CN115181655A - 一种用于pcr扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法，涉及PCR扩增反应装置技术领域，该微流控卡盒包括DNA加样孔、加杂交试剂孔、PCR仓和杂交仓；PCR仓包括低温恒温区、中温恒温区、高温恒温区、循环流道、循环动力装置、加样通道、排气通道和出料通道；该方法是先由DNA加样孔加入反应物料，在低温恒温区预热，其后循环动力装置反转使反应物料进入高温恒温区升温，其后循环动力装置正转使反应物料在循环流道内循环流动，完成PCR进程；反应完成后产物进入杂交仓，并经加杂交试剂孔加入试剂自动完成杂交反应。该微流控卡盒空间利用率高，可自主控制PCR扩增项目的循环时间和循环次数，可精确定量PCR产物，有利于自动开展杂交反应。

Description

一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及涉及PCR扩增反应装置技术领域，具体为一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法。

背景技术

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：其中变性是指模板DNA经加热至95°C左右一定时间后使DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链；退火是指将变性过程形成的单链降温至55°C左右，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；延伸是指在特定温度下（一般72°C左右），DNA模板和引物结合物按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环上述的变性-退火-延伸三个步骤，即可获得更多的半保留复制链，而这种新链又可成为下次循环的模板，由此最终实现DNA片段的放大扩增。

反向斑点杂交（Reverse Dot Blot, RDB）技术是先将待用的探针依次点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将待测的DNA样本（一般是经PCR特异性扩增的产物，在PCR引物5'端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素）与探针杂交，这样待检样本扩增产物就会与具有同源序列的探针特异地结合，经洗涤去除未结合的产物DNA样本。由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号，这样单次反应就可以同时筛检样本中的多个靶标，省时省力且节省试剂耗材。RDB技术以其硬件成本低、读取结果方便，已在医学诊断领域得到了广泛的应用，如基因分型检测、遗传疾病检测、病原体检测、肿瘤基因检测等。

现有技术中，微流控PCR芯片一般包括三个恒温区和微通道等组成，微通道按反应需要多次循环穿设于三个恒温区内，通过向微通道的入口注入样本和反应液，其在微通道内流动时即循环穿过三个恒温区完成上述循环过程，最终由微通道的出口排出。该微流控PCR芯片中的微通道通常为单流道设置，即其是通过单一流道循环穿过三个恒温区来实现上述三个基本反应的循环，在实际应用中主要存在以下弊端：

其一、不同扩增项目在反应时，循环次数不同。现有技术中的微流控PCR芯片需要根据项目定制其循环穿过三个恒温反应区的次数，不同项目的PCR芯片无法通用。对于循环次数要求多的项目，定制的微流控PCR芯片整体体积相对庞大，空间利用率低，同时恒温区的设计也相对庞大复杂，恒温区的恒温控制以及不同恒温区的温度隔离也相对困难。

其二、现有技术中的微流控PCR芯片为单一的微通道循环穿过三个恒温区的形式，其循环动力来自于微通道入口的注入，整个循环时间都由该注入动力确定，无法对每个单次循环时间进行精确控制，无法通过反应时间的控制来优化反应效果。

其三、由于现有技术中的微流控PCR芯片的循环动力来自于微通道的入口注入，其难以实现产物的精确定量，无法自动完成定量产物的杂交检测。而传统的RDB技术属于开放式杂交，PCR反应结束后需开盖并将产物手动转移至反应芯片中，易造成整个环境的气溶胶累积和污染，从而产生假阳性结果；且反应过程中手工操作环节过多，导致结果稳定性较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，包括DNA加样孔、加杂交试剂孔、PCR仓和杂交仓；所述PCR仓包括低温恒温区、中温恒温区、高温恒温区、循环流道、循环动力装置、加样通道、排气通道和出料通道；所述循环流道包括第一流道、第二流道和第三流道，所述第一流道设置于所述低温恒温区，所述第二流道设置于所述中温恒温区，所述第三流道设置于所述高温恒温区，所述第一流道的一端与所述第二流道的一端连通，所述第二流道的另一端与所述第三流道的一端连通，所述第三流道的另一端与所述第一流道远离所述第二流道的一端连通；所述加样通道的一端与所述第一流道连通，所述加样通道的另一端与所述DNA加样孔连通，所述加样通道上设置有第一开闭装置；所述排气通道的一端与所述第一流道连通，所述排气通道上设置有第二开闭装置；所述第一流道与第三流道之间设置有第三开闭装置；所述出料通道的一端与所述第三流道连通，所述出料通道的另一端与所述杂交仓连通，所述出料通道上设置有第四开闭装置；所述加杂交试剂孔与所述杂交仓连通，所述加杂交试剂孔与所述杂交仓之间设置有第五开闭装置；所述循环动力装置可驱动所述循环流道内的物料正向或反向流动。

在具体制作时，该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒包括盖片和基板，所述盖片的底部加工有凹槽，所述盖片与所述基板扣合使所述凹槽形成所述循环流道以及加样通道、排气通道和出料通道。

进一步的，所述第一开闭装置、第二开闭装置、第三开闭装置、第四开闭装置和第五开闭装置均选用膜泵结构。

进一步的，所述PCR仓基本呈圆盘形，还包括隔热层，所述隔热层将所述芯片结构以其圆心为中心等分成依次排列的第一扇区、第二扇区、第三扇区和第四扇区，所述第一流道设置于所述第一扇区内，所述第二流道设置于所述第二扇区内，所述第三流道设置于所述第三扇区内，所述第二开闭装置、第三开闭装置和第四开闭装置均设置于所述第四扇区内。

上述循环动力装置有如下实现形式：

其一，所述循环流道上开设有两个动力孔，所述循环动力装置选用外接动力装置，所述外接动力装置与两个所述动力孔均连通。

优选的，所述外接动力装置选用蠕动泵。

优选的，两个所述动力孔均设置于所述第一流道与第三流道之间。

其二，所述循环动力装置由若干膜泵结构组成，所述循环动力装置的若干膜泵结构均设置于所述循环流道上。

优选的，所述循环动力装置包括第五膜泵和第六膜泵，所述第五膜泵设置于所述第一流道与第二流道相连通的位置，所述第六膜泵设置于所述第二流道与第三流道相连通的位置。

上述用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法，包括如下步骤：

S1、打开第一开闭装置和第四开闭装置，将定量的样本和多重PCR反应液从DNA加样孔注入第一流道，其后关闭第一开闭装置和第四开闭装置，使样本和多重PCR反应液在低温恒温区内预热；

S2、打开第三开闭装置，先开启循环动力装置使其反向运动，带动样本和多重PCR反应液进入高温恒温区中的第三流道，并等待特定时间；其后循环动力装置正向运动，带动循环流道内的液体按“第一流道-第二流道-第三流道-第一流道……”的方向循环流动，循环特定次数完成PCR反应后，关闭第三开闭装置和循环动力装置；

S3、打开第四开闭装置和第二开闭装置，并打开循环动力装置，驱动循环流道内的反应后的液体由出料通道排出至杂交仓；

S4、打开第五开闭装置，由加杂交试剂孔向杂交仓内加入反应试剂，完成杂交过程。

本发明的有益效果是：

该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒包括加样孔、加杂交试剂孔、PCR仓和杂交仓。其中PCR仓设置有三个恒温区、循环流道和循环动力装置，在进行PCR反应时通过循环动力装置驱动循环流道内的物料循环流动，以此实现循环通过三个恒温区完成PCR反应进程。液体通过同一循环流道多次循环，相比于现有技术空间利用率高，有利于实现芯片结构的微型化，也更有利于实现恒温控制保证反应效果；同时该芯片结构通用性强，可应用于不同循环次数以及循环时间PCR反应项目；还能实现高精度的循环控制，对每个单次循环时间进行精确控制，通过反应时间的控制来优化反应效果。上述PCR进程采用循环动力装置驱动物料在循环流道内循环流动的形式，可确定每次参与PCR处理的样本量，可对产物进行准确的定量控制，有利于其进入杂交仓后实现自动杂交检测过程。

设置有加样通道、排气通道和出料通道，循环动力装置可正反转运转，在使用时可先经低温恒温区预热，再进入高温恒温区提升温度，其后再进入正常循环进程，有利于保持温度平稳过度，提升反应效果。

整个卡盒结构由盖片和基板扣合制成，各开闭装置创新型的按膜泵结构直接制成，整体结构制作容易方便，集成度高，空间利用率高，满足微型化的使用需求。

上述循环动力装置提供两种优选形式：其一、在循环流道上直接设置若干膜泵结构，利用各膜泵结构的有序控制，实现物料的连续输送，其制作方便，集成度高，空间利用率高，对因设备限制而空间狭小无法设置外接动力的场景下使用尤具优势；其二、在循环流道上开设两个动力孔，外接精密蠕动泵之类的动力装置与两个动力孔均连通提供循环动力，其可实现循环动力的精准控制，有利于对每个单次循环时间进行精确控制，通过反应时间的精确控制来优化反应效果。

上述PCR仓基本呈圆盘形，通过隔热层将整体芯片结构等分成四个扇区，低温恒温区、中温恒温区和高温恒温区设于其中依次相邻的三个扇区，动力孔以及相关开闭装置设置于第四扇区。按上述设置可方便的将各恒温区通过隔热层隔开，可有效减少热传导，有利于各恒温区的温度控制；设于第四扇区的个开闭装置、动力孔以及相关外接动力装置引起的降温对PCR反应过程反而有利。

附图说明

图1为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒的内部结构示意图；

图2为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例1的结构示意图；

图3为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例1中盖片的结构示意图；

图4为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例1中底板的结构示意图；

图5为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例2的结构示意图；

图6为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例2中盖片的结构示意图；

图7为本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒实施例2中底板的结构示意图；

图8为膜泵结构的示意图；

图9为膜泵结构连续输送的原理示意图。

图中，1-低温恒温区，2-中温恒温区，3-高温恒温区，4-第一流道，5-第二流道，6-第三流道，7-加样通道，8-排气通道，9-出料通道，10-第一开闭装置，11-第二开闭装置，12-第三开闭装置，13-第四开闭装置，14-盖片，15-基板，16-膜片，17-第五膜泵，18-第六膜泵，19-外接动力装置，20-动力孔，21-隔热层，22-DNA加样孔，23-加杂交试剂孔，24-杂交仓，25-第五开闭装置。

具体实施方式

如图1所示，一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，包括DNA加样孔22、加杂交试剂孔23、PCR仓和杂交仓24。该PCR仓包括低温恒温区1、中温恒温区2、高温恒温区3、循环流道和循环动力装置。

上述三个恒温区分别对应于PCR的“变性-退火-延伸”三个基本反应步骤，其中低温恒温区1设定温度为45-55°C，中温恒温区2的设定温度为72°C左右，高温恒温区3的设定温度为95°C左右。上述循环流道包括第一流道4、第二流道5和第三流道6，第一流道4设置于低温恒温区1，第二流道5设置于中温恒温区2，第三流道6设置于高温恒温区3，第一流道4的一端与第二流道5的一端连通，第二流道5的另一端与第三流道6的一端连通，第三流道6的另一端与第一流道4远离第二流道5的一端连通。上述循环动力装置可用于驱动该循环流道内的物料循环流动。

在PCR仓进行DNA扩增反应时，在向循环流道内注入样本和反应液后，可在循环动力装置的驱动下按“第一流道4-第二流道5-第三流道6-第一流道4……”的方向循环流动，在三个恒温区内循环完成“变性-退火-延伸”的三个反应步骤，实现DNA片段的放大扩增。

在PCR扩增项目中，不同项目在反应时，单次循环时间不同，需要的循环次数也有所不同。例如，致病弧菌、食源性致病菌、致泻微生物（细菌）、致泻大肠分型的最短单循环时间是60秒，而致泻微生物（病毒）、即食果蔬、生殖道病原菌的最长单循环时间为90秒；致病弧菌、食源性致病菌、致泻微生物（细菌）、11种动物源、非预包装食品、食源性植物过敏原、转基因（大豆、水稻、玉米、油菜）的最少循环次数是30次，而生殖道病原菌的最长循环次数达到40次。现有技术中的微流控PCR芯片所采用的单流道循环穿过三个恒温区的结构形式，其能实现的循环次数在设计之初即以确定，对于不同循环次数要求的项目，现有的PCR芯片无法通用，在生产实践中需要分别进行定制。尤其是对于循环次数要求较多的项目，其微通道需要更多次的穿越各恒温区，使得整个微流控PCR芯片整体体积增大，空间利用率低，在微型化芯片结构设计上一直存在痛点。同时这种大芯片结构的恒温区设计也相对庞大和复杂，恒温区的恒温控制以及不同恒温区的温度隔离也相对困难，常对反应效果造成不良影响。在实际应用中，各恒温区的温度往往存在一定范围的波动而影响反应效果，由于现有技术中的微流控PCR芯片通常为单一的微通道循环穿过三个恒温区的形式，其循环动力来自于微通道入口的注入，循环时间都由该注入动力确定，各单次循环时间趋于相同（若通过改变注入动力来调节循环时间将会对微通道内各段物料都造成影响），无法单独对每个单次循环时间进行精确控制，无法通过反应时间的精确控制来优化反应效果；同时这种由微通道入口注入提供动力的形式也无法实现精准定量处理，现有技术中PCR反应装置难以与杂交反应装置集成以实现自动控制。

本发明一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒中，PCR仓内的反应过程由循环动力装置进行驱动，使物料在同一循环流道内循环流动，其结构简单紧凑，空间利用率高，满足微型化设计需求；可根据需要自由选择循环次数和单次循环时间，能适用于不同循环次数和循环速度的项目，通用性强；且每次循环时间可单独控制，可通过反应时间的控制来对恒温区的温度波动进行补偿，优化反应效果。

该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒还包括加样通道7、排气通道8和出料通道9；加样通道7的一端与第一流道4连通，加样通道7的另一端与DNA加样孔22连通，加样通道7上设置有第一开闭装置10；排气通道8的一端与第一流道4连通，排气通道8上设置有第二开闭装置11；第一流道4与第三流道6之间设置有第三开闭装置12；出料通道9的一端与第三流道6连通，出料通道9的另一端与杂交仓24连通，出料通道9上设置有第四开闭装置13；加杂交试剂孔23与杂交仓24连通，加杂交试剂孔23与杂交仓24之间设置有第五开闭装置25；所述循环动力装置可驱动所述循环流道内的物料正向或反向流动。

该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒在使用时按如下步骤进行：

S1、打开第一开闭装置10和第四开闭装置13，利用仪器管路和移液臂将定量的样本和多重PCR反应液从DNA加样孔22推入第一流道4（循环流道内的空气通过出料通道9、第四开闭装置13排出），加样完成后关闭第一开闭装置10和第四开闭装置13。使样本和多重PCR反应液在低温恒温区1内预热。

S2、打开第三开闭装置12，先开启循环动力装置使其反向运动，带动样本和多重PCR反应液进入高温恒温区3中的第三流道6，并等待特定时间；其后循环动力装置正向运动，带动循环流道内的液体按“第一流道4-第二流道5-第三流道6-第一流道4……”的方向循环流动。循环特定次数完成PCR反应后，关闭第三开闭装置12和循环动力装置。

S3、打开第四开闭装置13和第二开闭装置11，并打开循环动力装置，驱动循环流道内的反应后的液体由出料通道9排出至杂交仓24（排液过程中，外界空气由第二开闭装置11、排气通道8进入循环流道）。

S4、在杂交仓24内自动完成杂交、酶标、显色、清洗过程，上述每个过程的试剂由仪器从杂交加试剂孔23加入，加入试剂时需打开第五开闭装置25；上述每个过程产生的废液由杂交仓24底部的排液孔排出。

现有技术，PCR反应通常是直接进入循环进程，一般由低温恒温区1进入，外界物料在进入初期难以快速达到反应要求的温度，而若直接由其他恒温区进入循环，又将存在急速升温过程，于反应不利。本发明的用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒在使用时可先经低温恒温区1预热，再进入高温恒温区3提升温度，其后再进入正常循环进程，有利于保持温度平稳过度，提升反应效果。现有技术中，PCR反应的循环动力来自于芯片微通道的注入动力，其一般难以实现定量处理，本发明的用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒由于采用循环动力装置内部驱动液体在循环通道内流动的形式，其在使用时可采用定量注入样本和反应液，整个处理过程中均只该定量的样本和反应液参与处理，由此产物亦可精准定量，有利于实现后续的自动开展杂交试验（例如在实际应用时，膜芯片核酸分子杂交仪可通过试剂针将试剂盘中各样本和杂交试剂分装至24个或者更多卡盒中，自动完成24个或者更多样本的PCR和杂交反应）。

在具体实施时，如图2-图7所示，该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，包括盖片14和基板15，在盖片14的底部加工有凹槽，该凹槽的形状与上述循环流道以及加样通道7、排气通道8和出料通道9的形状相对应，当盖片14与基板15扣合使后，该凹槽处即直接形成上述的循环流道以及加样通道7、排气通道8和出料通道9。同理，DNA加样孔22，加杂交试剂孔23可通过在盖片14上的对应位置预先加工空洞，杂交仓24可通过在盖片14与基板15的对应位置加工仓体，在盖片14与基板15扣合时即形成DNA加样孔22、加杂交试剂孔23和杂交仓24，加工制作过程相对方便。

上述第一开闭装置10、第二开闭装置11、第三开闭装置12、第四开闭装置13和第五开闭装置25可选用任何能实现通道连通或断开状态切换的装置结构。在本实施例中，上述各开闭装置均选用膜泵结构。

所述膜泵结构是利用膜片正负压切换来实现通道的断开与连接，其结构如图8所示。在设置膜泵结构的位置，盖片14上的凹槽加工呈的断开状态，对应该断开状态凹槽的地方，基板15上加工有通孔，盖片14与基板15扣合时，两者之间设置有膜片16。当通过上述通孔向膜片16施加正压（例如通过通孔向膜片方向充气）时，膜片16中部被压紧在盖片14的底面，此时盖片14上的凹槽形成的通道处于断开状态；当通过上述通孔向膜片16施加负压（例如通过通孔对膜片吸气）时，膜片16中部被向通孔方向吸出，使得膜片16顶面中部与盖片14的底面之间形成间隙，盖片14上断开的凹槽通过该间隙连通。

本实施例中，第一开闭装置10、第二开闭装置11、第三开闭装置12、第四开闭装置13和第五开闭装置25均按上述膜泵结构直接制作，即在对应位置使盖片14上的凹槽断开，在基板15开设通孔，并于该位置处的盖片14和基板15之间设置膜片16。通过以上方式直接形成上述开闭装置，整个制作过程简单方便，无需额外对开闭装置进行配置，有利于提高空间利用率。同时上述膜泵结构一致，可在外部设置一抽吸装置（例如缸筒活塞式抽吸缸），通过带控制阀的管路分别与基板15的各通孔连通，对每个开闭装置进行控制，体现集成化特点，实现自动控制，整个控制过程亦相对简便。

上述循环动力装置可选用多种结构形式，本实施例中提供两个优选实现方式：

实施例1，如图2-图4所示：

循环动力装置由若干前述的膜泵结构组成，循环动力装置的若干膜泵结构均设置于循环流道上，通过各膜泵的搭配控制，可以实现流体向两个方向上的连续运输，其原理如图9所示。图示从a至f为三个膜泵在连续运输下的状态示意，图中竖向箭头指示为三个膜泵受正压或负压的情况（箭头向上为正压、向下为负压），阴影为物料在流道内的位置。由图示可以看出，当有序控制各膜泵的正压或负压状态，即可实现物料在流道内的连续输送。

循环动力装置直接由上述膜泵结构的形式加工制成，具有制作简单方便的优势，无需外接其他动力设备，同时循环动力装置中用于连续输送的各膜泵结构亦可按前述方式，采用一抽吸设备直接实现自动控制，其集成度高，空间利用率高，对因设备限制而空间狭小无法设置外接动力的场景下使用尤具优势。

在具体实施时，为避免作为循环动力装置的膜泵结构对恒温区的温度控制造成影响，该循环动力装置包括第五膜泵17和第六膜泵18，第五膜泵17设置于第一流道与第二流道相连通的位置，第六膜泵18设置于第二流道与第三流道相连通的位置。此时前述第三开闭装置12的膜泵结构也参与提供循环动力，三者即构成如图9所示的三个膜泵结构形式。

实施例2，如图5-图7所示：

循环动力装置选用外接动力装置19。此时，循环流道上开设有两个动力孔20，外接动力装置19与两个动力孔20均连通，外接动力装置19从一个动力孔20抽取循环流道内的物料并从另一个动力孔20排入循环流道，以此提供循环动力。该外接动力装置19理论上可选用任何具备上述功能的装置，本实施例中，外接动力装置19选用蠕动泵，其动作连续，可提供连续的循环动力；优选为精密蠕动泵，可实现循环动力的精准控制，有利于对每个单次循环时间进行精确控制，通过反应时间的精确控制来优化反应效果。

在具体实施时，上述两个动力孔20均设置于第一流道4与第三流道6之间，循环反应时动力由第三流道6向第一流道4方向泵送，在反应进程看此处物料正是从高温恒温区3进入低温恒温区1，物料本身属于降温过程，将动力孔20设置于此处，物料由于经过外接动力装置19造成的温降并不会对PCR进程造成不良影响，反而有利于PCR循环进程。

进一步的，在具体实施时，该用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒中，PCR仓基本呈圆盘形，其在应用时整体封闭于仪器反应温控部件上，其上下两面均具有高效恒温温控的金属导体，用于形成各恒温区。其还包括隔热层21，该隔热层21将整体芯片结构以其圆心为中心等分成依次排列的第一扇区、第二扇区、第三扇区和第四扇区，第一流道4设置于第一扇区内，第二流道5设置于第二扇区内，第三流道6设置于第三扇区内，第二开闭装置11、第三开闭装置12和第四开闭装置13均设置于第四扇区内。第一扇区、第二扇区、第三扇区分别对应于低温恒温区1、中温恒温区2和高温恒温区3，设置成扇区的形式可方便的将各恒温区通过隔热层21隔开，同时在对恒温区进行分隔时充分考虑PCR反应的特点，使得温度相接近的恒温区之间由隔热层21隔开，而温度差距大的低温恒温区1和高温恒温区3之间除了隔热层21还设置有第四扇区进行隔离。由此可有效减少热传导，有利于各恒温区的温度控制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，包括DNA加样孔、加杂交试剂孔、PCR仓和杂交仓；

所述PCR仓包括低温恒温区、中温恒温区、高温恒温区、循环流道、循环动力装置、加样通道、排气通道和出料通道；

所述循环流道包括第一流道、第二流道和第三流道，所述第一流道设置于所述低温恒温区，所述第二流道设置于所述中温恒温区，所述第三流道设置于所述高温恒温区，所述第一流道的一端与所述第二流道的一端连通，所述第二流道的另一端与所述第三流道的一端连通，所述第三流道的另一端与所述第一流道远离所述第二流道的一端连通；

所述加样通道的一端与所述第一流道连通，所述加样通道的另一端与所述DNA加样孔连通，所述加样通道上设置有第一开闭装置；

所述排气通道的一端与所述第一流道连通，所述排气通道上设置有第二开闭装置；

所述第一流道与第三流道之间设置有第三开闭装置；

所述出料通道的一端与所述第三流道连通，所述出料通道的另一端与所述杂交仓连通，所述出料通道上设置有第四开闭装置；

所述加杂交试剂孔与所述杂交仓连通，所述加杂交试剂孔与所述杂交仓之间设置有第五开闭装置；

所述循环动力装置可驱动所述循环流道内的物料正向或反向流动。

2.根据权利要求1所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，包括盖片和基板，所述盖片的底部加工有凹槽，所述盖片与所述基板扣合使所述凹槽形成所述循环流道以及加样通道、排气通道和出料通道。

3.根据权利要求2所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述第一开闭装置、第二开闭装置、第三开闭装置、第四开闭装置和第五开闭装置均选用膜泵结构。

4.根据权利要求1-3所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述PCR仓基本呈圆盘形，还包括隔热层，所述隔热层将所述芯片结构以其圆心为中心等分成依次排列的第一扇区、第二扇区、第三扇区和第四扇区，所述第一流道设置于所述第一扇区内，所述第二流道设置于所述第二扇区内，所述第三流道设置于所述第三扇区内，所述第二开闭装置、第三开闭装置和第四开闭装置均设置于所述第四扇区内。

5.根据权利要求1-3所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述循环流道上开设有两个动力孔，所述循环动力装置选用外接动力装置，所述外接动力装置与两个所述动力孔均连通。

6.根据权利要求5所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述外接动力装置选用蠕动泵。

7.根据权利要求5所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，两个所述动力孔均设置于所述第一流道与第三流道之间。

8.根据权利要求1-3所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述循环动力装置由若干膜泵结构组成，所述循环动力装置的若干膜泵结构均设置于所述循环流道上。

9.根据权利要求8所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒，其特征在于，所述循环动力装置包括第五膜泵和第六膜泵，所述第五膜泵设置于所述第一流道与第二流道相连通的位置，所述第六膜泵设置于所述第二流道与第三流道相连通的位置。

10.根据权利要求1所述的一种用于PCR扩增和杂交反应的微流控卡盒及其使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、打开第一开闭装置和第四开闭装置，将定量的样本和多重PCR反应液从DNA加样孔注入第一流道，其后关闭第一开闭装置和第四开闭装置，使样本和多重PCR反应液在低温恒温区内预热；

S2、打开第三开闭装置，先开启循环动力装置使其反向运动，带动样本和多重PCR反应液进入高温恒温区中的第三流道，并等待特定时间；其后循环动力装置正向运动，带动循环流道内的液体按“第一流道-第二流道-第三流道-第一流道……”的方向循环流动，循环特定次数完成PCR反应后，关闭第三开闭装置和循环动力装置；

S3、打开第四开闭装置和第二开闭装置，并打开循环动力装置，驱动循环流道内的反应后的液体由出料通道排出至杂交仓；

S4、打开第五开闭装置，由加杂交试剂孔向杂交仓内加入反应试剂，完成杂交过程。

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