CN110283929B

CN110283929B - 辣椒疫病抗性基因相关的snp标记5-160及其特异性引物和应用

Info

Publication number: CN110283929B
Application number: CN201910622777.4A
Authority: CN
Inventors: 王立浩; 张正海; 曹亚从; 于海龙; 张宝玺
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN110283929A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及辣椒疫病抗性基因SNP标记5‑160及其特异性引物和应用。本发明确定了辣椒基因组中与辣椒疫病抗性形状相关的SNP位点，应用上述SNP位点，只需在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可对辣椒疫病抗性基因进行判断，可以广泛应用到分子标记辅助育种中。

Description

辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160及其特异性引物和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160及其特异性引物和应用。

背景技术

辣椒疫病是影响辣椒生产的主要病害之一，由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici Leonian)引起，辣椒被疫霉菌侵染后可出现根系坏死，茎、叶和果实腐烂等症状，造成严重损失。经杂交引入疫病抗性基因是培育辣椒抗病品种的主要手段，该方法的难点在于辣椒材料对疫病的抗性遗传规律多样，主要由2个或2个以上多基因控制、单显性基因控制和单显性基因加修饰基因控制模型，并且抗性基因具有小种特异性和危害症状特异性特点。

分子标记辅助育种基于基因型筛选种质资源，避免或降低表型选择的误差，能大大缩短育种进程，是提高转育准确性和效率的重要手段。现有技术公开了多个辣椒疫病抗性分子标记，然而，这些分子标记也存在基因型与表型不一致等问题，影响其在材料筛选和分子标记辅助育种中的应用。针对不同抗性材料开发与相关基因连锁更紧密、适合性更高、检测更高效的分子标记有助于辣椒疫病抗性材料的选择和品种选育。

发明内容

本发明的目的在于提供一种辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160。

本发明的再一目的在于提供上述SNP标记的KASP特异性引物。

本发明的再一目的在于提供上述SNP标记和引物的应用。

本发明的再一目的在于提供鉴定抗疫病辣椒的方法。

本发明的再一目的在于提供鉴定抗疫病辣椒的检测试剂盒。

根据本发明具体实施方式的辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基用K表示，K代表T或G。

CAGGAAATTGGAGAACTGAAGKCCATTGTAAAACTAGATCTTTCTGGTAAC

根据本发明具体实施方式的辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160的KASP特异性引物，5-160引物序列如下：

前引物A1:5′-CAGGAAATTGGAGAACTGAAGG-3′，

前引物A2:5′-CAGGAAATTGGAGAACTGAAGT-3′,

后引物C:5′-GTTACCAGAAAGATCTAGTTTTACAATGG-3′。

根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物，所述前引物A1、A2的5’端加有荧光标签，其中，所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列。

根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物，所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

本发明提供辣椒疫病抗性基因SNP标记的应用，尤其是在辣椒分子标记辅助育种中的应用。

根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的方法，其包括应用辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160鉴定待测辣椒材料的疫病抗性的步骤

当辣椒的疫病抗病性表型为“感病”，该SNP位点为G:G基因型，即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位T的纯合型；

当辣椒的疫病抗病性表型为“抗病”，该SNP位点为G:G基因型，即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为G的纯合型；或者，该SNP位点为A:G基因型，即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为T和G的杂合型。

根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的方法，包括使用所述的KASP特异性引物进行PCR检测的步骤。

根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的检测试剂盒，其中含有所述的KASP特异性引物。

所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A的核苷酸序列为上述5-160引物的前引物A1，其5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列为上述A1序列的反向互补序列，其3’末端连接淬灭基团；

所述荧光探针B的核苷酸序列为5-160引物的前引物A2，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列为上述A2序列的反向互补序列，其3’末端连接淬灭基团。

在本发明中，所述荧光基团A具体为FAM荧光标签序列；所述荧光基团B具体为HEX荧光标签序列；所述淬灭基团具体为Q。

本发明的有益效果：

依据本发明的SNP分子标记可不通过辣椒疫病抗性人工接种鉴定，只在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以对辣椒疫病抗性基因进行判断，可广泛应用到分子标记辅助育种。本发明的SNP分子标记可用KASP基因分型技术进行大批量检测，提高效率，缩短鉴定时间。

附图说明

图1为KASP标记5-160在杂交组合中的扩增结果；其中，蓝色点为与辣椒疫病抗性亲本相同基因型的单株(G:G基因型)，绿色点为辣椒疫病感病材料(T:T基因型)，红色点为杂合型单株(T:G基因型)；

图2为KASP标记5-160在44个辣椒材料中的扩增结果，其中，蓝色点为与辣椒疫病抗性亲本相同基因型的单株(G:G基因型)，绿色点为辣椒疫病感病材料(T:T基因型)。

具体实施方式

实施例1辣椒疫病抗性基因相关SNP位点的获得及对应KASP引物的确定

1.试验材料

以感病材料77013、IVF2014032和H3，抗病材料CM334、perennial、0601M和RP4及其F1为试验材料。

2.表型鉴定

上述各辣椒材料表型的抗性鉴定采用人工接种鉴定方法，每个材料3次重复，每重复10株，按照中华人民共和国农业行业标准《辣椒抗病性鉴定技术规程第1部分：辣椒抗疫病鉴定技术规程》(NYT 2060.1-2011)进行。

结果表明，77013、IVF2014032和H3的病情指数分别为80.00、80.48和75.38，大于70，属于感病材料；CM334、perennial、0601M和RP4的病情指数分别为18.09、48.11、39.26和3.33，小于70，属于抗病材料。

3.辣椒疫病抗性基因相关SNP位点的获得及对应KASP引物的确定

(1)基因组重测序和分子标记设计

对感病材料77013和抗病材料0601M的基因组进行重测序，以抗病材料CM334为参考基因组，确定样本中的SNP位点，并设计KASP引物。

每对KASP分子标记含有3条引物序列：A1、A2、C。

其中，A1、A2仅仅是末端的SNP位点存在差异，在A1、A2的5’端分别加有不同荧光标签序列。

FAM荧光标签序列：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

FAM荧光标签序列和HEX荧光标签序列与KASP V4.0 2X Master mix 96/384,LowRox里带有荧光的序列互补，配对后会激发荧光。

C为反向互补序列。

KASP标记的PCR扩增体系包括DNA模板、引物混合物、荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。引物混合物包括引物A1、A2和C。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团Q；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团Q。

表1 KASP标记的核苷酸序列信息

(2)多态性SNP标记的筛选

利用上述KASP引物对感病材料77013、IVF2014032、H3及抗病材料CM334、perennial、0601M和RP4及其F1代进行PCR扩增。

KASP PCR扩增反应后读数需使用Roche 480荧光定量仪，进行KASP Genotying，读取荧光数据，根据分析结果按照如下确定待测基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，左下角显示黑色的样本为以H₂O替代模板的空白对照。

与辣椒疫病抗性表型一致的KASP引物组合为5-160，表型及基因型鉴定结果如表2和图1所示，分子标记分型和亲本表型一致，可用于辣椒疫病抗性材料的SNP分子标记辅助选择。

5-152、5-155和5-163标记不能准确区分抗感亲本及其F1，即双亲间在此SNP上没有多态性，不能进行群体的分子标记分型。

表2分子标记5-160在辣椒双亲及F1代分型情况

SNP位点的多态性为SEQ ID NO.1所示序列的25位为T或G。

当辣椒的疫病抗病性表型为“感病”时，该SNP位点为G:G基因型，即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为T的纯合型；

当辣椒的疫病抗病性表型为“抗病”时，

(1)该SNP位点为G:G基因型，即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为G的纯合型；或者

(2)该SNP位点为G:A基因型、即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为T和G的杂合型。

实施例2利用分子标记5-160从自然群体中筛选抗疫病辣椒材料

选用44份辣椒材料，使用KASP标记进行PCR扩增。实验结果见表3、图2。

表3分子标记5-160在辣椒自然群体中的分型情况

结果表明，当供试辣椒的表型为“抗病”时，分子标记5-160对应的SNP位点分别为G:G基因型；当供试辣椒的表型为“感病”时，分子标记5-160对应的SNP位点分别为T:T。因此，可利用本发明分子标记5-160从辣椒自然群体中筛选抗疫病材料。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160及其特异性引物和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> allele

<222> (25)..(25)

<223> K = T OR G

<400> 1

caggaaattg gagaactgaa gkccattgta aaactagatc tttctggtaa c 51

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggaaattg gagaactgaa gg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggaaattg gagaactgaa gt 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttaccagaa agatctagtt ttacaatgg 29

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims

1.鉴定抗疫病辣椒的方法，其特征在于，所述方法包括使用辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160鉴定待测辣椒材料的疫病抗性的步骤，所述SNP标记5-160的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基为T或G，

其中，

当辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160对应的SNP位点为T:T纯合型基因型时，则待测辣椒材料的疫病抗病性表型为感病；

当辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160对应的SNP位点为G:G纯合性基因型或T:G杂合型基因型时，则待测辣椒材料的疫病抗病性表型为抗病。

2.根据权利要求1所述的鉴定抗疫病辣椒的方法，其特征在于，使用所述辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-160的KASP特异性引物对待测辣椒材料进行荧光PCR检测，所述KASP特异性引物的序列如下：

前引物A1: 5′- CAGGAAATTGGAGAACTGAAGG -3′，

前引物A2: 5′- CAGGAAATTGGAGAACTGAAGT -3′,

后引物C: 5′- GTTACCAGAAAGATCTAGTTTTACAATGG -3′，

其中，所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列，所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列。

3.根据权利要求2所述的鉴定抗疫病辣椒的方法，其特征在于，所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。