，将管在4℃下温育4小时。通过用洗涤溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)除去未结合的示踪剂。

通过使用LB 953来测量管结合的化学发光：图3示出了典型的hADM剂量/信号曲线。以及存在100μg/mL抗体NT-H时的hADM剂量信号曲线。NT-H不影响所述hADM免疫测定。

人肾上腺髓质素的稳定性：将人ADM稀释在人柠檬酸盐血浆(最终浓度10nM)中并在24℃温育。在所选时间点，通过在-20℃下冷冻来停止hADM降解。在不存在和存在NT-H(100μg/ml)的情况下进行温育。通过使用上述hADM免疫测定法定量剩余的hADM。

图4示出了不存在和存在NT-H抗体时hADM在人血浆(柠檬酸盐)中的稳定性。单独hADM的半衰期为7.8小时，而在存在NT-H时，半衰期为18.3小时。(稳定性为2.3倍高)。

实施例4-脓毒症死亡率

a)脓毒症的早期治疗

动物模型：12-15周龄雄性C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，德国)用于所述研究。在轻度异氟醚麻醉下通过手术诱发腹膜炎。在腹膜腔的左上象限(盲肠的正常位置)制造切口。使盲肠外露并在小肠附着处远端用缝合线在盲肠周围铺放紧结扎。用24号针头在盲肠中刺出一个伤口，并通过伤口挤出少量的盲肠内容物。将盲肠放回腹膜腔中并封闭剖腹术部位。最后，将动物放回笼子，自由获取食物和水。皮下给与500μl盐水作为补液。

化合物(NT-M、MR-M、CT-M)的施用和剂量：CLP之后立即对小鼠进行治疗(早期治疗)。CLP是盲肠结扎和穿刺(CLP)的缩写。

研究组：对比测试了三种化合物：载体和对比对照化合物治疗。每一组含有5只小鼠，1天后抽血以进行BUN(血清血尿素氮测试)测定。在4天时间段内跟踪每一组的十只其它小鼠。

治疗组(10μl/g体重)剂量/跟踪：

1NT-M，0.2mg/ml，4天存活率

2MR-M,，0.2mg/ml，4天存活率

3CT-M，0.2mg/ml，4天存活率

4非特异性小鼠IgG，0.2mg/ml，4天存活率

5对照物PBS，10μl/g体重，4天存活率

临床化学：对于肾功能，在基线和CLP后第1天测量血尿素氮(BUN)浓度。在轻度***麻醉下用毛细管从海绵窦获得血液样品。通过使用AU 400Olympus多功能分析仪进行测量。4天死亡率和平均BUN浓度在表4中给出。

表4：4天死亡率和BUN浓度

4天死亡率	存活率(％)	CLP前的BUN(mM)	第1天的BUN(mM)
				PBS	0	8.0	23.2
非特异性小鼠IgG	0	7.9	15.5
				CT-M	10	7.8	13.5
MR-M	30	8.1	24.9
				NT-M	70	8.8	8.2

从表4可见NT-M抗体显著降低了死亡率。当用NT-M抗体治疗时，4天之后，70％的小鼠存活。当用MR-M抗体治疗时，4天之后，30％的动物存活，而当用CT-M抗体治疗时，10％的动物存活。相比之下，当用非特异性小鼠IgG治疗时，4天之后，所有小鼠都死亡。在给小鼠施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的对照组中获得了相同的结果。血尿素氮或BUN测试用于评价肾功能，帮助诊断肾脏疾病，以及监测患有急性或慢性肾功能不全或衰竭的患者。S-BUN测试结果表明NT-M抗体对保护肾脏最有效。

b)脓毒症的晚期治疗

动物模型：12-15周龄雄性C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，德国)用于所述研究。在轻度异氟醚麻醉下通过手术诱发腹膜炎。在腹膜腔的左上象限(盲肠的正常位置)制造切口。使盲肠外露并在小肠附着处远端用缝合线在盲肠周围铺放紧结扎。用24号针头在盲肠中刺出一个伤口，并通过伤口挤出少量的盲肠内容物。将盲肠放回腹膜腔中并封闭剖腹术部位。最后，将动物放回笼子，自由获取食物和水。皮下给与500μl盐水作为补液。

化合物(NT-M FAB2)的施用和剂量：对比测试了NT-M FAB2：载体和对比对照化合物治疗。在CLP后6小时，脓毒症完全发展后进行治疗(晚期治疗)。每一组含有4只小鼠，并且在4天的时间段内进行跟踪。

治疗组(10μl/g体重)剂量/跟踪：

1NT-M，FAB2 0.2mg/ml，4天存活率

2对照非特异性小鼠IgG，0.2mg/ml，4天存活率

3载体：PBS，10μl/g体重，4天存活率

表5：4天死亡率

4天死亡率	存活率(％)
		PBS	0
非特异性小鼠IgG	0
		NT-M FAB2	75

从表5可见NT-M FAB2抗体显著降低了死亡率。当用NT-M FAB2抗体治疗时，4天之后，75％的小鼠存活。相比之下，当用非特异性小鼠IgG治疗时，4天之后，所有小鼠都死亡。在给小鼠施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的对照组中获得了相同的结果。

实施例5-在健康的人中施用NT-H

所述研究在健康男性受试者中作为随机双盲安慰剂对照研究进行，其中在连续3组的每组8名健康男性受试者(每一组中n＝6个活性剂，n＝2个安慰剂)中以静脉内(i.v.)输注形式施用单个递增剂量的NT-H抗体(第1组0.5mg/kg，第2组2mg/kg，第3组8mg/kg)。主要纳入标准是书面知情同意书、年龄18-35岁、同意使用可靠的避孕方式以及BMI介于18和30kg/m²之间。受试者通过在研究单位在1小时内缓慢输注接受单次静脉内剂量的NT-H抗体(0.5mg/kg；2mg/kg；8mg/kg)或安慰剂。4组的基线ADM值没有差异。安慰剂组的中值ADM值为7.1pg/mL，第一治疗组为6.8pg/mL(0.5mg/kg)，第二治疗组为5.5pg/mL(2mg/kg)，第三治疗组为7.1pg/mL(8mg/mL)。结果表明在健康人类个体中施用NT-H抗体之后的前1.5小时内，ADM值迅速增加，然后达到平台期并缓慢下降(图6)。

实施例6-测量DPP3蛋白和DPP3活性的方法

产生抗体和测定DPP3结合能力：产生了若干种鼠抗体，并通过它们在特异性结合测定中结合人DPP3的能力进行筛检(参见表6)。

免疫用肽/缀合物：合成了免疫用DPP3肽，参见表6，(JPT Technologies，德国柏林)，其中额外的N端半胱氨酸(如果所选DPP3序列内不存在半胱氨酸)残基用于使所述肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合。通过使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science，德国波恩)将肽共价连接到BSA。根据Perbio的手册进行偶联程序。通过USBio(United StatesBiological，美国马萨诸塞州塞勒姆市)产生重组GST-hDPP3。

小鼠免疫接种、免疫细胞融合和筛检：Balb/c小鼠在第0天经腹膜内(i.p.)注射84μg GST-hDPP3或100μg DPP3-肽-BSA-缀合物(乳化在TiterMax Gold佐剂中)，在第14天经腹膜内注射84μg或100μg(乳化在完全弗氏佐剂中)，并且在第21天和第28天经腹膜内注射42μg或50μg(在不完全弗氏佐剂中)。在第49天，动物接受静脉内(i.v.)注射溶解在盐水中的42μg GST-hDPP3或50μg DPP3-肽-BSA-缀合物。三天后将小鼠处死，并进行免疫细胞融合。

在37℃下用1ml 50％聚乙二醇使经免疫接种小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞融合30秒。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充有20％胎牛血清和HAT补充剂的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。一周后，将HAT培养基更换为HT培养基进行三次传代，然后返回正常细胞培养基。在融合后两周，初步筛检细胞培养物上清液的重组DPP3结合IgG抗体。因此，将带GST标签的重组hDPP3(USBiologicals，美国塞勒姆市)固定在96孔板(100ng/孔)中，并且与每孔50μl细胞培养物上清液一起在室温下温育2小时。对板进行洗涤之后，加入50μl/孔POD-兔抗小鼠IgG，并在室温下温育1小时。在接下来的洗涤步骤之后，将50μl显色溶液(含3.7mM邻苯二胺的柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液，0.012％H₂O₂)添加到各孔，在室温下温育15分钟，通过加入50μl 4N硫酸停止显色反应。在490mm处检测到吸收。

将阳性测试微培养物转移到24孔板中进行繁殖。重新测试之后，使用限制稀释技术克隆和重新克隆所选培养物，并测定同种型。

小鼠单克隆抗体产生

通过标准抗体产生方法(Marx等,1997)产生针对带GST标签的人DPP3或DPP3肽产生的抗体并通过蛋白A进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度为>90％。

抗体的表征——与hDPP3和/或免疫肽的结合

为了分析不同的抗体和抗体克隆结合DPP3/免疫肽的能力，进行了结合测定：

固相：将带GST标签的重组hDPP3(SEQ ID NO.34)或DPP3肽(免疫肽，SEQ IDNO.35)固定到高结合微量滴定板表面(96孔聚苯乙烯微孔板，Greiner Bio-OneInternational股份公司，澳大利亚，1μg/孔，在偶联缓冲液[50mM Tris，100mM NaCl，pH7.8]中，在室温下1小时)。用5％牛血清白蛋白阻断之后，将微孔板真空干燥。

标记程序(示踪剂)：将100μg(100μl)不同的抗DPP3抗体(检测抗体，1mg/ml PBS溶液，pH 7.4)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml乙腈溶液，InVent有限公司，德国；EP 0 353 971)混合，并且在室温下温育30分钟。在Shodex Protein 5μm KW-803(Showa Denko，日本)上通过凝胶过滤HPLC纯化标记的抗DPP3抗体。将纯化的标记抗体稀释在测定缓冲液(50mmol/l磷酸钾、100mmol/l NaCl、10mmol/l Na₂-EDTA、5g/1牛血清白蛋白、1g/1鼠IgG、1g/1牛IgG、50μmol/l阿吗他定、100μmol/l亮抑酶肽，pH 7.4)中。最终浓度为每200μl约5-7*10⁶个相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记抗体)。通过使用Centro LB960光度计(BertholdTechnologies股份有限公司)来测量吖啶酯化学发光。

hDPP3结合测定：将板装填200μl标记并稀释的检测抗体(示踪剂)，并在2-8℃温育2-4小时。通过用350μl洗涤溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)洗涤4次来除去未结合的示踪剂。通过使用Centro LB 960光度计(Berthold Technologies股份有限公司)来测量孔结合化学发光。

抗体的表征——hDPP3抑制分析

为了分析不同的抗体和抗体克隆的DPP3抑制能力，用已知程序(Jones等,1982)进行了DPP3活性测定。将带GST标签的重组hDPP3稀释在测定缓冲液(含25ng/ml GST-DPP3的50mM Tris-HCl，pH7.5和100μM ZnCb)中，并将200μl的此溶液与10μg相应抗体一起在室温下温育。预温育1小时之后，将产荧光底物Arg-Arg-βNA(20μl，2mM)添加到所述溶液，并使用Twinkle LB 970微孔板荧光计(Berthold Technologies股份有限公司)在37℃监测游离βNA随时间的产生。通过在340nm激发并在410nm测量发射来检测βNA的荧光。计算不同样品的荧光增加的斜率(RFU/min)。将GST-hDPP3在缓冲液对照物下的斜率指定为100％活性。可能的捕获结合剂的抑制能力定义为通过与所述捕获结合剂一起温育引起的GST-hDPP3活性降低，以百分比为单位。

下表示出了所获得的抗体的选择及以相对光单位(RLU)表示的其结合率以及其相对抑制能力(％；表6)。针对下述DPP3区产生的单克隆抗体根据它们结合重组DPP3和/或免疫肽的能力以及它们的抑制潜能进行选择。

针对带GST标签的全长形式的重组hDPP3产生的所有抗体都示出了与带GST标签的固定hDPP3的强结合。针对SEQ ID NO.:35肽产生的抗体也结合至GST-hDPP3。SEQ ID NO.:35抗体还强结合至免疫肽。

表6：针对全长hDPP3或其序列产生的抗体及其以RLU表示的结合hDPP3(SEQ IDNO.:34)或免疫肽(SEQ ID NO.:35)的能力以及对重组GST-hDPP3的最大抑制的列表。

最近已经描述了用于定量DPP3蛋白浓度的发光免疫测定法(DPP3-LIA)以及用于定量DPP3活性的酶捕获活性测定法(DPP3-ECA)的开发(Rehfeld等,2019.JALM3(6):943- 953)，该文献通过引用整体并入本文。

实施例7-休克中的DPP3

测定了脓毒症/脓毒性休克和心源性休克患者血浆中的DPP3浓度，并且与患者的短期死亡率相关。

a)研究组群——脓毒症/脓毒性休克

在来自肾上腺髓质素以及严重脓毒症和脓毒性休克结果(AdrenOSS-1)研究的患者的574份血浆样品中，测量了DPP3。AdrenOSS-1是一项前瞻性观察性多国研究，包括583名因脓毒症或脓毒性休克而进入重病监护室的患者(Hollinger等,2018)。292名患者被诊断患有脓毒性休克。

b)研究组群——心源性休克

对来自108名被诊断患有心源性休克的患者的血浆样品进行DPP3筛检。在检测到心源性休克后6小时内抽取血液。跟踪7天死亡率。

hDPP3免疫测定：使用分别检测人DPP3的量(LIA)或人DPP3活性(ECA)的免疫测定法(LIA)或活性测定法(ECA)来测定患者血浆中的DPP3水平。如Rehfeld等所述进行抗体固定、标记和温育。(Rehfeld等,2019.JALM3(6):943-953)。

结果：脓毒症患者的短期患者存活率与入院时的DPP3血浆浓度有关。DPP3血浆浓度高于40.5ng/mL(四分之三位数)的患者与DPP3血浆浓度低于此阈值的患者相比具有增加的死亡率(图7A)。将此截止值应用于脓毒性休克患者的亚组，表明与高DPP3血浆浓度相关的短期死亡风险甚至更为显著(图7B)。当相同截止值应用于心源性休克患者时，在高DPP3患者中也观察到7天内短期死亡风险增加(图1C)。

实施例8-脓毒性休克患者(AdrenOSS-2)中的NT-ADM抗体

AdrenOSS-2是一项双盲安慰剂对照随机多中心概念验证和剂量确定的II期临床试验，旨在研究名为阿德瑞珠单抗的N端ADM抗体在患有脓毒性休克且肾上腺髓质素升高的患者中的安全性、耐受性和功效(Geven等,《英国医学杂志·开放版》(BMJOpen)2019；9: e024475)。将总共301名患有脓毒性休克且bio-ADM浓度>70pg/mL的患者随机分组(2:1:1)以便用约1小时内单次静脉内输注安慰剂(n＝152)、阿德瑞珠单抗2ng/kg(n＝72)或阿德瑞珠单抗4ng/kg(n＝77)进行治疗。纳入之后28(90)天内的全因死亡率为25.8％(34.8％)。平均年龄为68.4岁，并且61％为男性。对于每个方案分析，n＝294名患者仍然符合条件，并且14天全因死亡率为18.5％。

在接受阿德瑞珠单抗治疗的患者(两种剂量组合，每个方案人群)中，与安慰剂相比，观察到短期死亡率(入院后14天)降低的趋势(风险比(HR)0.701[0.408-1.21]，p＝0.100)(图8)。令人惊讶的是，在入院时DPP3浓度低于50ng/mL的患者中，治疗效果更显著(n＝244，HR 0.426，p＝0.007)(图9)，而在DPP3升高的患者(高于50ng/mL，n＝44)中，阿德瑞珠单抗和安慰剂的结果相当(HR 1.69，p＝0.209)(图10)。

表7总结了不同DPP3阈值的治疗效果(14天死亡率)。

表7不同DPP3浓度下14天死亡率的危害风险(HR)

序列

SEQ ID No.:1

GYTFSRYW

SEQ ID No.:2

ILPGSGST

SEQ ID No.:3

TEGYEYDGFDY

SEQ ID No.:4

QSIVYSNGNTY

序列“RVS”(不作为序列表的一部分)：

RVS

SEQ ID No.:5

FQGSHIPYT

SEQ ID No.:6(AM-VH-C)

SEQ ID No.:7(AM-VH1)

SEQ ID No.:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID No.:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID No.:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

SEQ ID No.:11(AM-VL-C)

SEQ ID No.:12(AM-VL1)

SEQ ID No.:13(AM-VL2-E40)

SEQ ID No.:14(人ADM 1-21)

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC

SEQ ID No.:15(人ADM 21-32)

CTVQKLAHQIYQ

SEQ ID No.:16(人ADM C-42-52)

CAPRSKISPQGY-CONH₂

SEQ ID No.:17(鼠ADM 1-19)

YRQSMNQGSRSNGCRFGTC

SEQ ID No.:18(鼠ADM 19-31)

CTFQKLAHQIYQ

SEQ ID No.:19(鼠ADM C-40-50)

CAPRNKISPQGY-CONH₂

SEQ ID No.:20(成熟人肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化ADM；bio-ADM)：氨基酸1-52或pro-ADM的氨基酸95-146

SEQ ID No.:21(鼠ADM 1-50)

SEQ ID No.:22(人ADM的1-21)：

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC

SEQ ID No.:23(人ADM的1-42)：

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA

SEQ ID No.:24(人ADM的aa 43-52)

PRSKISPQGY-NH₂

SEQ ID No.:25(人ADM的aa 1-14)

YRQSMNNFQGLRSF

SEQ ID No.:26(人ADM的aa 1-10)

YRQSMNNFQG

SEQ ID No.:27(ADM的aa 1-6)

YRQSMN

SEQ ID No.:28(人ADM的aa 1-32)

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ

SEQ ID No.:29(鼠ADM的aa 1-40)

YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA

SEQ ID No.:30(鼠ADM的aa 1-31)

YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL

SEQ ID No.:31(proADM：164个氨基酸(preproADM的22-185))

SEQ ID NO:32(阿德瑞珠单抗重链)

SEQ ID NO:33(阿德瑞珠单抗轻链)

SEQ ID No.34-人DPP3(氨基酸1-737)

SEQ ID No.35-具有额外N端半胱氨酸的人DPP3(氨基酸474-493(N-Cys))-免疫肽

CETVINPETGEQIQSWYRSGE

SEQ ID No.36-IGHV1-69*11

SEQ ID No.37-HB3

序列表

<110> 4TEEN4制药有限公司

<120> 用于在休克患者中进行NT-ADM抗体的治疗指导、监测和分层的DPP3

<130> T75115WO

<150> 20159848.9

<151> 2020-02-27

<160> 37

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

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<212> PRT

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Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

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<212> PRT

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

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Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

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<212> PRT

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

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Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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<212> PRT

<213> 智人

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Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

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Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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<212> PRT

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<211> 12

<212> PRT

<213> 小家鼠

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<210> 20

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<212> PRT

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Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

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Pro Gln Gly Tyr

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 21

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20 25 30

Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln

35 40 45

Gly Tyr

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<212> PRT

<213> 智人

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Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

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<212> PRT

<213> 智人

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Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

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Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 29

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

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Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr

20 25 30

Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala

35 40

<210> 30

<211> 31

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 30

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe

1 5 10 15

Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu

20 25 30

<210> 31

<211> 164

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro

20 25 30

Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg

35 40 45

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Pro His Phe Leu

<210> 32

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

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305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 33

<211> 219

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

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130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 34

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu

20 25 30

Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val

35 40 45

Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala

85 90 95

Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr

100 105 110

Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu

115 120 125

Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp

130 135 140

Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His

145 150 155 160

Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys

165 170 175

Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly

195 200 205

Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro

210 215 220

Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg

225 230 235 240

Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln

245 250 255

Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser

260 265 270

His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly

275 280 285

Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys

290 295 300

Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp

305 310 315 320

Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn

325 330 335

Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln

340 345 350

Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe

355 360 365

Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser

370 375 380

Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln

385 390 395 400

Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala

405 410 415

Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys

420 425 430

Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly

435 440 445

Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp

450 455 460

Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu

465 470 475 480

Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp

485 490 495

Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu

500 505 510

Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe

515 520 525

Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu

530 535 540

Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu

545 550 555 560

Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu

565 570 575

Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr

580 585 590

Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser

595 600 605

Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg

610 615 620

Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu

625 630 635 640

Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu

645 650 655

Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile

660 665 670

Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu

675 680 685

Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe

690 695 700

Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr

705 710 715 720

Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln

725 730 735

Ala

<210> 35

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp

1 5 10 15

Tyr Arg Ser Gly Glu

20

<210> 36

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

Claims (28)

1.一种在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·其中所述样品中的DPP3水平指示是否需要用抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架进行治疗，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

2.根据权利要求1所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，所述方法包括：

·测定所述患者的体液样品中的二肽基肽酶3(DPP3)水平，

·将所述测定的DPP3水平与预定阈值进行比较，并且

·向所述患者施用抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架，其中如果所述测定的DPP3水平低于预定阈值，则用所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架治疗所述患者，并且

其中所述抗ADM抗体或抗ADM片段或抗ADM非Ig支架结合至ADM的N端部分(氨基酸1-21)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(SEQ ID No.14)。

3.根据权利要求1或2所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述休克选自由于低血容量引起的休克、心源性休克、阻塞性休克和分布性休克，特别是心源性休克或脓毒性休克。

4.根据权利要求1至3所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中：

·在心源性休克的情况下，所述患者可能已经患有急性冠脉综合征(例如急性心肌梗塞)或其中所述患者患有心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)、心肌炎、心律失常、心肌病、瓣膜性心脏病、主动脉夹层伴急性主动脉瓣狭窄、外伤性腱索断裂或大面积肺栓塞，或者

·在低血容量性休克的情况下，所述患者可能已经患有出血性疾病，包括胃肠道出血、外伤、血管性病因(例如腹主动脉瘤破裂、肿瘤侵蚀到大血管中)和使用抗凝剂情形下的自发性出血，或者非出血性疾病，包括呕吐、腹泻、肾功能减退、皮肤缺损/无感失水(例如烧伤、中暑)、或在胰腺炎、肝硬化、肠梗阻情形下的第三间隙体液丧失，或者

·在阻塞性休克的情况下，所述患者可能已经患有心脏压塞、张力性气胸、肺栓塞或主动脉瓣狭窄，或者

·在分布性休克的情况下，所述患者可能患有脓毒性休克、神经源性休克、过敏性休克或由肾上腺危象引起的休克。

5.根据权利要求1至4所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述受试者的体液样品中DPP3水平的所述预定阈值在20和120ng/mL之间，更优选在30和80ng/mL之间，甚至更优选在40和60ng/mL之间，最优选所述阈值为50ng/mL。

6.根据权利要求1至5所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中测定DPP3蛋白水平和/或活性DPP3水平并且与预定阈值进行比较。

7.根据权利要求1至6所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至DPP3的捕获结合剂接触来测定DPP3水平。

8.根据权利要求1至7所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂可以选自抗体、抗体片段或非IgG支架。

9.根据权利要求1至8所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂是抗体。

10.根据权利要求1至9所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述测定包括使用特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂，其中所述捕获结合剂被固定在表面上。

11.根据权利要求1至10所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3蛋白的量和/或DPP3活性，并且其中所述分离步骤是从所捕获的DPP3除去所述样品中未与所述捕获结合剂结合的成分的洗涤步骤。

12.根据权利要求1至11所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性的方法包括以下步骤：

·使所述样品与特异性结合至全长DPP3的捕获结合剂接触，

·分离与所述捕获结合剂结合的DPP3，

·将DPP3底物添加到所述分离的DPP3，

·通过测量和定量DPP3底物的转化来定量所述DPP3活性。

13.根据权利要求1至12所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中通过选自以下的方法来检测DPP3底物转化：产荧光底物(例如Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)的荧光、发色底物的颜色变化、与氨基荧光素偶联的底物的发光(PromegaProtease-Glo^TM测定法)、质谱法、HPLC/FPLC(反相色谱法、尺寸排阻色谱法)、薄层色谱法、毛细管区带电泳、凝胶电泳后进行活性染色(固定的活性DPP3)或蛋白质印迹(切割产物)。

14.根据权利要求1至13所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中所述底物可以选自：血管紧张肽II、III和IV、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽、内啡肽1和2、valorphin、β-酪啡肽、强啡肽、原肠肽、ACTH和MSH，或与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽为Arg-Arg。

15.根据权利要求1至14所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中在所述受试者的体液样品中测定DPP3活性，并且其中所述底物可以选自：与荧光团、发色团或氨基荧光素偶联的二肽，其中所述二肽为Arg-Arg。

16.根据权利要求1至15所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的特征还在于具有高于阈值的ADM-NH₂水平。

17.根据权利要求16所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品中ADM-NH₂的所述阈值在40和100pg/mL之间，更优选在50和90pg/mL之间，甚至更优选在60和80pg/mL之间，最优选所述阈值为70pg/mL。

18.根据权利要求16和17所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中通过使所述体液样品与特异性结合至ADM-NH₂的捕获结合剂接触来测定ADM-NH₂水平。

19.根据权利要求1至18所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述患者的体液样品选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。

20.根据权利要求1至19所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中组合测定所述DPP3水平和所述ADM-NH₂水平。

21.根据权利要求20所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中同时测定所述DPP3水平和所述ADM-NH₂水平。

22.根据权利要求20和21所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中使用即时医护装置测定所述DPP3水平和所述ADM-NH₂水平。

23.根据权利要求22所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述即时医护装置是微流体装置。

24.根据权利要求1至23所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig支架识别并结合至ADM的N端末端(氨基酸1)。

25.根据权利要求1至24所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体、抗体片段或非Ig支架不结合至ADM的C端部分，所述ADM的C端部分具有ADM的氨基酸43-52序列：PRSKISPQGY-NH₂(SEQ ID NO:24)。

26.根据权利要求1至25所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段是结合至ADM的单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:1

GYTFSRYW

CDR2：SEQ ID NO:2

ILPGSGST

CDR3：SEQ ID NO:3

TEGYEYDGFDY

并且其中轻链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY

CDR2：

RVS

CDR3：SEQ ID NO:5

FQGSHIPYT。

27.根据权利要求1至26所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列作为VH区：

SEQ ID NO:6(AM-VH-C)

SEQ ID NO:7(AM-VH1)

SEQ ID NO:8(AM-VH2-E40)

SEQ ID NO:9(AM-VH3-T26-E55)

SEQ ID NO:10(AM-VH4-T26-E40-E55)

并且包含选自以下序列的序列作为VL区：

SEQ ID NO:11(AM-VL-C)

SEQ ID NO:12(AM-VL1)

SEQ ID NO:13(AM-VL2-E40)

28.根据权利要求1至26所述的在休克患者中和/或在将要休克的患者中进行治疗指导和/或治疗监测和/或治疗分层的方法，其中所述抗体或片段包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为重链：

SEQ ID NO:32

并且包含以下序列或与它具有>95％同一性的序列作为轻链：

SEQ ID NO:33

其中所述重链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:1

GYTFSRYW

CDR2：SEQ ID NO:2

ILPGSGST

CDR3：SEQ ID NO:3

TEGYEYDGFDY

并且其中所述轻链包含以下序列：

CDR1：SEQ ID NO:4QSIVYSNGNTY

CDR2：

RVS

CDR3：SEQ ID NO:5

FQGSHIPYT。

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