CN115216500A - 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法，属于酶工程技术领域。本发明利用葡萄糖作为碳源合成甘露糖‑6‑磷酸，经α‑1,2‑岩藻糖基转移酶等合成2’‑岩藻糖基乳糖，不仅降低了生产成本，还具有反应时间短、条件易控制、产物更纯净、产率更高的特点，为工业化生产2’‑岩藻糖基乳糖提供一条可行途径，具有较强的研究价值和社会经济效益。实验结果表明，采用本发明合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法，2’‑岩藻糖基乳糖生成量为14.56g/L，产率高达96.75%。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法。
背景技术
母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，在母乳中的含量约为15%。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿具有多种有益效果。母乳低聚糖可用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）相较于其它的有益群体有更好的功能，因此，工业合成2’-FL并提高产量降低生产成本已经成为目前的研究热点。在早期科学研究中，2’-FL是从母乳、牛乳和羊乳中提取到了少量的2’-岩藻糖基乳糖，但这远远达不到生产的需求，因此实现2’-FL工业化生产化是婴儿配方食品发展的必然要求。
目前，2’-FL的合成方法广泛为这两种：化学合成法、酶法合成法。现有技术1（Agoston K ,Hederos M J ,Bajza I , et al. Kilogram scale chemical synthesisof 2′-fucosyllactose[J]. Carbohydrate Research, 2019, 476:71-77.）采用化学合成法合成2’-FL，虽然易于放大生产、产品纯度高，但是操作步骤复杂难懂，反应过程所需求的条件很高，而且高纯度2’-FL得率低仅有19.8%~27.3%。酶法合成法尚处于探索阶段，现有技术采用GDP-岩藻糖和乳糖通过FUT2催化发生基团置换生成2’-FL或使用α-L-岩藻糖苷酶合成2’-FL。前者所使用的原料岩藻糖价格较高，使得生产成本较高而缺乏实用价值，导致2’-FL生产规模化难以实现，并且得率也较低，如现有技术2（Albermann C ,Piepersberg W ,Wehmeier U F . Synthesis of the milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose usingrecombinant bacterial enzymes[J]. Carbohydrate Research, 2001, 334(2):97-103.）中，2’-FL得率为65%。虽然后者以pNP-岩藻糖作为糖基供体可以解决原料成本问题，但是酶的转糖苷效率较低，无法应用于2’-FL的大规模合成，并且反应产物中有pNP，无法在食品领域应用。因此，开发安全、廉价的岩藻糖基底物和转糖苷效率高的转糖苷酶将是未来实现α-L-岩藻糖苷酶工业化合成2’-岩藻糖基乳糖的研究方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，不仅成本低，还具有制备时间短、得率高的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括：（1）将葡萄糖、ATP、6-磷酸葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶混合，反应得到甘露糖-6-磷酸；（2）将甘露糖-6-磷酸、乳糖、NADPH、GTP、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶混合，反应得到2’-岩藻糖基乳糖。
优选的，步骤（1）所述葡萄糖浓度为8.00-12.00g/L，ATP浓度为25.00-30.00g/L；6-磷酸葡萄糖激酶浓度为3-5mg/L；磷酸葡萄糖异构酶浓度为3-8mg/L；磷酸甘露糖异构酶浓度为3-8mg/L。
优选的，步骤（1）所述反应的温度为20-30℃，pH值为6-8，时间为20-30h。
优选的，步骤（1）所述pH值通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度为2.00-5.00g/L。
优选的，步骤（2）所述甘露糖-6-磷酸浓度为6.00-10.00g/L；乳糖浓度为15-20g/L；NADPH浓度为20.00-25.00g/L；GTP浓度为13.00-18.00g/L；磷酸甘露糖变位酶浓度为1.00-3.00g/L；甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶浓度为1.00-3.00g/L；GDP-甘露糖-6-脱氢酶浓度为1.00-3.00g/L；GDP-岩藻糖合成酶浓度为1.00-3.00g/L；α-1,2-岩藻糖基转移酶浓度为1.00-3.00g/L。
优选的，步骤（2）所述反应的温度为20-30℃，pH值为7-9，时间为20-30h。
优选的，步骤（2）所述pH值通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度为3.00-8.00g/L。
优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶和GDP-岩藻糖合成酶由重组工程菌表达纯化得到。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明利用葡萄糖作为碳源合成甘露糖-6-磷酸，经α-1,2-岩藻糖基转移酶等合成2’-岩藻糖基乳糖，反应过程容易控制，产物更纯净，产率更高，为工业化生产2’-岩藻糖基乳糖提供一条可行途径，这种生产方法降低了生产成本，具有较强的基础理论研究价值和社会经济效益。实验结果表明，采用本发明合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，2’-岩藻糖基乳糖生成量为14.56g/L，纯度为95.26%，产率高达96.75%。
附图说明
图1为本发明体外多酶级联催化合成反应路径图；
图2为marker、manB、manC、gmd、wcaG蛋白电泳图；从左到右依次为marker、manB、manC、gmd、wcaG；
图3为futC蛋白质电泳图；
图4为甘露糖-6-磷酸的进程曲线；
图5为2’-岩藻糖基乳糖的进程曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括：（1）将葡萄糖、ATP、6-磷酸葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶混合，反应得到甘露糖-6-磷酸；（2）将甘露糖-6-磷酸、乳糖、NADPH、GTP、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶混合，反应得到2’-岩藻糖基乳糖。
本发明所述合成2’-岩藻糖基乳糖方法的机理如图1所示，本发明利用体外多酶级联催化合成法，反应得到2’-岩藻糖基乳糖。
在本发明中，步骤（1）所述葡萄糖浓度优选为8.00-12.00g/L，更优选为10g/L；ATP浓度优选为25.00-30.00g/L，更优选为28.50g/L；6-磷酸葡萄糖激酶浓度优选为3-5mg/L，更优选为4mg/L；磷酸葡萄糖异构酶浓度优选为3-8mg/L，更优选为5mg/L；磷酸甘露糖异构酶浓度优选为3-8mg/L，更优选为6mg/L；所述反应温度优选为20-30℃，更优选为25℃，pH值优选为6-8，更优选为7，时间优选为20-30h，更优选为24h；所述pH值优选通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度优选为2.00-5.00g/L，更优选为4.00g/L。
在本发明中，步骤（2）所述甘露糖-6-磷酸浓度优选为6.00-10.00g/L，更优选为8.00g/L；乳糖浓度为15-20g/L，更优选为17g/L；NADPH浓度为20.00-25.00g/L，更优选为23.00g/L；GTP浓度为13.00-18.00g/L，更优选为16g/L；磷酸甘露糖变位酶浓度为1.00-3.00g/L，更优选为2.00g/L；甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶浓度为1.00-3.00g/L，更优选为2.00g/L；GDP-甘露糖-6-脱氢酶浓度为1.00-3.00g/L，更优选为2.00g/L；GDP-岩藻糖合成酶浓度为1.00-3.00g/L，更优选为2.00g/L；α-1,2-岩藻糖基转移酶浓度为1.00-3.00g/L，更优选为2.00g/L；所述反应温度优选为20-30℃，更优选为25℃，pH值优选为7-9，更优选为8，时间优选为20-30h，更优选为24h；所述pH值优选通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度优选为3.00-8.00g/L，更优选为6.0g/L。
本发明对所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。利用α-1,2-岩藻糖基转移酶合成2’-岩藻糖基乳糖不仅能降低底物用量，减少生产成本，而且反应产率大幅度提高，相同反应时间内的2’-岩藻糖基乳糖的产量提高到了96.75%。作为一种可实施方式，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶和GDP-岩藻糖合成酶由重组工程菌表达纯化得到。
与公知技术相比，本发明具有以下技术优势：1）产物纯度高，便于分离纯化。相较于体内合成，本发明不会产生次级代谢产物，利于对产物进行分离纯化。2）成本低，产率高。相较于体内合成，本发明工程菌不需要部分糖类用于生长繁殖，产率得以提高。3）反应过程更易控制。相较于体内合成生长代谢网络复杂，本发明途径简单，影响因素少，因而代谢合成过程调控难度小，更容易控制生产过程。
本发明对未提及来源的原料没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中futC为α-1,2-岩藻糖基转移酶、manB为磷酸甘露糖变位酶、manC为甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、gmd为GDP-甘露糖-6-脱氢酶、wcaG为GDP-岩藻糖合成酶。
实施例1
2’-岩藻糖基乳糖合成相关酶的重组表达
1、构建质粒
将futC酶（GenBank:ABO61750.1）、futCB酶（GenBank:WP_002174293）编码基因进行密码子优化与合成，分别均以NdeⅠ及XhoⅠ***质粒pET-28a载体的相应位点，进行酶切分析鉴定筛选，获得相应重组质粒。
2、制备2’-岩藻糖基乳糖合成相关酶的重组菌
利用化学法将含有futC、futCB基因序列的重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞C43和JM109中，复苏培养后，在添加有1‰ Kana的 LB 固体培养基中进行涂布培养，37℃过夜培养，选取长势较好的菌落进行单克隆培养，并鉴定是否获得所需重组菌。
3、2’-岩藻糖基乳糖相关合成酶的诱导表达
将转化成功的重组菌株接种到4 mL液体培养基上，于37℃、180 rpm恒温摇床过夜培养8 h（试管中需要加入1‰的kana 4 μL）。再取500 μL质粒接种于50 mL培养基（培养基含kana 50 μL）上，37℃摇床培养4 h。向各摇瓶中添加100 μL IPTG诱导表达，25℃过夜培养12 h。将摇瓶中菌体以8000 rpm、4℃、离心5 min，舍弃上清液，收集菌体。用6 mL Tirs-HCl （pH 8.5）缓冲液重悬菌体。再利用超声波破碎菌体细胞，参数设置为15 min，30%功率。将上清液于13000 rpm，4℃离心20 min。运行时间3s，间隔时间为3s。破碎后收集所得上清液即为目标酶液。
4、利用Ni柱亲和层析法对目标蛋白进行分离纯化
（1）SDS-PAGE蛋白电泳验证诱导表达结果
1）配置样品：蛋白电泳上样缓冲液与目标酶液配置比例为1:3；
2）结合：样品沸水煮10min；
3）电泳：加marker 10 mL，添加样品15 mL于不同跑道。电压120 U，电流400 mA，等待1 h；
4）染色：考马斯亮蓝染色，加热3 min；
5）脱色：倒入脱色液，加热，可重复脱色达到理想效果，脱色浸泡12 h，利用凝胶成像***分析观察，具体结果见图1-2。
由图2-3可知，菌株自身能合成的与2’-岩藻糖基乳糖有关的酶manB、manC、gmd、wcaG，α-1,2-岩藻糖基转移酶futC、futCB均成功表达，由图可知，粗提manB及manC分子量大约为50kDa，gmd及wcaG分子量在34 kDa左右，futC及futCB蛋白分子量在30 KDa左右；重组载体导入感受态细胞TM109中futC及futCB酶的表达效果优于导入C43感受态菌株。与futCB相比，futC的表达条带最清晰且表达量更多，故本实验后续选择纯化futC蛋白并展开实验。
（2）α-1,2-岩藻糖基转移酶(futC酶)、磷酸甘露糖变位酶（manB）、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（manC）、GDP-甘露糖-6-脱氢酶（gmd）和GDP-岩藻糖合成酶（wcaG）的蛋白纯化。
利用亲和层析法纯化上述目标酶液部分，从中得到futC、manB、manC、gmd和wcaG酶蛋白，具体过程如下：
1）用0.45μm直径滤网过滤上清液；
2）Ni柱水洗：用6-12倍柱体积超纯水以100 cm/h流速清洗树脂，去除乙醇；
3）Ni柱平衡：用6-12倍柱体积平衡缓冲液（20 Mm Tirs-HCl pH 8.5，400 mMNaCl，20 mM咪唑）以120 cm/h流速平衡介质，从而确保介质所含溶液组分及pH与样品一致；
4）上样：离心、过滤样品后以120 cm/h流速缓慢上样；
5）洗杂：用12-24倍柱体积缓冲液（20 Mm Tirs-HCl pH 8.5，400 mM NaCl，20 mM咪唑）以120 cm/h流速洗脱非特异性蛋白，收集流穿液进行后续分析；
6）洗脱：以6-12倍柱体积洗脱缓冲液（20 Mm Tirs-HCl pH 8.5，200 mM NaCl，20mM咪唑）以低流速洗脱蛋白，收集洗脱液进行后续分析；
7）透析：将收集到的洗脱液装入透析袋，置于透析液（20 Mm Tirs-HCl pH 8.5，100 mM NaCl，20 mM咪唑）；
8）保存：将上述透析后的futC、manB、manC、gmd、wcaG酶蛋白于-20℃进行保存。
实施例2
2’-岩藻糖基乳糖的制备
1、体外多酶催化转化葡萄糖合成甘露糖-6-磷酸
将10.00g/L葡萄糖、28.50g/L ATP以及0.004g/L 6-磷酸葡萄糖激酶、0.005g/L磷酸葡萄糖异构酶、0.006g/L磷酸甘露糖异构酶与4.00g/L磷酸缓冲液（pH7.0）混合，搅拌均匀，在25℃下反应24h，得到甘露糖-6-磷酸。该反应中的反应体系体积为50mL。
2、多酶催化转化甘露糖-6-磷酸合成2’-岩藻糖基乳糖
调整上述甘露糖-6-磷酸浓度至8.00g/L，将8.00g/L甘露糖-6-磷酸、17g/L乳糖、23.00g/L NADPH、16.00g/L GTP以及2.00g/L磷酸甘露糖变位酶、2.00g/L甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、2.00g/L GDP-甘露糖-6-脱氢酶、2.00g/L GDP-岩藻糖合成酶、2.00g/L α-1，2-岩藻糖基转移酶置于6.00g/L磷酸缓冲液（pH8.0）中，搅拌均匀，在25℃下反应24h，得到2’-岩藻糖基乳糖。该反应中的反应体系体积为50mL。
实施例3
1、体外多酶催化转化葡萄糖合成甘露糖-6-磷酸
将12.00g/L葡萄糖、30.00g/L ATP以及5mg/L 6-磷酸葡萄糖激酶、8mg/L磷酸葡萄糖异构酶、8mg/L磷酸甘露糖异构酶与8.00g/L磷酸缓冲液混合，搅拌均匀，在30℃下反应20h，得到甘露糖-6-磷酸。该反应中的反应体系体积为50mL。
2、多酶催化转化甘露糖-6-磷酸合成2’-岩藻糖基乳糖
调整上述甘露糖-6-磷酸浓度至10.00g/L，将10.00g/L甘露糖-6-磷酸、20g/L乳糖、25.00g/L NADPH、18.00g/L GTP以及3.00g/L磷酸甘露糖变位酶、3.00g/L甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、3.00g/L GDP-甘露糖-6-脱氢酶、3.00g/L GDP-岩藻糖合成酶、3.00g/Lα-1，2-岩藻糖基转移酶置于3.00g/L磷酸缓冲液中，搅拌均匀，在30℃下反应20h，得到2’-岩藻糖基乳糖。该反应中的反应体系体积为50mL。
实施例4
1、体外多酶催化转化葡萄糖合成甘露糖-6-磷酸
将8.00g/L葡萄糖、25.00g/L ATP以及3mg/L 6-磷酸葡萄糖激酶、3mg/L磷酸葡萄糖异构酶、3mg/L磷酸甘露糖异构酶与5.00g/L磷酸缓冲液混合，搅拌均匀，在20℃下反应30h，得到甘露糖-6-磷酸。该反应中的反应体系体积为50mL。
2、多酶催化转化甘露糖-6-磷酸合成2’-岩藻糖基乳糖
调整上述甘露糖-6-磷酸浓度至6.00g/L，将6.00g/L甘露糖-6-磷酸、15g/L乳糖、20.00g/L NADPH、13.00g/L GTP以及1.00g/L磷酸甘露糖变位酶、1.00g/L甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、1.00g/L GDP-甘露糖-6-脱氢酶、1.00g/L GDP-岩藻糖合成酶、1.00g/L α-1，2-岩藻糖基转移酶置于8.00g/L磷酸缓冲液中，搅拌均匀，在20℃下反应30h，得到2’-岩藻糖基乳糖。该反应中的反应体系体积为50mL。
实施例2-4中，磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、α-1，2-岩藻糖基转移酶均为实施例1制备得到。
实验例1
HPLC测定甘露糖-6-磷酸、2’-岩藻糖基乳糖生成量
HPLC高效液相色谱仪为SCIEX Triple QuadTM 5500；色谱柱：ACQUITY UPLC BENC18 1.7µm 2.1mm×50mm；流动相：溶液A（氨水10%(v/v)），溶液B（乙腈）；流速：0.4 mL/min，检测器：示差折光检测器。
在实施例3步骤1或步骤2反应进行第0h、2.5h、4.5h、8h、12h、18h和24h时，取适量的反应液，12000rpm，4℃离心10min后收集上清液，并配制甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖标准溶液，将适度稀释后的样品上清液和标准溶液经过0.22µm微孔滤膜过滤后，用HPLC高效液相色谱、示差折光分别测定甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖的含量，具体结果见图4-5。
其中，HPLC检测物质浓度的计算方法：将甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖标准品稀释到由高到低不同浓度，用HPLC检测不同浓度的甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖标准品，得到这两种物质对应峰的保留时间和不同浓度对应的峰面积，以峰面积和浓度制作标准曲线。将预处理之后的样品上清液进行HPLC检测，找到相应保留时间范围内的峰，即为样品中甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖的峰，将峰面积代入标准曲线方程中，即可计算出样品中甘露糖-6-磷酸和2’-岩藻糖基乳糖的浓度。
由图4-5可知，实施例3步骤1中0-8h产物积累较快，8-24h内产物积累逐渐缓慢，反应24h时，得到的甘露糖-6-磷酸生成量为13.84g/L。
若反应物全部转化为产物，则产物甘露糖-6-磷酸的物质的量浓度与反应物葡萄糖的物质的量浓度相同，约为0.0555mol/L。将物质的量浓度转化为质量浓度，可以得到甘露糖-6-磷酸的理论生成量为14.44g/L，实际生成量与理论生成量的比值即为产率，计算得到甘露糖-6-磷酸的产率为95.85%；步骤2中0-8h产物积累迅速，8h后产物浓度趋于平缓，反应24h时，得到的2’-岩藻糖基乳糖生成量为14.56g/L。若反应物全部转化为产物，则产物2’-岩藻糖基乳糖的物质的量浓度与反应物甘露糖-6-磷酸的物质的量浓度相同，约为0.0308mol/L。将物质的量浓度转化为质量浓度，可以得到2’-岩藻糖基乳糖的理论生成量为15.05g/L，实际生成量与理论生成量的比值即为产率，计算得到2’-岩藻糖基乳糖的产率为96.74%。将反应液烘干至恒重，称取50mg的固体，溶解于10ml的超纯水中，得到的溶液进行HPLC检测，计算出溶液中2’-岩藻糖基乳糖的浓度为4.763g/L，即50mg的固体产物中含有47.63mg的2’-岩藻糖基乳糖，计算得到2’-岩藻糖基乳糖的纯度为95.26%，产率为96.75%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种合成2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）将葡萄糖、ATP、6-磷酸葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶混合，反应得到甘露糖-6-磷酸；
（2）将甘露糖-6-磷酸、乳糖、NADPH、GTP、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶混合，反应得到2’-岩藻糖基乳糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述葡萄糖浓度为8.00-12.00g/L；ATP浓度为25.00-30.00g/L；6-磷酸葡萄糖激酶浓度为3-5mg/L；磷酸葡萄糖异构酶浓度为3-8mg/L；磷酸甘露糖异构酶浓度为3-8mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的温度为20-30℃，pH值为6-8，时间为20-30h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的pH值通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度为2.00-5.00g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述甘露糖-6-磷酸浓度为6.00-10.00g/L；乳糖浓度为15-20g/L；NADPH浓度为20.00-25.00g/L；GTP浓度为13.00-18.00g/L；磷酸甘露糖变位酶浓度为1.00-3.00g/L；甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶浓度为1.00-3.00g/L；GDP-甘露糖-6-脱氢酶浓度为1.00-3.00g/L；GDP-岩藻糖合成酶浓度为1.00-3.00g/L；α-1,2-岩藻糖基转移酶浓度为1.00-3.00g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述反应的温度为20-30℃，pH值为7-9，时间为20-30h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述反应的pH值通过磷酸缓冲液调节，所述磷酸缓冲液的浓度为3.00-8.00g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、GDP-甘露糖-6-脱氢酶和GDP-岩藻糖合成酶由重组工程菌表达纯化得到。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116200360A (zh) * | 2023-01-30 | 2023-06-02 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109750011A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-05-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种甘露糖6-磷酸磷酸酶及甘露糖生物制备方法 |
| CN112342176A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-02-09 | 江南大学 | 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用 |
| CN113337554A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-03 | 华东理工大学 | 一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法 |
-
2022
- 2022-09-20 CN CN202211140149.0A patent/CN115216500A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| CN116200360B (zh) * | 2023-01-30 | 2023-09-15 | 芝诺(苏州)生物科技有限公司 | 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法 |
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