CN115181076B - 一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、细胞株、抗体、试剂和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、细胞株、抗体、试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫学检测技术领域，具体公开了一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、细胞株、抗体、试剂和试剂盒。所述半抗原的结构式如式(I)所示。所述抗原是由所述半抗原和载体蛋白通过偶联法偶联而形成的偶联物。所述细胞株是响应于所述抗原而生成的。所述抗体是响应于所述抗原而生成的。所述试剂包含所述抗体。所述试剂盒包含所述抗体。本申请提高了同时检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的特异性、灵敏度。
Figure 639309DEST_PATH_IMAGE001

Description

一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、 细胞株、抗体、试剂和试剂盒
技术领域
本申请涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、细胞株、抗体、试剂和试剂盒。
背景技术
精神***症是一组病因未明的慢性疾病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，临床上往往表现为症状各异的综合征，涉及感知觉、思维、情感和行为等多方面的障碍以及精神活动的不协调。患者一般意识清楚，智能基本正常，但部分患者在疾病过程中会出现认知功能的损害。病程一般迁延，呈反复发作、加重或恶化，部分患者最终出现衰退和精神残疾，但有的患者经过药物治疗与心理治疗后可保持痊愈或基本痊愈状态。
阿立哌唑是一种新型的非典型抗精神***症药物，其对多巴胺(Dopamine，DA)能神经***具有双向调节作用，是DA递质的稳定剂、且与D2、D3、5-HT1A和5-HT2A受体有很高的亲和力。阿立哌唑通过对D2和5-HT1A受体的部分激动作用及对5-HT2A受体的拮抗作用来产生抗精神***症作用的。阿立哌唑口服后血药浓度达峰时间为3～5小时,半衰期为48～68小时。
阿立哌唑及其代谢产物的结构式如下所示：
Figure BDA0003713682500000011
其中，脱氢阿立哌唑为阿立哌唑的主要活性代谢物。因此，在检测阿立哌唑的浓度时，需要同时测定阿立哌唑和脱氢阿立哌唑。但是，阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的浓度存在较大的个体间和个体内差异，并且精神疾病患者依从性差，不按时按量服用药物，耽误治疗；因此，监测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的浓度在判断阿立哌唑疗效、评价治疗效果、规避副反应以及个体化用药方案调整等方面发挥重要作用。
目前，测定阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的浓度多采用液相二级质谱(LC-MS-MS)法，但是LC-MS-MS法需要多次重复提取,具有操作繁琐、复杂、费时费力、通量低等的缺点，满足不了临床高通量、快速准确的检测需求。如申请号为CN201910630169.8的专利文献公开了一种检测血液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的方法，该方法是基于液质联用法测定血液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑，且需要对血液样本进行前处理。如申请号为CN201910671626.8的专利文献公开了一种血液中阿立哌唑药物浓度监测试剂盒及其检测方法，该检测方法是基于多维在线固相萃取液相色谱分析技术开发的。
如申请号为CN201380054988.3的专利文献公开了一种阿立哌唑半抗原的抗体及其用途，其制备的抗体可以同时识别阿立哌唑和脱氢阿立哌唑；但是，该专利文献并没有披露该抗体测试临床样本的特异性、以及对阿立哌唑无活性代谢物(Hydroxylation和N-Dealkylation阿立哌唑)的交叉反应性。同时，申请号为CN201911043578.4的专利文献公开了一种阿立哌唑人工抗原及其制备方法，其利用该人工抗原制备的抗体可以用于检测阿立哌唑含量，但是该专利文献也没有披露该的抗体对阿立哌唑代谢物的特异性。
因此，获得高质量阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗体，以建立特异性强、灵敏度高的阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的免疫学检测方法，对制定阿立哌唑个体化剂量方案，评价其临床疗效及安全性，有十分重要的意义。
发明内容
为了提高同时检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的特异性、灵敏度，本申请提供一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原、抗原、细胞株、抗体、试剂和试剂盒。
第一方面，本申请提供的一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原，所述半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003713682500000021
在一些实施方式中，所述半抗原的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0003713682500000031
S1-1、式(i)所示的阿立哌唑溶解在式(ii)所示的烷基醇中并发生酰胺醇解反应，得到式(iii)所示的化合物；
S1-2、式(iii)所示的化合物顺次经过水解反应和中和反应，得到所述式(I)所示的半抗原。
在一些实施方式中，步骤S1-1中，所述烷基醇ROH中的R代表C1～C8烷基。其中，所述烷基醇可以选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇和辛醇。
在一些实施方式中，步骤S1-1中，所述酰胺醇解反应的反应温度为40～45℃。
在一些实施方式中，步骤S1-1中，所述阿立哌唑和所述烷基醇的摩尔比为1:(40～60)。
在一些实施方式中，步骤S1-2中，所述水解反应的pH值为11～12。
在一些实施方式中，步骤S1-2中，所述水解反应的反应温度为20～30℃。
在一些实施方式中，步骤S1-2中，所述中和反应的pH值为4～5。
第二方面，本申请提供的一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗原，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗原，所述抗原是由所述半抗原和载体蛋白通过偶联法偶联而形成的偶联物。
在一些实施方式中，所述半抗原和载体蛋白的摩尔比为1:(0.010～0.020)，例如1:0.014。
在一些实施方式中，在所述抗原中，所述半抗原和所述载体蛋白通过偶联剂偶联得到所述抗原。所述半抗原和所述偶联剂的摩尔比为1:(2～3)，例如1:2.43。其中，所述偶联剂为碳化二亚胺类偶联剂。所述碳化二亚胺类偶联剂包括但不限于N,N'-二环己基碳二亚胺(简称DCC，CAS号538-75-0)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(简称DIC，CAS号693-13-0)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC，CAS号25952-53-8)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(简称EDCI，CAS号7084-11-9)。
在一些实施方式中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白。
在一些实施方式中，所述抗原的制备方法包括以下步骤：
S2-1、将半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；
S2-2、将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液；
S2-3、将步骤S2-1得到的半抗原的二甲基亚砜溶液和步骤S2-2得到的偶联剂水溶液混合，室温反应0.5～2小时，得半偶联反应液；
S2-4、将载体蛋白溶解于缓冲液中，得载体蛋白溶液；
S2-5、将步骤S2-4得到的载体蛋白溶液和步骤S2-3得到的半偶联反应液混合，室温搅拌1～3小时得偶联反应液；
S2-6、将步骤S2-5得到的偶联反应液透析到缓冲液中，得到所述抗原。
在一些实施方式中，步骤S2-1中，所述半抗原在所述半抗原的二甲基亚砜溶液中的浓度可以为(5～20)mg/mL，例如10mg/mL。
在一些实施方式中，步骤S2-2中，所述偶联剂在所述偶联剂的水溶液中的浓度可以为(50～200)mg/mL，例如100mg/mL。
在一些实施方式中，步骤S2-4中，所述载体蛋白在所述载体蛋白溶液中的浓度可以为(2～10)mg/mL，例如4mg/mL。
在一些实施方式中，步骤S2-4中，所述缓冲剂可以为PBS缓冲液。所述载体蛋白可以选自牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白等。
在一些实施方式中，步骤S2-6中，所述缓冲剂可以为PBS缓冲液。所述透析的次数为多次，例如2次、3次、4次、5次、6次等。每次透析中所述缓冲液的体积用量是所述偶联反应液的(400～600)倍，例如500倍。
第三方面，本申请提供的一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的细胞株，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的细胞株，所述细胞株是响应于所述抗原而生成的。
在一些实施方式中，所述细胞株命名为45F2细胞株，于2022年05月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.45162。
第四方面，本申请提供的一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗体，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗体，所述抗体是响应于所述抗原而生成的。
在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。其中，单克隆抗体和多克隆抗体的制备均可以采用本领域公知的技术，即经典的杂交瘤细胞融合技术。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
S3-1、抗原的接种至宿主(例如小鼠、兔、山羊、绵羊等)：采用PBS缓冲液将阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，宿主按照(0.01～0.2)mg/只的剂量进行首次免疫；间隔四周后，称取1mg的阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化，经过首次免疫的宿主按照(0.01～0.2)mg/只的剂量进行加强免疫；
S3-2、将来自接种宿主的脾细胞系与Sp2/0细胞融合，采用阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原包被ELISA 96孔板，对融合细胞采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法分别进行效价及竞争测定，能够特异性识别阿立哌唑和脱氢阿立哌唑、同时与Hydroxylation-阿立哌唑和N-Dealkylation-阿立哌唑无交叉的抗体。
在一些实施方式中，所述多克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
首次免疫：抗原的接种至宿主(例如小鼠、兔、山羊、绵羊等)：采用PBS缓冲液将阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，宿主按照(0.01～0.2)mg/只的剂量进行首次免疫；
增强免疫：间隔(2～6)周后，称取1mg的阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化，经过首次免疫的宿主按照(0.01～0.2)mg/只的剂量进行增强免疫，采血测定血清效价和特异性。
其中，增强免疫重复多次，例如4次、5次。相邻两次增强免疫的时间间隔为(2～6)周，例如：4周。
第五方面，本申请提供一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂，所述试剂包含所述抗体。
第六方面，本申请提供的一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂盒，采用如下技术方案：
一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的试剂盒，所述试剂盒包含所述抗体。
在一些实施方式中，所述试剂盒可以用于尿液样本或者血液样本的检测。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请所提供的抗原和抗体，具有能够同时识别阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢阿立哌唑的能力，同时具备优于相关技术的抗体特异性，即与阿立哌唑的无活性代谢产物Hydroxylation-阿立哌唑和N-Dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。因此，本申请所提供的抗原和抗体能够构建准确监测血液和尿液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的免疫学检测方法。
附图说明
图1是本申请中半抗原的核磁共振氢谱图；
图2是本申请中牛血清白蛋白、抗原的Native-PAGE电泳鉴定图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原的制备
半抗原的结构式为：
Figure BDA0003713682500000061
半抗原的合成路线为：
Figure BDA0003713682500000062
半抗原的制备方法为：式(i)所示的阿立哌唑和式(ii)所示的烷基醇发生酰胺醇解反应生成式(iii)所示的化合物；式(iii)所示的化合物再顺次经过水解反应和中和反应，得到式(I)所示的半抗原。
在式(ii)所示的烷基醇为甲醇时，半抗原的制备方法，具体包括以下步骤：
S1-1、式(iii)所示的化合物的合成：
Figure BDA0003713682500000063
称取阿立哌唑(4.5g，10mmol)和甲醇(20mL，15.836g，494mmol)搅拌溶解，并加入到50mL三口瓶中，控制温度在5～15℃范围内缓慢滴加浓硫酸(1.5g)，之后升温至40～45℃并在40～45℃下反应2小时。反应结束后加水60mL，降温至5～10℃后用液碱调pH＝8.5，加入乙酸乙酯40mL搅拌20分钟静置分层，得到有机层(即式(iii)所示的化合物的乙酸乙酯溶液)。
S1-2、式(I)所示的半抗原的合成：
Figure BDA0003713682500000071
步骤S1-1得到的有机层通过减压浓缩蒸出乙酸乙酯，蒸干乙酸乙酯后加水50mL；之后，先用液碱调pH＝12，室温水解反应30分钟；再加入乙酸乙酯30mL，并用稀硫酸调节pH＝4.5，搅拌20分钟静置分层，得到有机层。向有机层中加入二氯甲烷100mL，降温至0～5℃搅拌结晶2小时，过滤，滤饼干燥后，得到式(I)所示的阿立哌唑的半抗原(3.5g，收率75.2％)。
半抗原的表征：半抗原的核磁共振氢谱图如图1所示。由图1可以看出，式(I)所示的阿立哌唑的半抗原制备成功。
用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗原的制备
抗原的制备方法，具体包括如下步骤：
S2-1、称取10mg的阿立哌唑的半抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液；
S2-2、称取10mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶解于100ul的水中得偶联剂的水溶液；
S2-3、将步骤S2-1得到的半抗原的二甲基亚砜溶液和步骤S2-2得到的偶联剂的水溶液混合，室温反应1小时，得到半偶联反应液；
S2-4、称取20mg的载体蛋白溶解于5mL的PBS缓冲液中，得载体蛋白溶液；在本具体实施方式中载体蛋白为牛血清白蛋白；
S2-5、将步骤S2-4得到的载体蛋白溶液和步骤S2-3得到的反应液混合，室温搅拌2小时得偶联反应液；
S2-6、用PBS缓冲液对步骤S2-5得到的偶联反应液透析四次，且每次透析时偶联反应液和PBS缓冲液的体积比为1:500，得到抗原。
抗原的表征：将牛血清白蛋白(BSA)和由半抗原和牛血清白蛋白偶联后的抗原(BSA-阿立哌唑衍生物)进行Native-PAGE电泳鉴定，结果如图2所示。由图2可以看出，偶联后的抗原比单独的牛血清白蛋白在电泳上表现出更快的电泳速度，表明抗原制备成功。
用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的制备
抗体可以为单克隆抗体和多克隆抗体。其中，单克隆抗体和多克隆抗体的制备均可以采用本领域公知的技术，即经典的杂交瘤细胞融合技术。
其中，单克隆抗体的抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
S3-1、抗原的接种至宿主：采用PBS缓冲液将阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，小鼠按照0.1mg/只的剂量进行首次免疫；间隔四周后，称取1mg的阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化，经过首次免疫的小鼠按照0.1mg/只的剂量进行加强免疫；
S3-2、将来自接种宿主的脾细胞系与Sp2/0细胞融合，采用阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的抗原包被ELISA 96孔板，对融合细胞采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法分别进行效价及竞争测定，筛选得到对阿立哌唑竞争最好的3株细胞株，分别命名为45F2、1B2、21G7。
其中，45F2细胞株，于2022年05月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.45162。
表1：45F2细胞株的细胞上清的间接竞争ELISA结果
Figure BDA0003713682500000081
表2：1B2细胞株的细胞上清的间接竞争ELISA结果
Figure BDA0003713682500000082
表3：21G7细胞株的细胞上清的间接竞争ELISA结果
Figure BDA0003713682500000091
交叉反应率的计算公式为：
Figure BDA0003713682500000092
结合表1～3可知，45F2细胞株产生的抗体表现出对阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢阿立哌唑几乎一致的识别效率，并且对阿立哌唑的无活性代谢产物的Hydroxylation-阿立哌唑和N-dealkylation-阿立哌唑交叉反应非常低。因此，45F2细胞株产生的抗体适合同时检测样本中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑的浓度。
这可能是由于本申请的半抗原的衍生位点远离阿立哌唑和脱氢阿立哌唑共同的特征结构，因此，本申请的抗体能够等效识别阿立哌唑及其活性代谢物脱氢阿立哌唑。此外，本申请的阿立哌唑的抗体对无活性代谢物Hydroxylation-阿立哌唑和N-dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。并且，本申请的半抗原中创新性的去除掉了脱氢阿立哌唑的特征结构，且采用一个极短的连接臂同载体蛋白偶联，因此可以同时识别阿立哌唑和脱氢阿立哌唑，这对于阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢阿立哌唑的测定非常有利。
综上所述，本申请所提供的抗原和抗体，具有能够同时识别阿立哌唑及其活性代谢产物脱氢阿立哌唑的能力，同时具备优于相关技术的抗体特异性，即同阿立哌唑的无活性代谢产物Hydroxylation-阿立哌唑和N-Dealkylation-阿立哌唑无交叉反应。因此，本申请所提供的抗原和抗体能够构建准确监测血液和尿液中阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的免疫学检测方法。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003970908430000011
2.如权利要求1所述的半抗原的制备方法，其特征在于，所述半抗原的制备方法包括以下步骤：
Figure FDA0003970908430000012
S1-1、式(i)所示的阿立哌唑溶解在式(ii)所示的烷基醇中并发生酰胺醇解反应，得到式(iii)所示的化合物；所述烷基醇ROH中的R代表C1～C8烷基；
S1-2、式(iii)所示的化合物顺次经过水解反应和中和反应，得到所述式(I)所示的半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-1中，所述酰胺醇解反应的反应温度为40～45℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-2中，所述水解反应的pH值为11～12。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-2中，所述中和反应的pH值为4～5。
6.一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的抗原，其特征在于，所述抗原是由如权利要求1所述的半抗原和载体蛋白通过偶联法偶联而形成的偶联物。
7.根据权利要求6所述的抗原，其特征在于，所述半抗原和载体蛋白的摩尔比为1:(0.010～0.020)。
8.根据权利要求7所述的抗原，其特征在于，所述半抗原和所述载体蛋白通过偶联剂偶联得到所述抗原。
9.一种用于检测阿立哌唑和脱氢阿立哌唑浓度的细胞株，其特征在于，所述细胞株是响应于权利要求6至8中任意一项所述的抗原而生成的；
所述细胞株命名为45F2细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.45162。
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