CN115191617A - 一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法，其包括如下步骤：制备疏水化合物和甘油的脂质溶液、制备包含胶原肽的水相、制备水合的脂质溶液、挤出、海藻酸钠修饰。本发明制备的海藻酸钠稳定的降血糖羊胶原肽脂质体，通过DPP‑IV抑制活性发挥降血糖功能，实现胶原肽的DPP‑IV抑制活性和胶原肽降血糖活性的保证，同时原料的采用使得更加适宜添加进食品中，本发明中海藻酸钠的进行包埋，包埋效果和缓释效果好。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及到一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法。
背景技术
随着人们生活节奏的加快，不少上班族的不良饮食导致了很多慢性病病人的产生。目前高血糖患者在中国居民中的人数达到了1.1亿，并且有着上升的趋势，因此日前功能性食品和保健食品受到了很多慢性病患者的青睐，2021年中国保健食品和功能性食品产业达到了2万亿的水平，其中蛋白质、氨基酸与肽类为需求量最大的品种。
降血糖胶原肽就是一种具有降血糖功能的功能性食品。但是它在口服进入生物体后，会经历一系列屏障，这些屏障可以使它们失活，从而使它们的生物作用下降。具体屏障为：①胶原肽在口服后经历的第一个屏障为胃部的低pH环境和胃蛋白酶使得肽被降解失活；②第二道屏障为肠道中多种消化酶的水解，其中包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等；③第三道屏障为小肠上皮细胞膜上缺乏较大分子量胶原肽的载体，故需要经过酶解为二肽、三肽才能通过细胞膜。故直接口服降血糖胶原肽，其生物利用率很低，所以现在急需一种载体能够有效提高降血糖胶原肽的生物利用率。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法，其包括如下步骤：
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取磷脂类物质，溶于甘油中，然后搅拌均匀，制得脂质黄色溶液；
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于水中；然后将胶原肽溶液搅拌使胶原肽粉末完全溶解，过滤除去固体杂质；
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合搅拌形成均匀的水合的脂质溶液；
挤出：将上述水合的脂质溶液通过挤出循环使得初步得到胶原肽脂质体；
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，制备包含胶原肽的水性中，将溶液的pH调节至7.0。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，磷脂类物质包括液态磷脂、大豆磷脂、大豆磷脂酰胆碱中的一种或几种。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，制备包含胶原肽的水相中，加水量和磷脂类物质的质量比为5～20:1。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，制备包含胶原肽的水相中，加水量和磷脂类物质的质量比为10:1。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，挤出中，挤出循环的次数为1～5。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，挤出中，挤出循环的次数为3。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，海藻酸钠的添加量为0.1～0.5％。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，海藻酸钠的添加量为0.3％。
作为本发明所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法的一种优选方案，其包括，制备疏水化合物和甘油的脂质溶液中，疏水化合物和甘油的质量比为3:1。
本发明的有益效果为：
本发明制备的海藻酸钠稳定的降血糖羊胶原肽脂质体，降血糖活性是通过DPP-IV抑制活性发挥降血糖功能，脂质体既不影响胶原肽的DPP-IV抑制活性，又使胶原肽在口服中减少人体消化三道屏障的影响而保持降血糖活性。
本发明采用甘油代替胆固醇作为膜固定剂，在脂质体中作为磷脂的溶媒，分子层面上可以与磷脂形成多个氢键，插进磷脂分子膜之间，加强磷脂分子之间的联结，加固脂质双分子层膜，降低膜流动；宏观上由于其高粘度的特点，加入到脂质体中能有效降低膜流动，减少药物渗透，提高了普通脂质体三到四倍的粘稠度。而且采用甘油作为膜稳定剂，对比传统脂质体中添加胆固醇调节磷脂分子膜的流动性，甘油对人体的副作用更小，更适合添加进食品中。
本发明采用海藻酸钠对脂质体进行修饰，在脂质体中添加，对比普通脂质体，提高了脂质体粘稠度十倍左右，能有效降低膜流动，减少药物泄露，对于包封率有着10％左右的提升。分子层面上可以通过氢键、离子键等化学键与脂质体表面基团作用，提高脂质体的稳定性，改善被包埋活性的缓释效果两到三倍左右。
本发明所使用的挤出器挤出法，对比传统均质机、超声均质，挤出器挤出法产生能量小，对磷脂分子膜的损伤低，对胶原肽的破坏小。
本发明将降血糖羊胶原肽制备成为脂质体，保证了口服方式服用胶原肽的生物活性，使可作为保健品等使用范围，扩大了的应用范围，实现了资源的充分利用，具有良好的应用前景。
本发明使用的制备方法和实际的操作方法简单，易于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例4中测定不同温度下，zeta电位随着保存时间的变化而变化的数值；
图2为不同保存温度下，平均粒径随着保存时间的变化而变化的数值；
图3为包封率随着保存时间的变化而变化的数值；
图4为PDI随着保存时间的变化而变化的数值；
图5为随着时间的变化，胶原肽水溶液和胶原肽脂质体溶液的胶原肽生物活性；
图6为随着时间的变化，胶原肽水溶液和胶原肽脂质体溶液中DPP-IV抑制活性的变化；
图7为不同海藻酸钠添加量下，胶原肽的生物利用率随时间的变化情况；
图8为显微镜下100nm标尺下本发明制得海藻酸钠脂质体群；
图9为显微镜下500nm标尺下本发明制得单个海藻酸钠脂质体；
图10为本发明制得的胶原肽脂质体的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例中使用的液态磷脂为购自中创工程技术有限公司的液态磷脂；胶原肽为申请号为CN2020110865145中制备的羊皮胶原蛋白肽粉末；大豆磷脂为中创工程技术有限责任公司生产的大豆磷脂粉末磷脂；大豆磷脂胆碱为lipid生产的
90G。
实施例1
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取液态磷脂，将液态磷脂溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中液态磷脂、甘油的投料质量比为3:1(g/g)；制得脂质黄色溶液。
制备包含胶原肽的水相：按照磷脂药物比为2:1(g/g)称取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中胶原肽溶液中加水量与液态磷脂的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃，100rpm下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体·混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，两种液体按照体积比1:1的比例在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例2
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂，将大豆磷脂溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂、甘油的投料质量比为3:1(g/g)；制得脂质黄色溶液。
制备包含胶原肽的水相：按照磷脂药物比为2:1(g/g)称取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，两种液体按照体积比1:1的比例在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例3
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)；制得脂质黄色溶液。
制备包含胶原肽的水相：取市售胶原肽粉末溶于去离子水中，按照磷脂药物比为2:1(g/g)称取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，两种液体按照体积比1:1的比例在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例4
将实施例1～3中制得的海藻酸钠修饰的降血糖胶原肽脂质体收集，用去离子水稀释100倍，用纳米激光粒度检测仪进行粒径及PDI、zeta电位测定。每个样品做三个重复，机器测量三组平行，三次重复取平均值。
粒径及PDI、zeta电位测定方法为：使用美国布鲁克海文仪器公司生产的ZetaPALS进行粒径及PDI、zeta电位测定。
表1实施例1～3中不同壁材对海藻酸钠修饰的降血糖胶原肽脂质体粒径以及PDI的影响
由表1可得，不同疏水性化合物对脂质体粒径和PdI有明显影响，大豆磷脂酰胆碱纯度由小到大顺序为：液态磷脂＜大豆磷脂＜大豆磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱纯度越高，其粒径和PdI值越小，脂质体越均一、稳定。当大豆磷脂酰胆碱的含油量较高时(液态磷脂)，磷脂分子容易凝聚成较大粒子，不利于分散，故粒径较大，PdI也较大。综上所述，结合平均粒径以及PdI的大小，疏水性化合物优选为例3中的大豆磷脂酰胆碱。
考察实施例3中脂质体的贮藏稳定性，将实施例3中制备的脂质体分别用锡纸包裹避光放在4℃±0.5℃、25℃±0.5℃、37℃±0.5℃三个温度下的恒温恒湿箱中保存，模拟冷藏冰箱、常温以及贮藏加速实验，每5天测定一次，拍摄样品，以及测定样品平均粒径、PdI、zeta电位和包封率。粒径、Pdi和zeta电位的测定方法如实施例4中所述，测定包封率的方法如下：
取实施例3中制得的海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体各0.5ml，置于Millipore超滤离心管(截留分子量100000Da)的顶端套管内，放入离心机7000r/min离心15min，取下顶端套管，吸取管内液体，测定液体中胶原肽含量，得到游离胶原肽浓度，再利用公式：E％＝(x-x0)/x×100％测定实例中脂质体包封率，公式中E％为胶原肽脂质体的包封率，x为制备脂质体中胶原肽总量，x0为未被脂质体包封的游离胶原肽的总量。
得到的zeta电位、平均粒径、包封率和PdI随保存时间的变化的数据记录在图1～4中。
根据图1～4中可知，4℃下脂质体在40天内粒径上升不超过30nm，PdI始终在0.3以下，包封率变化不超过8％，zeta电位小于-30mV，说明冷藏条件下脂质体的贮藏稳定性较好，形态稳定，包埋胶原肽泄露较少。
实施例3中制得的产物包封率在制备完成后能够达到60％或者以上，随着保存时间的增长，虽然随着时间的增长，但是在较低的保存温度(4℃)下，能够维持包封率较高，在常温或者较高的保存温度(37℃)下，依然能够维持较好的包封率。
考察实施例3中脂质体的胃肠道消化稳定性，脂质体的体外稳定性通过所包封的胶原肽对模拟胃肠道pH环境的耐受性和抗消化道酶降解能力来评价。测定脂质体体外模拟胃肠道消化稳定性的方法如下：
配制模拟人工胃液(SGF，含0.32％胃蛋白酶，pH1.2)和模拟人工肠液(SIF，含1％胰蛋白酶，pH 6.8，胆盐，0.5M CaCl2和7.5M NaCl)。将稀释两倍的同等肽浓度的5mL载胶原肽脂质体或胶原肽溶液加入到5mL人工胃液中，37℃，100rpm振荡孵育。在特定的时间间隔取样500μl，立即用0.1MNaOH终止降解反应；1小时后按1:1(v/v)加入人工肠液处理2小时，且在特定的时间间隔取样500μl。所有样品随后用TritonX-100处理释放出被包封的胶原肽，通过BCA分析残留的胶原肽浓度，绘制残留胶原肽的生物利用率对孵育时间曲线图，DPP-IV抑制活性对孵育时间曲线图。生物利用率(％)＝c/c0×100％，c：某时间点的胶原肽浓度；c0：初始胶原肽浓度；生物利用率表示产品在胃肠道消化过程中，其胶原肽活性的变化情况，即可以在生物体内被利用的胶原肽比例。其中，DPP-IV抑制活性测定采用试剂盒进行测定。
得到的胃肠道消化过程中生物利用率和DPP-IV抑制活性随时间变化数据记录在表5、6中。
根据图5～6可知，经过脂质体包埋后的脂质体，比起游离胶原肽水溶液，其胶原肽的生物利用率上升，DPP-IV抑制活性上升，原因是脂质体的磷脂双分子层保护了胶原肽不被胃肠道中的胃酸以及酶破坏失活，说明制备胶原肽脂质体对于胶原肽有着保护不被胃肠道消化、保护DPP-IV抑制活性不被破坏的作用。
实施例5
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取自制胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为5:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例6
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取自制胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例7
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取市售胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为20:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例8
将实施例5～7中制得的海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体收集，用去离子水稀释100倍，用纳米激光粒度检测仪进行粒径、PDI以及zeta电位测定。每个样品做三个重复，机器测量三组平行，三次重复取平均值，并测定包封率以及包载量，包载量的计算方法如下：
脂质体的包载量是基于脂质体包封率计算得到，表征的是单位质量脂质体可包埋的胶原肽的质量，包载量的计算公式如下：Z理论(mg/g)＝x/m；Z实际(mg/g)＝Z理论×E；公式中x为制备脂质体中胶原肽总量，m为脂质体质量，得到的数据记录在表2中。
表2实施例5～7中胶原肽溶液中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比对海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体中包封率、包载量、粒径、PdI以及zeta电位的影响
根据表2可得，实施例5～7中胶原肽溶液中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比对制备的海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体的包封率、粒径、PdI有着显著影响，随着质量比的升高，包封率以及包载量均呈现先增大后减小的趋势，在10:1时，包封率和包载量最高；同理，平均粒径以及PdI均呈现下降的趋势。而质量比对zeta电位影响不大，均处于溶液稳定的状态(zeta<-30)。故水合的脂质溶液中胶原肽溶液中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比优选为10:1。
实施例9
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下维持50rpm将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过1次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例10
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下维持50rpm将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例11
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过5次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例12
将实施例9～11中制得的海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体收集，用去离子水稀释100倍，用纳米激光粒度检测仪进行包封率、粒径、PDI以及zeta电位测定。每个样品做三个重复，机器测量三组平行，三次重复取平均值，将得到的数据记录在表3中。
表3实施例9～11中挤压循环次数对海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体中包封率、粒径、PdI以及zeta电位的影响
从表3可以得到，随着挤压次数的增加，包封率的改善效果呈现先上升后下降、平均粒径，Pdi的改善效果出现下降的趋势，在考虑包封率、包载量、平均粒径、PdI、Zeta电位的综合性能，并且结合循环次数增加的时间和成本，对于循环次数的优选为3。
实施例13
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例14
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.3％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例15
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取大豆磷脂酰胆碱，将大豆磷脂酰胆碱溶于甘油中，然后在室温下搅拌30分钟，得到均匀的脂质黄色溶液；其中大豆磷脂酰胆碱、甘油的投料质量比为3:1(g/g)。
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于去离子水中，其中加水量与大豆磷脂酰胆碱的质量比为10:1(g/g)；然后将胶原肽溶液于20℃下搅拌10分钟以至胶原肽粉末完全溶解，形成澄清溶液。然后在常温下将得到的澄清溶液通过孔径为0.22μm水膜，除去固体杂质；然后调节水相的pH至7.0。
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合，并在20℃下搅拌30分钟，形成均匀的水合的脂质溶液。
挤出：将上述水合的脂质溶液在25℃下，通过3次挤出循环(手动挤压通过100nm聚碳酸酯膜)。通过挤出循环后脂质体粒径处于80～120nm左右，初步得到胶原肽脂质体。
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.5％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下维持50rpm混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
实施例16
将实施例13～15中制得的海藻酸钠修饰的降血糖胶原肽脂质体收集，用去离子水稀释100倍，用纳米激光粒度检测仪进行粒径及PDI、zeta电位、DPP-IV抑制活性测定。每个样品做三个重复，机器测量三组平行，三次重复取平均值。
将得到的数据记录在表4中。
表4实施例13～15中海藻酸钠添加量对海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体中包封率、包载量、粒径、PdI、zeta电位和DPP-IV抑制活性的影响
根据表4可得，实施例13～15中海藻酸钠添加量对制备的海藻酸钠修饰的胶原肽脂质体的粒径、PdI有着显著影响，随着海藻酸钠添加量的升高，包封率、包载量、平均粒径、PdI、zeta电位绝对值均呈现上升的趋势。原因是随着海藻酸钠添加量的上升，其包裹在脂质体上的厚度上升，导致粒径和PdI上升，包封率上升是因为而海藻酸钠添加量对DPP-IV抑制活性影响不大，说明海藻酸钠的修饰对胶原肽本身DPP-IV抑制活性的影响程度不大。
基于海藻酸钠添加量的提高，需要使用更多的海藻酸钠，并且相对而言，更高的海藻酸钠添加量也需要更多的处理时间，在实施例14中平均粒径为249.5nm，继续增加海藻酸钠含量会导致平均粒径更大的情况下，并且在海藻酸钠添加量进一步提升的情况下，会导致PdI超过0.3，结合如上考虑，优选实施例14中使用的0.3％为海藻酸钠的浓度优选。·
实施例例13～15中脂质体的胃肠道消化稳定性，脂质体的体外稳定性通过所包封的胶原肽对模拟胃肠道pH环境的耐受性和抗消化道酶降解能力来评价，图7表示不同海藻酸钠添加量对脂质体在胃肠道中的生物利用率的影响。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
制备疏水化合物和甘油的脂质溶液：称取磷脂类物质，溶于甘油中，然后搅拌均匀，制得脂质黄色溶液；
制备包含胶原肽的水相：取胶原肽粉末溶于水中；然后将胶原肽溶液搅拌使胶原肽粉末完全溶解，过滤除去固体杂质；
制备水合的脂质溶液：将胶原肽溶液与上述制备的脂质黄色溶液进行混合搅拌形成均匀的水合的脂质溶液；
挤出：将上述水合的脂质溶液通过挤出循环使得初步得到胶原肽脂质体；
海藻酸钠修饰：在常温下将胶原肽脂质体混悬液按照20滴每分钟的速度滴加到0.1％海藻酸钠水溶液中，按照体积1:1在常温下混合搅拌2小时，再在4℃下静置12小时，即得到海藻酸钠稳定的胶原肽脂质体。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的降血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述制备包含胶原肽的水性中，还包括将溶液的pH调节至7.0。
3.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述磷脂类物质包括液态磷脂、大豆磷脂、大豆磷脂酰胆碱中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述制备包含胶原肽的水相中，所述加水量和磷脂类物质的质量比为5～20:1。
5.根据权利要求1或4中所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述制备包含胶原肽的水相中，所述加水量和磷脂类物质的质量比为10:1。
6.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述挤出中，挤出循环的次数为1～5。
7.根据权利要求1或6所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述挤出中，挤出循环的次数为3。
8.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠的添加量为0.1～0.5％。
9.根据根据权利要求1或8所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠的添加量为0.3％。
10.根据权利要求1所述的海藻酸钠稳定的稳血糖胶原肽脂质体的制备方法，其特征在于：所述制备疏水化合物和甘油的脂质溶液中，所述疏水化合物和甘油的质量比为3:1。
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