CN115232116A - 一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于有机合成领域，涉及荧光探针的制备，具体涉及一种苯并噁唑‑部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用。将3‑（2‑苯并噁唑基）‑4‑羟基苯甲醛和1,1,2,3‑四甲基苯并[e]碘化吲哚溶于乙醇中，加入乙酸催化，回流搅拌，反应结束后冷却静置至室温，抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到苯并噁唑‑部花菁衍生物荧光探针。本发明制备的苯并噁唑‑部花菁衍生物荧光探针既可以在DMSO/HEPES混合体系中选择性的与亚硫酸氢根作用，也可以用于识别pH或粘度变化。特别是在制备检测细胞线粒体中HSO3 ‑、pH或粘度的试剂中的应用方面具有广阔的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于有机合成领域，涉及荧光探针的制备，具体涉及一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体是一种重要的能量供应细胞器，参与能量产生、中枢代谢和氧化还原信号传导等多种细胞过程。SO2可调节脂质代谢和胰岛素水平，已被认为是心血管***中继硫化氢（H2S）、一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第四种气体信号传递器。SO2可通过GSH和Na2S2O3通过硫代硫酸盐硫转移酶在线粒体中内源性产生，以调节增加的抗氧化能力并防止细胞受损。SO2在生物体内多以HSO3 -形式存在。线粒体的正常pH环境呈弱碱性（pH~8），此状态下可维持其正常的功能，线粒体pH值的波动是细胞状态的关键标志。同样，线粒体粘度与其呼吸状态密切相关，线粒体粘度异常可能是各种疾病和细胞功能障碍的重要指标，包括高血压、动脉粥样硬化、糖尿病和细胞恶性肿瘤。因此，开发一种高效、可靠的工具用于识别HSO3 -，pH或粘度是很有必要的。
近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测重要金属离子，阴离子和小分子的重要手段。事实上，已经开发了许多荧光探针来分别检测HSO3 -、pH或粘度，或者检测这三者中的两个。如专利CN113444118A公开了一种香豆素基BODIPY类近红外荧光探针在制备检测HSO3 -探针中的应用。探针与HSO3 -作用后，荧光发射光谱中808nm处的荧光强度与HSO3 -浓度呈良好线性关系，其最低检出限为18.9nM，灵敏性高，可实现对DMSO/水混合溶液中HSO3 -定量检测。但只能实现对HSO3 -的检测。
然而，目前还没有能够同时响应HSO3 -、pH或粘度的荧光探针。此外，大多数报道的HSO3 -、pH或粘度单功能探针依赖于特定波长的荧光强度测量，这很容易受到样品环境变化的影响。相比之下，比率荧光探针涉及两个波长的发射强度比的变化，因此提供了对环境影响的内置校正以消除误差。因此，非常需要一种可以跟踪线粒体中HSO3 -、pH或粘度变化的多功能比率荧光探针。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提出一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用。本发明考虑到苯并噁唑衍生物优异的光化学和光物理特性，以部花菁为线粒体的靶向基团，合成了一种高灵敏度、高选择性的可同时检测HSO3 -、pH或粘度的多功能比率荧光探针。
本发明的主要目的在于提供一种可用于DMSO/HEPES混合体系或细胞线粒体内针对HSO3 -、pH或粘度多功能检测的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针，所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的结构式为：
。
进一步，上述苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，步骤如下：
S1：将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛和1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚溶解于有机溶剂中，得混合溶液；
S2：向步骤S1所得的混合溶液中加入催化剂，回流搅拌反应，反应结束后，将所得溶液冷却至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇重结晶，得到苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针。
进一步，所述步骤S1中3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛的结构式为：
。
进一步，所述步骤S1中1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚的结构式为：
。
进一步，所述步骤S1中3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛与1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚的摩尔比为1:（0.8-1.2）。
进一步，所述步骤S1中有机溶剂为无水乙醇。
进一步，所述步骤S2中催化剂为乙酸，3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛和乙酸的摩尔比为1:（0.05-0.15）。
进一步，所述步骤S2中回流搅拌反应的温度为80℃，回流搅拌反应的时间为6-8h。
进一步，具体制备方法为：
将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛（0.304g，1.2mmol）溶于30mL无水乙醇中，加入1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚（0.172g，1mmol），再加入催化量的乙酸，80℃下回流搅拌6-8h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到所述苯并噁唑-部花菁生物荧光探针。
进一步，所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在作为非疾病诊断或治疗为目的的检测亚硫酸氢根、pH或粘度荧光探针中的应用。
进一步，所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在制备检测细胞线粒体中检测亚硫酸氢根、pH或粘度的试剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过缩合反应制备苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针，原料易得，合成和后处理方法简单。
2、在多种常见阴离子和小分子分析物中，本发明制备的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针对HSO3 -、pH或粘度表现出较高的荧光识别性能。在DMSO/HEPES混合体系中，用苯并噁唑-部花菁衍生物对HSO3 -进行光学性质测定，研究发现，HSO3 -的线性检测范围为5-100×10-6mol/L，检出限为29×10-9mol/L；对pH进行光学性质测定，研究发现，在pH=3-13范围内，S型曲线拟合良好，pKa为6.92，对pH敏感；对粘度进行光学性质测定，研究发现，随着体系粘度的增加，苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的荧光强度是在逐步增强的，同时荧光强度比F605/F445与粘度的对数呈良好的线性关系。
3、本发明所采用的双比率的检测***可以提高检测体系的准确度，有效的避免仪器带来的偏差。探针良好的生物相容性和线粒体共定位能力非常有利于应用于生物体系，具有广泛的潜在应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的1H NMR谱图。
图2为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的13C NMR谱图。
图3为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的质谱谱图。
图4为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在DMSO/HEPES混合体系中随HSO3 -变化的荧光光谱图；
其中图4a为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针(1×10-5mo/L)的DMSO/HEPES（1:1，v:v，pH=7.4）混合体系中分别加入1×10-4 mol/L常见阴离子和小分子分析物（Br-、Cl-、ClO-、F-、H2PO4 -、HPO4 -、HS-、HSO4 -、I-、OAc-、PO4 3-、PPi、S2-、S2O3 2-、SO4 2-、H2O2和HSO3 -）的荧光光谱图；图4b为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针(1×10-5mol/L)的DMSO/HEPES（1:1，v:v，pH=7.4）混合体系中滴定不同浓度HSO3 -的荧光光谱图，插图表示荧光强度比F605/F445随HSO3 -浓度的线性变化趋势图（激发波长为390nm，增益15档）。
图5为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在DMSO/HEPES混合体系中荧光探针随pH变化的荧光光谱图；
其中5a和5b为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针（1×10- 5mol/L）的DMSO/HEPES（1:1，v:v）混合体系中随pH变化的荧光强度图，5c为荧光强度比F605/F445随pH“S”型变化趋势图（激发波长为390nm，增益10档）。
图6为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在甘油/HEPES混合体系中荧光探针随粘度变化的荧光光谱图；
其中6a为本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针（1×10-5mol/L）随粘度变化的荧光强度图，6b为荧光强度比F605/F445随粘度的对数线性变化趋势图（激发波长为390nm，增益10档）。
图7为在C6细胞中本发明实施例1制备的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针与和商用线粒体定位染料Mito-Tracker Green共染荧光成像图；
其中：a为明场图；b为蓝色通道荧光成像图；c为绿色通道荧光成像图（线粒体染色）；d为蓝色通道和绿色通道叠加后的图片；e为蓝色通道、绿色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和绿色通道强度散点图；g为蓝色通道和绿色通道强度分布叠加图。
图8为在C6细胞中本发明实施例1制备的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针与内源性和外源性HSO3-的荧光成像图；
其中：a为上述荧光探针明场图；b为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为上述荧光探针+HSO3 -明场图；g为上述荧光探针+HSO3 -蓝色通道荧光成像图；h为上述荧光探针+HSO3 -红色通道荧光成像图；i为上述荧光探针+ HSO3 -蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为上述荧光探针+HSO3 -明场图和荧光成像图；k为上述荧光探针+GSH明场图；l为上述荧光探针+GSH蓝色通道荧光成像图；m为上述荧光探针+GSH红色通道荧光成像图；n为上述荧光探针+GSH蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为上述荧光探针+GSH明场图和荧光成像图；p为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3明场图；q为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3蓝色通道荧光成像图；r为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3红色通道荧光成像图；s为上述荧光探针+ GSH+Na2S2O3蓝色通道和红色通道叠加后的图；t为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3明场图和荧光成像图。
图9为在C6细胞中本发明实施例1制备的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在不同pH条件下的荧光成像图；
其中：a为pH=7.4时上述荧光探针明场图；b为pH=7.4时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为pH=7.4时上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为pH=7.4时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为pH=7.4时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为pH=4时上述荧光探针明场图；g为pH=4时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；h为pH=4时上述荧光探针红色通道荧光成像图；i为pH=4时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为pH=4时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；k为pH=10时上述荧光探针明场图；l为pH=10时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；m为pH=10时上述荧光探针红色通道荧光成像图；n为pH=10时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为pH=10时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片。
图10为在C6细胞中本发明实施例1制备的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针与粘度的荧光成像图；
其中：a为上述荧光探针明场图；b为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为上述荧光探针+制霉菌素（Nys）明场图；g为上述荧光探针+Nys蓝色通道荧光成像图；h为上述荧光探针+Nys红色通道荧光成像图；i为上述荧光探针+Nys蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为上述荧光探针+Nys明场图和荧光成像图；k为上述荧光探针+脂多糖（LPS）明场图；l为上述荧光探针+LPS蓝色通道荧光成像图；m为上述荧光探针+LPS红色通道荧光成像图；n为上述荧光探针+ LPS蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为上述荧光探针+LPS明场图和荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，步骤如下：
将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛（0.304g，1.2mmol）溶于30mL无水乙醇中，加入1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚（0.172g，1mmol），再加入乙酸（7.0mg），80℃下回流搅拌6h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到所述苯并噁唑-部花菁生物荧光探针。目标产物的产率为85%。
采用核磁共振仪对制得的苯并噁唑-部花菁衍生物进行核磁共振分析，结果如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6),δ (ppm): 12.07 (s, 1H), 8.95 (d, J = 2.1 Hz,1H), 8.66 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 8.54 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 8.46 (d, J =8.4 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.12 (d, J =9.0 Hz, 1H), 7.92 (ddd, J = 11.0, 7.1, 2.0 Hz, 2H), 7.87 – 7.79 (m, 1H), 7.73(dd, J = 15.4, 7.6 Hz, 2H), 7.54 (pd, J = 7.4, 1.4 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.8Hz, 1H), 4.30 (s, 3H), 2.06 (s, 6H).具体核磁共振氢图谱见图1。
13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6),δ (ppm): 182.95, 162.04, 161.93, 151.58,149.57, 140.01, 139.92, 138.46, 134.66, 133.64, 133.32, 131.32, 130.52,128.90, 127.59, 127.34, 127.14, 126.74, 126.00, 123.66, 120.00, 118.96,113.75, 112.38, 111.55, 54.19, 35.42, 25.62.具体核磁共振碳图谱见图2。
质谱ESI-MS: m/z=445.1933 for [M-I]+。具体质谱谱图见图3。
实施例2
本实施例为苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，步骤如下：
将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛（0.304g，1.2mmol）溶于30mL无水乙醇中，加入1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚（0.172g，1mmol），再加入乙酸（9.0mg），80℃下回流搅拌8h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到所述苯并噁唑-部花菁生物荧光探针。目标产物的产率为88%。
实施例3
本实施例为苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，步骤如下：
将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛（0.304g，1.2mmol）溶于30mL无水乙醇中，加入1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚（0.206g，1.2mmol），再加入乙酸（8.0mg），80℃下回流搅拌7h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到所述苯并噁唑-部花菁生物荧光探针。目标产物的产率为89%。
实施例4
本实施例为苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，步骤如下：
将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛（0.304g，1.2mmol）溶于30mL无水乙醇中，加入1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚（0.37g，1.44mmol），再加入乙酸（3.0mg），80℃下回流搅拌8h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇洗涤并重结晶，得到所述苯并噁唑-部花菁生物荧光探针。目标产物的产率为86%。
应用例1
苯并噁唑-部花菁衍生物对HSO3 -的光学性质测定，步骤如下：
将上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针（1×10-5mol/L）的2mLDMSO/HEPES（1:1，v:v，pH=7.4）的混合溶液中分别加入1×10-2mol/L常见阴离子和小分子分析物（Br-、Cl-、ClO-、F-、H2PO4 -、HPO4 -、HS-、HSO4 -、I-、OAc-、PO4 3-、PPi、S2-、S2O3 2-、SO4 2-、H2O2和HSO3 -）溶液20μL，采用荧光光谱仪进行分析（激发波长为390nm,增益15档），所得荧光光谱图见图4a。通过图4a可以看出，本发明制得的苯并噁唑-部花菁花菁衍生物作为探针只对HSO3 -具有明显响应，荧光信号均可用于HSO3 -的快速鉴别，而其它离子无变化。通过图4b的滴定光谱计算可以得到HSO3 -检出限为2.9×10-8mol/L，荧光光谱的线性检测范围分别为5-100×10-6mol/L，因此本发明制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于HSO3 -的荧光定量检测。
应用例2
苯并噁唑-部花菁衍生物对pH的光学性质测定，步骤如下：
将HEPES缓冲溶液调成不同pH，将上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针（1×10-5mol/L）的分别加入到不同pH的DMSO/HEPES（1:1，v:v）的混合溶液测定荧光光谱（激发波长为390nm，增益10档）。通过图5b的滴定光谱可以看出探针在pH=3-13范围内，S型曲线拟合良好，pKa为6.92，对pH敏感，因此本发明制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于pH的荧光定量检测。
应用例3
苯并噁唑-部花菁衍生物对粘度的光学性质测定，步骤如下：
通过改变甘油/HEPES的比例改变体系的粘度。将上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针（1×10-5mol/L）加入到2mL不同比例的甘油/HEPES（pH=7.4）体系中测定荧光光谱（激发波长为390nm，增益10档）。通过图6b的滴定光谱可以看出探针对粘度敏感，因此本发明制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于粘度的荧光定量检测。
应用例4
苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针与细胞内线粒体共定位的检测实验，步骤如下：
C6细胞用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针和商用线粒体定位染料Mito-Tracker Green在37℃下共同培育30min，获得在C6细胞的荧光成像图。
具体如图7所示，其中：a为明场图；b为蓝色通道荧光成像图；c为绿色通道荧光成像图（线粒体染色）；d为蓝色通道和绿色通道叠加后的图片；e为蓝色通道、绿色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和绿色通道强度散点图；g为蓝色通道和绿色通道强度分布叠加图。C6细胞中探针蓝色通道荧光和Mito-Tracker Green绿色通道荧光基本吻合，重叠系数为0.85。
故本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针可以靶向细胞线粒体。
应用例5
苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在细胞内HSO3 -的检测实验，步骤如下：
C6细胞用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在37℃下培育30min，加入1×10-4mol/L HSO3 -，继续培育30min后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。C6细胞用1×10-5mol/L荧光探针培育30min后加入5×10-4mol/L GSH，培育60min后使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像；再加入2.5×10-4mol/L Na2S2O3继续培育30min，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。
获得细胞成像图如图8所示，其中：a为上述荧光探针明场图；b为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为上述荧光探针+HSO3 -明场图；g为上述荧光探针+HSO3 -蓝色通道荧光成像图；h为上述荧光探针+HSO3 -红色通道荧光成像图；i为上述荧光探针+HSO3 -蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为上述荧光探针+ HSO3 -明场图和荧光成像图；k为上述荧光探针+GSH明场图；l为上述荧光探针+GSH蓝色通道荧光成像图；m为上述荧光探针+ GSH红色通道荧光成像图；n为上述荧光探针+GSH蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为上述荧光探针+GSH明场图和荧光成像图；p为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3明场图；q为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3蓝色通道荧光成像图；r为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3红色通道荧光成像图；s为上述荧光探针+ GSH+Na2S2O3蓝色通道和红色通道叠加后的图；t为上述荧光探针+GSH+Na2S2O3明场图和荧光成像图。C6细胞中加入苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针红色通道和蓝色通道出现明显荧光信号，再加入HSO3 -后红色通道荧光明显减弱，而蓝色通道荧光基本不变；加入探针和GSH的细胞荧光强度与仅加入探针的细胞荧光强度无明显差异，再加入Na2S3O3孵化后的细胞由于产生内源性HSO3 -，与加入外源性HSO3 -的细胞荧光强度基本一致。
故本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于细胞线粒体中内源性和外源性HSO3 -的定性检测。
应用例6
苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在细胞内pH的检测实验，步骤如下：
C6细胞分别pH=4，7.4，10的培养基培育，然后用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在37℃下培育30min，获得不同pH的细胞成像图。
如图9所示：其中：a为pH=7.4时上述荧光探针明场图；b为pH=7.4时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为pH=7.4时上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为pH=7.4时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为pH=7.4时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为pH=4时上述荧光探针明场图；g为pH=4时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；h为pH=4时上述荧光探针红色通道荧光成像图；i为pH=4时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为pH=4时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；k为pH=10时上述荧光探针明场图；l为pH=10时上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；m为pH=10时上述荧光探针红色通道荧光成像图；n为pH=10时上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为pH=10时上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片。pH=7.4时，C6细胞中加入苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针红色通道和蓝色通道出现强荧光，C6细胞在pH=4时，红色通道变化不明显，蓝色通道荧光减弱，当pH=10时，红色通道荧光明显减弱，蓝色通道荧光明显增强。
故本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于细胞线粒体中识别pH的变化。
应用例7
苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在细胞内粘度的检测实验，步骤如下：
C6细胞用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在37℃下培育30min，分别加入1×10-5mol/L制霉菌素（Nys）和脂多糖（LPS），继续培育30min后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。
获得细胞成像图如图10所示，其中：a为上述荧光探针明场图；b为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；c为上述荧光探针红色通道荧光成像图；d为上述荧光探针蓝色通道和红色通道叠加后的图；e为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；f为上述荧光探针+Nys明场图；g为上述荧光探针+Nys蓝色通道荧光成像图；h为上述荧光探针+Nys红色通道荧光成像图；i为上述荧光探针+Nys蓝色通道和红色通道叠加后的图；j为上述荧光探针+Nys明场图和荧光成像图；k为上述荧光探针+LPS明场图；l为上述荧光探针+LPS蓝色通道荧光成像图；m为上述荧光探针+LPS红色通道荧光成像图；n为上述荧光探针+LPS蓝色通道和红色通道叠加后的图；o为上述荧光探针+LPS明场图和荧光成像图。加过制霉菌素和脂多糖后细胞产生炎症反应，粘度增加，探针在蓝色通道和红色通道荧光均明显增强。
故本发明实施例1制得的苯并噁唑-部花菁衍生物可用于细胞线粒体中粘度的定性检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针，其特征在于，所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的结构式为：
。
2.权利要求1所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1：将3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛和1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚溶解于有机溶剂中，得混合溶液；
S2：向步骤S1所得的混合溶液中加入催化剂，回流搅拌反应，反应结束后，将所得溶液冷却至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇重结晶，得到苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针。
3.根据权利要求2所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛的结构式为：
。
4.根据权利要求3所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚的结构式为：
。
5.根据权利要求4所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛与1,1,2,3-四甲基苯并[e]碘化吲哚的摩尔比为1:（0.8-1.2）。
6.根据权利要求5所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中有机溶剂为无水乙醇。
7.根据权利要求6所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中催化剂为乙酸，3-（2-苯并噁唑基）-4-羟基苯甲醛和乙酸的摩尔比为1:（0.05-0.15）。
8.根据权利要求7所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中回流搅拌反应的温度为80℃，回流搅拌反应的时间为6-8h。
9.权利要求1所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在作为非疾病诊断或治疗为目的的检测亚硫酸氢根、pH或粘度荧光探针中的应用。
10.权利要求1所述的苯并噁唑-部花菁衍生物荧光探针在制备检测细胞线粒体中亚硫酸氢根、pH或粘度的试剂中的应用。
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| CN110818703A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-21 | 河南理工大学 | 一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用 |
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