CN115198030B - 用于朱顶红杂交后代鉴定的ssr分子标记组合、ssr引物组合及其应用 - Google Patents
用于朱顶红杂交后代鉴定的ssr分子标记组合、ssr引物组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用,本发明基于朱顶红转录组数据开发EST‑SSR标记,以朱顶红亲本和杂交后代基因组DNA为模板,使用SSR引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳,进行朱顶红亲本和杂交后代的EST‑SSR分析,可用于朱顶红杂交后代的早期鉴定。本发明的检测方法适用于朱顶红EST‑SSR分子标记开发及其杂交后代的早期鉴定,既提高了朱顶红杂交育种效率,又降低了杂交后代株系的管理成本,具有准确性高、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明属于花卉遗传育种与技术应用领域,具体涉及用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用。
背景技术
朱顶红(Hippeastrum spp.)为石蒜科朱顶红属(Hippeastrum)多年生球根花卉的总称,原产于中南美洲,其品种繁多(超过600个园艺品种)、株型优美、花大色艳、花型多变、花色艳丽且丰富,极具观赏价值(孙翊等,2017)。朱顶红常用作切花和盆花,在国内外花卉市场上均深受喜爱,此外朱顶红又可露地种植,已逐渐应用于园林景观,具有广阔的市场前景(曹华等,2021;孙翊等,2017)。
目前,国际上流行的园艺杂交种朱顶红有100多个品种,而国内推广应用的朱顶红品种主要引自荷兰、美国和南非等地,缺少自主培育的新品种,种球主要依赖国外进口(石丰瑞等,2014;王黎等,2020)。中国的朱顶红市场前景极为广阔,然而缺乏自主知识产权的品种是限制朱顶红产业发展的主要“瓶颈”之一,导致朱顶红在生产和销售上受到限制且价格高昂;因此,近年来国内逐渐关注创制具有自主知识产权的朱顶红品种或品系(叶露,2007;石丰瑞等,2014;杨柳燕等,2019),以期选育出商品价值高的新品种,从而减少种球的进口,满足国内日益增长的需求。目前,杂交育种是培育朱顶红新品种最为常用的方法,虽然朱顶红不同杂交组合的结实率存在差异,但通过杂交可获得大量杂交后代,例如石丰瑞等(2014)通过44个杂交组合获得了1.6万株杂交苗,田松青(2007)采用引进的12个品种配置67个组合共获得了2万株一代杂种单株。在选育朱顶红新品种时,新品种鉴定主要依赖传统的形态学鉴定,即通过杂交苗开花性状鉴定,而杂交苗培育到开花种球需要2~3年时间,杂交获得的后代群体数量较大,管理成本较高,且育种周期较长。例如,石丰瑞等(2014)于2010年开展杂交育种并获得1.6万株杂交苗,直至2014年才通过已开花组合进行鉴定并筛选出新材料5个;田松青(2007)杂交获得的2万株一代杂种单株经连续3年的初选及单株复选,才从167个初选杂交后代中选育出31个优良品种。因此,对杂交后代进行早期鉴定,是降低朱顶红育种成本、缩短育种周期的有效途径,将加快朱顶红新品种的培育进程,为实现我国自主选育朱顶红的市场供应有着重要意义。
近年来,随着全基因组测序、简化基因组测序、RNA-seq等高通量测序技术的快速发展,提高了分子标记的开发效率,降低了开发成本(郭丽丽等,2021)。基于SSR、SNP等分子标记,已构建了梅花、菊花、莲花、牡丹、桂花、等重要花卉的高密度遗传图谱,为该些物种的分子标记辅助育种提供了基础,加快了新品种选育的进程。简单重复序列(SimpleSequence Repeats,SSR),也称为微卫星DNA,是一类由1-6bp组成的基序串联重复而成的DNA序列。与其它分子标记技术相比,SSR标记具有数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高;(3)以孟德尔方式遗传,呈共显性;另外还具有DNA用量少,DNA质量要求不高,快速简便,重复性好等优点(卓蕾等,2021)。基于EST(Expressed sequence tags)序列开发的SSR标记具有信息量大、通用性好、开发简单等优越性,是目前一种主要的功能性分析标记,已广泛应用于植物遗传图谱构建、亲缘关系鉴定、遗传多样性评价、功能基因组学研究等(钱学磊等,2012;陈思等,2018)。因此,开发可用于朱顶红杂交后代早期鉴定的EST-SSR分子标记,将有助于开展朱顶红的分子标记辅助育种工作,实现朱顶红新种质的早期鉴定,加快朱顶红新品种的选育。
发明内容
发明目的:朱顶红杂交育种存在后代群体数量较大,管理成本较高,且育种周期较长等问题,相较于其他观赏植物,其分子标记辅助育种技术较为薄弱,制约了国产新品种的选育进程。针对上述现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用,所述SSR引物组合可用于朱顶红杂交后代的早期鉴定,既提高了朱顶红杂交育种效率,又降低了杂交后代株系的管理成本,具有准确性高、操作简便等优点。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:
用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合,所述组合中的SSR分子标记分别由具有如下核苷酸序列的引物对扩增所得:
用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR引物组合,所述组合包括具有如下核苷酸序列的引物对:
一种试剂盒,其包所述的SSR引物组合。
所述的SSR分子标记组合、所述的SSR引物组合、或所述的试剂盒在朱顶红杂交后代鉴定中的应用。
朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证,采用所述SSR引物组合或所述试剂盒,对朱顶红样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行电泳检测,将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串,最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据,作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’。
优选的,所述朱顶红亲本中,母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naranja’,父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naranja’,共配置6组杂交组合,分别为♀Picotee×♂Blossompeacock、♀Rapido×♂Blossompeacock、♀Picotee×♂Sunny nymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀Naranja×♂Luna、♀Luna×♂Naranja。
一种朱顶红杂交后代鉴定方法,包括如下步骤:
1)朱顶红亲本和杂交后代DNA提取;
2)采用所述的SSR引物组合或所述的试剂盒,对朱顶红亲本和杂交后代PCR扩增;
3)扩增产物毛细管电泳检测;
4)根据电泳结果,将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串,最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据;
5)将步骤4)的结果与权利要求5所述的分子身份证进行比对,进行朱顶红杂交后代鉴定鉴定,如果杂交后代间,编号完全一致,则为重复样本。
有益效果:本发明通过对朱顶红亲本和杂交后代样本的转录组测序,利用MISA软件从Unigenes中获得了大量候选SSR位点,从中挑选SSR位点并设计和合成引物,通过朱顶红亲本和部分杂交后代的毛细管电泳检测,筛选出特异性高、多态性好的EST-SSR位点,并应用于朱顶红杂交后代的早期鉴定。该方法简单易行,稳定可靠,准确性高,具有很好的实用价值。本发明方法基于朱顶红亲本和杂交后代转录组测序数据,通过生物信息学分析,高效地开发出多个特异性高、多态性好的EST-SSR标记,可用于朱顶红杂交后代的快速鉴定。因此,本发明方法对加快朱顶红新品种选育具有十分重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程,实施例将有助于理解本发明,但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1:
试验材料为本单位保存的朱顶红种质资源及其相应的杂交后代,母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naranja’,父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naranja’,共配置6组杂交组合,分别为♀Picotee×♂Blossompeacock、♀Rapido×♂Blossompeacock、♀Picotee×♂Sunny nymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀Naranja×♂Luna、♀Luna×♂Naranja。杂交育种和杂交后代的管理参照田松青(2007)的方法。
6组杂交组合中,从每组中随机选择60株杂交后代,用于本实施例的测试。
1.朱顶红亲本及杂交后代转录组测序分析
采集朱顶红亲本及其杂交后代中30%样本(即30株)的叶片,为降低测序成本,将所有样本亲本1份样本,使用植物RNA提取试剂盒参照说明书提取RNA,委托测序公司按照转录组测序常规流程完成文库构建和测序。
2.朱顶红EST-SSR标记挖掘和引物设计
使用MISA软件从Unigenes中搜索SSR位点,搜索标准为单核苷酸重复最少搜索次数为10次,二核苷酸重复为6次,三核、四核、五核和六核苷酸重复为5次。基于SSR位点信息(名称、引物序列、引物长度、引物TM值、产物长度、重复单元类型、重复次数)。由表1可见,基于朱顶红亲本和杂交后代的转录组测序,获得了大量的SSR候选位点,除了单核苷酸类型外,二核苷酸和三核苷酸SSR位点较多。
表1朱顶红EST-SSR的数量和类型
基于转录组数据挖掘的SSR位点长度、Unigene上的开始位置和结束位置、重复序列所在的位置区域、相应的上下游引物及其适宜的退火温度等信息,按照以下标准筛选SSR位点——选择重复单元为2、3、4、5个碱基的位点;选择片段长度大于150bp,小于300bp;基因所在位置不宜太集中、已经有多态的位点优先选、不同组合的重复单元均衡选择,最终选择25个候选EST-SSR标记,如表2所示。
引物设计遵循以下原则:选择在20-23bp之间的引物、选择TM值在60度左右的引物;选择碱基重复数小于等于4个的引物;选择5’和3’端不要有2个连续A/T碱基;引物内不能有重复序列。所设计的引物如表2所示。
表2 SSR位点及其引物
续上表:
3.亲本和杂交后代DNA提取
使用植物DNA提取试剂盒提取朱顶红亲本(8个)和杂交后代(30株)叶片DNA,具体提取步骤按试剂盒说明书进行。提取的DNA通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,使用NanoDrop1000分光光度计检测DNA浓度及纯度,达到检测要求的DNA冻存与-80℃备用。
4.PCR扩增
PCR扩增体系共计20μL,具体如下:
组分 | 体积 |
2×TSINGKE Master Mix(blue) | 10μL |
10μM Primer F(加接头) | 1μL |
10μM Primer R | 1μL |
Template(gDNA) | 1μL |
ddH2O | 7μL |
Total | 20μL |
PCR反应程序的具体步骤如下:
/>
扩增后的PCR产物(2μL扩增产物+6μL溴酚蓝)通过1.0%琼脂糖凝胶电泳(电压300V,12min)获取鉴定胶图,通过胶图确定模板浓度,加水稀释到毛细管电泳所需浓度。
5.毛细管电泳检测
首先将HiDi与GS500的内标按130:1混合,配成mix;用国产96孔反应板分装mix,每个孔中加入10μLmix;对应着在96孔板中加入0.5μL样品模板,离心到4000rpm即停;用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5min,拿出后立即放入-20℃冷却;冷却后拿出,4000rpm离心,解冻、混匀后,采用ABI 3730测序仪进行毛线管电泳。
6.特异性高,多态性好的EST-SSR位点筛选
获取下机结果,用Gene mapper 4.1软件进行数据准确位点的分析,分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小;根据分析出来的位点信息(峰图.PDF和数据.excel)来判断检测引物是否具有位点多态性,选取特异性高,多态性好的位点。
从25个候选EST-SSR标记中,最终获得11个具有较高多态性的EST-SSR位点,具有较高的开发效率(44%)。11个EST-SSR位点,每个位点的有效等位基因数为2个,具体信息如表3所示,可用于朱顶红杂交后代的鉴定。
表3具有较高多态性的EST-SSR位点及其引物信息
7.基于EST-SSR的朱顶红杂交后代鉴定
以朱顶红亲本(8个)和杂交后代(60株)为测试材料,参照步骤3)提取DNA,应用表3中引物,参照步骤4)进行PCR扩增,参照步骤5)进行毛细管电泳检测。按表3引物的顺序(即ZLSSR004、ZLSSR008、ZLSSR010、ZLSSR011、ZLSSR013、ZLSSR014、ZLSSR016、ZLSSR018、ZLSSR022、ZLSSR024和ZLSSR025),将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串,最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据,作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’。如果杂交后代间,编号完全一致,则为重复样本。
由表4、表5可见,基于开发的11对EST-SSR标记,♀Luna×♂Naranja的60个杂交后代以及♀Naranja×♂Luna的60个杂交后代,每个均获得各自‘分子身份证’,通过在Excel表格中检索重复项,可将重复的(‘分子身份证’)一致的样本分辨出,从而可以实现杂交后代的快速鉴定,减少后续杂交后代的重复管理,提高选育的效率。
其余4组杂交组合的鉴定,通过该方法,也达到了较好的鉴定效果。
表4 ♀Luna×♂Naran ja杂交后代鉴定结果
表4 ♀Naran ja×♂Luna杂交后代鉴定结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 用于朱顶红杂交后代鉴定的SSR分子标记组合、SSR引物组合及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 22
cttagggagt ggactctgcg 20
Claims (3)
1.一种朱顶红杂交后代鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)朱顶红亲本和杂交后代DNA提取;
2)采用如下SSR引物组合,对朱顶红亲本和杂交后代PCR扩增;
所述引物组合包括具有如下核苷酸序列的引物对:
3)扩增产物毛细管电泳检测;
4)根据电泳结果,将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串,最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据;
5)将步骤4)的结果与朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证进行比对,进行朱顶红杂交后代鉴定鉴定,如果杂交后代间,编号完全一致,则为重复样本。
2.根据权利要求1所述的朱顶红杂交后代鉴定方法,其特征在于,步骤5)中所述朱顶红亲本及其杂交后代的分子身份证,由以下方法获得:
采用如下SSR引物组合,对朱顶红样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行电泳检测,将每个个体的等位基因转换成为1和0字符串,最终得到朱顶红亲本及其杂交后代的由1、0编号的原始数据,作为每一个朱顶红样本的‘分子身份证’;所述引物组合包括具有如下核苷酸序列的引物对:
。
3.根据权利要求2所述的朱顶红杂交后代鉴定方法,其特征在于,所述朱顶红亲本中,母本品种选择‘Picotee’、‘Rapido’和‘Naran ja’,父本品种选择‘Blossom peacock’、‘Sunny nymph’、‘Matterhorn’、‘Luna’和‘Naran ja’,共配置6组杂交组合,分别为♀Picotee× ♂ Blossom peacock、♀Rapido× ♂Blossom peacock、♀Picotee× ♂Sunnynymph、♀Picotee×♂Matterhorn、♀ Naran ja×♂Luna、♀Luna×♂Naran ja。
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