CN115161333B - 一种猪链球菌的反向筛选标记、含有该反向筛选标记的猪链球菌及其应用 - Google Patents

一种猪链球菌的反向筛选标记、含有该反向筛选标记的猪链球菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪链球菌的反向筛选标记、含有该反向筛选标记的猪链球菌及其应用。所述的反向筛选标记为突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因，突变后的pheS基因导致了编码的猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基发生了T261S和A315G双取代突变，PheS突变体通过与菌株自身的野生PheS蛋白竞争，翻译过程中将p‑Cl‑Phe错误地掺入到合成的蛋白质中，从而在p‑Cl‑Phe存在条件下，表达PheS突变体的菌株死亡，不表达PheS突变体的菌株生存。利用这一高效反向筛选标记，本发明还建立了高效的猪链球菌无痕基因操作方法，用于实现猪链球菌的无痕基因缺失、基因融合和基因突变等无痕基因操作，在研究猪链球菌生理和病理机制、制备疫苗株方面具有很好的应用前景。

Description

一种猪链球菌的反向筛选标记、含有该反向筛选标记的猪链 球菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种猪链球菌的反向筛选标记，还涉及含有该反向筛选标记的猪链球菌及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
猪链球菌是一种***，会导致猪脑膜炎、关节炎、败血症和死亡。另外，它能通过接触病猪传给人，导致人脑膜炎、链球菌中毒性休克样综合征和死亡。因此，猪链球菌是一种重要的***共患病病原菌，严重威胁养猪业和人类公共健康。在过去二十年中，猪链球菌受到了越来越多的重视，其生理和病理机制研究以及疫苗制备和生产方面都取得了一些重要进展。基因操作技术在这一过程中发挥着关键作用。但是，以往的基因操作技术或者引入了抗性基因标记，或者虽然采用了无抗基因操作，但是效率偏低，难以进行复杂的、多基因的操作。然而，无论是进一步进行深入、复杂和客观的生理和病理研究，还是开发制备不能携带抗性基因标记且需要多基因操作的疫苗菌株，都需要对相关基因进行高效的无痕缺失、融合或突变。因此，缺乏高效的无痕基因操作***，已经成为限制猪链球菌研究和疫苗制备的瓶颈，而一种高效的反向筛选标记，是实现细菌高效无痕基因操作的关键。
目前报道的用于建立猪链球菌的反向筛选标记有两个，分别为枯草杆菌蔗糖果聚糖酶SacB和副溶血性弧菌毒素YoeB。在SacB作为猪链球菌反向筛选标记的报道中，文中只是简单一句话介绍采用枯草芽孢杆菌天然sacB基因及其启动子作为反向筛选标记，并无具体方法，更未提及其效率。我们采用报道中使用的枯草芽孢杆菌天然sacB基因及其启动子，筛选了数百个耐受蔗糖的菌落，也没有筛选到目的克隆，说明其筛选效率低于1％。而采用YeoB作为反向筛选标记的报道中，由于诱导YeoB并不能完全抑制猪链球菌的生长，这从根本上限制了其筛选效率。因此，这一方法不仅需要通过多次传代并添加诱导物来富集目的克隆，而且即使这样，其筛选效率最高时也达不到100％，多数情况下只有50％左右。因此，目前报道的猪链球菌反向筛选标记的效率均偏低，需要开发更高效的反向筛选标记用于猪链球菌无痕基因操作。
最近几年，人们发现编码苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因的突变体可以用作细菌的反向筛选标记。A294G单氨基酸取代突变体(氨基酸位置参考大肠杆菌PheS蛋白)开发较早，在多种细菌中得到了应用。但是，这种单取代突变体筛选效率偏低，需要高浓度的p-Cl-phe(>5mM)并使用营养限制培养基。进一步研究发现T251S/A294G双取代突变体具有更高的p-Cl-phe掺入效率，因此推测其可能会产生更高的筛选效率，这一推测在枯草芽孢杆菌和变异链球菌中得到了证实，筛选效率达到了100％。
PheS突变体通过与菌株自身的野生PheS蛋白竞争，翻译过程中将苯丙氨酸类似物p-Cl-phe错误地掺入到合成的蛋白质中，从而在p-Cl-phe存在条件下，表达PheS突变体的菌株死亡，不表达PheS突变体的菌株生存。这一反向筛选原理决定了其它细菌中建立的PheS反向筛选标记不能用到猪链球菌中，而是需要：1)针对猪链球菌，鉴定其自身的pheS基因；2)鉴定T251和A294对应的氨基酸，进行取代突变；3)引入大量同义突变，在保持蛋白序列与野生PheS蛋白一致的前提下，尽量降低核酸序列的相似性，避免两者发生重组；4)筛选针对猪链球菌的强启动子驱动，提高突变PheS蛋白的表达量，从而与野生PheS蛋白进行竞争。
基于此，本发明着手于猪链球菌PheS蛋白及突变氨基酸的鉴定，通过引入双突变、同义突变和筛选启动子，开发一种高效的猪链球菌反向筛选标记，并确定其作用条件和效率。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种猪链球菌的反向筛选标记。
本发明的目的之二在于提供含有该反向筛选标记的猪链球菌及其在猪链球菌基因编辑中应用。
本发明的目的之三在于提供一种猪链球菌无痕基因编辑方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
首先，本发明提出了一种猪链球菌的反向筛选标记，所述的反向筛选标记为突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因，突变后的pheS基因导致了编码的猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基发生了T261S和A315G双取代突变，PheS突变体通过与菌株自身的野生PheS蛋白竞争，翻译过程中将苯丙氨酸类似物对-氯-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)错误地掺入到合成的蛋白质中，从而在p-Cl-Phe存在条件下，表达PheS突变体的菌株死亡，不表达PheS突变体的菌株生存。
其中，优选的，所述的突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因编码的PheS突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其次，本发明还提出了一种含有所述的反向筛选标记的猪链球菌。
其中，优选的，所述的反向筛选标记由启动子P0177、P0530、P1503、P1815或P1868驱动表达。
其中，优选的，所述的猪链球菌通过以下方法制备得到：
(1)mPheS突变体基因的合成
合成SEQ ID NO.1所示的mPheS突变体基因序列；
(2)mPheS与强启动子融合片段P-mPheS的构建
1)mPheS与5个强启动子片段克隆：
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
P0177-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATTGGTAAGAGAAATGTGAGTG-3’
P0177-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATATCTTTATAAGACATGATATCCTC-3’
P0530-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAGTAGGATAACTGAATGGAGAA-3’
P0530-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTTTGGTAAAAGCCTCCAATAA-3’
P1503-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATGTTTCGCCAGAGGCTT-3’
P1503-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTATATTACTCTCCTTTGAGTTT-3’
P1815-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAACAGCGCCTCAAAAACTA-3’
P1815-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAGTCCTCCATATAAGTACTTC-3’
P1868-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAAAAAACAGCAAGGATTGTAG-3’
P1868-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAAACACCTCTGTTTTCTTT-3’
mPheS-F:5’-ATGTCTAACATCGAGCAAC-3’
mPheS-R:5’-TTAGAATTGTTCTGAGAAACGAAC-3’
以步骤(1)合成的mPheS基因为模板，以mPheS-F/mPheS-R为引物得到mPheS基因的扩增产物；以猪链球菌05ZYH33菌株基因组DNA为模板，分别以P0177-F/P0177-R、P0530-F/P0530-R、P1503-F/P1503-R、P1815-F/P1815-R、P1868-F/P1868-R为引物得到5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815、P1868的扩增产物；
3)融合片段P-mPheS的构建
分别以各启动子的扩增产物和mPheS的扩增产物混合为模板，通过重叠延伸PCR进行融合，获得产物即为mPheS与强启动子的融合片段P-mPheS，分别命名为P0177-mPheS、P0530-mPheS、P1503-mPheS、P1815-mPheS和P1868-mPheS；
(3)通过红霉素抗性基因(erm)将P-mPheS融合片段整合到猪链球菌基因组
1)猪链球菌ssu05_0630基因上游序列及含erm基因的下游序列扩增
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
UP0630-F:5’-TGCTAACGATGCTACAAATGC-3’
UP0630-R:5’-TTACTCCTTCTTCCGCCGG-3’
Erm-DN0630-F:5’-CGTTCGTTTCTCAGAACAATTCTAAAGAAGGAGGGATTCGTCATG-3’
Erm-DN0630-R:5’-CAAAGATAGCGGTGGTCGT-3’
分别以UP0630-F/UP0630-R和Erm-DN0630-F/Erm-DN0630-R为引物，以erm基因替代ssu05_0630基因的猪链球菌ssu05_0630基因缺失株(陈平，刘冉，黄萌萌，朱金鲁，谢芳，倪宏波，刘思国，张跃灵。猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究。中国预防兽医学报，2019，41(05)：462-467)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ssu05_0630基因上游序列扩增产物UP0630和含erm基因的ssu05_0630基因下游序列扩增产物Erm-DN0630；
2)融合片段UP0630-P-mPheS-Erm-DN0630的构建
将UP0630和Erm-DN0630片段与上述5个融合片段P-mPheS分别组合后作为模板，以UP0630-F/UP0630-R为引物，采取上述PCR反应条件，进行重叠延伸PCR，扩增获得5个对应的融合片段，分别命名为UP-P0177-mPheS-Erm-DN、UP-P0530-mPheS-Erm-DN、UP-P1503-mPheS-Erm-DN、UP-P1815-mPheS-Erm-DN和UP-P1868-mPheS-Erm-DN；
3)肽诱导转化和整合鉴定
合成SEQ ID NO.3所示的多肽，纯度为95％，溶解于去离子水中至终浓度5mM，分装后在-20℃下储存备用；将猪链球菌05ZYH33菌株过夜培养后，以1:100接种于新鲜TSBS培养基，37℃、5％CO2条件下，静置培养1.5h、2h、2.5h和3h；每个时间点取50μl菌液，与2.5μl多肽和1μg步骤2)得到的5个UP-P-mPheS-Erm-DN的融合片段分别混合，混合物培养4小时后，涂布添加了红霉素的TSAS平板(TSAS-Erm)；
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
SeqF:5’-GCGGAGCCCTTACCAG-3’
SeqR:5’-AATACAGAAGTTAAACGATTTGT-3’
挑取TSAS-Erm平板上的单菌落，培养后采用SeqF/SeqR引物进行PCR鉴定，经1％琼脂糖电泳检测大小分别为2004bp、1820bp、1717bp、1872bp和1777bp，确认各个UP-P-mPheS-Erm-DN片段整合到了目的位点，说明获得了基因组中整合了P-mPheS-Erm的片段，简称PPE；这些菌株分别命名为gP0177PE、gP0530PE、gP1503PE、gP1815PE和gP1868PE。
再次，本发明还提出了所述的猪链球菌在猪链球菌无痕基因编辑中的应用。
最后，本发明还提出了一种猪链球菌无痕基因编辑方法，其包括以下步骤：从猪链球菌WT菌株中扩增突变基因的上游UP1和下游序列DN1；从所述的猪链球菌菌株基因组DNA中扩增得到含有启动子、反向筛选标记以及红霉素抗性基因的片段PPE；通过重叠延伸PCR，扩增获得融合DNA片段UP1-PPE-DN1；片段转化猪链球菌WT菌株并在TSAS-Erm平板上筛选，菌落经PCR鉴定获得阳性菌落，获得含有反向筛选标记P-mPheS的中间菌株；
从猪链球菌WT菌株中扩增突变基因的上游UP2和下游序列DN2；突变基因的上游和下游序列或者直接融合在一起，或者与特定基因或片段融合，或者与突变基因融合，获得用于第二次转化的第二个片段；片段转化上述对p-Cl-phe敏感的中间菌株，并在含有0.05％p-Cl-phe的TSAS平板上进行反向筛选；随机挑取100个菌落，培养后用对其进行PCR鉴定，即获得目的突变。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
猪链球菌是一种重要的***共患病病原菌，严重威胁养猪业和人类公共健康。对猪链球菌的深入研究以及疫苗制备迫切需要一个有效的无痕基因操作***，而反向筛选标记的效率直接决定了无痕基因操作的效率。目前在猪链球菌中已经开发出了基于SacB和YeoB的两种反向筛选标记，但是它们的效率不够高，而且操作相对复杂。在本发明中，我们在猪链球菌的遗传背景下，通过鉴定猪链球菌的pheS基因，引入突变，筛选启动子，并通过基因组整合途径，在猪链球菌中摸索合适的氯代苯丙氨酸(p-Cl-phe)作用浓度，鉴定筛选效率，开发了基于pheS突变基因的猪链球菌高效反向筛选标记，筛选效率达到100％，是目前猪链球菌中最高效的反向筛选标记。利用这一高效反向筛选标记，建立了高效的猪链球菌无痕基因操作策略，用于实现猪链球菌高效的无痕基因缺失、基因融合和基因突变，以及其它无痕基因操作，在研究猪链球菌生理和病理机制、制备疫苗株方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为wtPheS和mPheS相关序列比较；
图2为不同P-mPheS基因组整合菌株的构建及对p-Cl-phe敏感性的检测；
图3为P1503-mPheS作为反向筛选标记构建ireB基因缺失菌株；
图4为基于P1503-mPheS反向筛选标记的高效猪链球菌无痕基因操作策略示意图。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1mPheS突变体基因的设计与合成
利用变异链球菌的pheS进行BLAST，从猪链球菌05ZYH33(GenBank:CP000407)的基因组中鉴定到野生型pheS基因(wtPheS)。通过ClustalW比较大肠杆菌、变形链球菌、单核细胞增生李斯特菌、嗜酸杆菌和猪链球菌的PheS蛋白，鉴定到大肠杆菌PheS蛋白T251和A294对应的氨基酸T261和A315(图1A)。分别将其密码子ACT和GCC改变为TCA和GGT，实现T261S和A315G双取代突变(图1B，虚线矩形所示)。然后通过密码子适应软件Jcat以及手动突变，最终引入275个同义突变，得到的mPheS基因(SEQ ID NO.1所示)与wtPheS基因的相似度为73.7％，它们之间最长的连续相同序列不超过8bp(图1B)。它们对应的mPheS(SEQ ID NO.2所示)和wtPheS蛋白除了T261S/A315G双取代外，氨基酸序列完全一致(图1C)。mPheS基因由华大基因公司合成。
实施例2mPheS与强启动子融合片段P-mPheS的构建
(1)mPheS与5个潜在强启动子片段克隆：
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
P0177-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATTGGTAAGAGAAATGTGAGTG-3’
P0177-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATATCTTTATAAGACATGATATCCTC-3’
P0530-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAGTAGGATAACTGAATGGAGAA-3’
P0530-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTTTGGTAAAAGCCTCCAATAA-3’
P1503-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATGTTTCGCCAGAGGCTT-3’
P1503-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTATATTACTCTCCTTTGAGTTT-3’
P1815-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAACAGCGCCTCAAAAACTA-3’
P1815-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAGTCCTCCATATAAGTACTTC-3’
P1868-F:5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAAAAAACAGCAAGGATTGTAG-3’
P1868-R:5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAAACACCTCTGTTTTCTTT-3’
mPheS-F:5’-ATGTCTAACATCGAGCAAC-3’
mPheS-R:5’-TTAGAATTGTTCTGAGAAACGAAC-3’
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5-10s/kb，32个循环。除mPheS扩增采用实施例1中合成的mPheS基因为模板外，其余均采用猪链球菌05ZYH33菌株基因组DNA为模板。
P0177-F/P0177-R、P0530-F/P0530-R、P1503-F/P1503-R、P1815-F/P1815-R、P1868-F/P1868-R和mPheS-F/mPheS-R六对引物扩增所得PCR产物分别为5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815、P1868和mPheS基因，经1％琼脂糖电泳检测大小分别为484bp、300bp、197bp、352bp、257bp和1044bp(图2A)。
(2)融合片段P-mPheS的构建：根据表1所示的模板和引物组合，以各启动子片段和mPheS片段混合为模板，通过重叠延伸PCR进行融合。
PCR反应条件同上，获得产物即为mPheS与强启动子融合片段P-mPheS，分别命名为P0177-mPheS、P0530-mPheS、P1503-mPheS、P1815-mPheS和P1868-mPheS，经1％琼脂糖电泳检测大小分别为1528bp、1344bp、1241bp、1396bp和1301bp(图2B)。
实施例3通过红霉素抗性基因(erm)将P-mPheS融合片段整合到猪链球菌基因组
(1)猪链球菌ssu05_0630基因上游序列及含erm基因的ssu05_0630基因下游序列扩增
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
UP0630-F:5’-TGCTAACGATGCTACAAATGC-3’
UP0630-R:5’-TTACTCCTTCTTCCGCCGG-3’
Erm-DN0630-F:5’-CGTTCGTTTCTCAGAACAATTCTAAAGAAGGAGGGATTCGTCATG-3’
Erm-DN0630-R:5’-CAAAGATAGCGGTGGTCGT-3’
分别以UP0630-F/UP0630-R和Erm-DN0630-F/Erm-DN0630-R为引物，以erm基因替代ssu05_0630基因的猪链球菌ssu05_0630基因缺失株(陈平，刘冉，黄萌萌，朱金鲁，谢芳，倪宏波，刘思国，张跃灵。猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究。中国预防兽医学报，2019，41(05)：462-467)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ssu05_0630基因上游序列扩增产物UP0630和含erm基因的ssu05_0630基因下游序列扩增产物Erm-DN0630。产物UP0630和Erm-DN0630经检测大小分别为1024bp和2413bp(图2B)。
(2)融合片段UP0630-P-mPheS-Erm-DN0630的构建
如表2所示，UP0630和Erm-DN0630片段与上述5个P-mPheS片段一一组合，混合物作为模板，以UP0630-F/UP0630-R为引物，采取上述PCR反应条件，进行重叠延伸PCR，扩增获得5个对应的融合片段UP-P0177-mPheS-Erm-DN、UP-P0530-mPheS-Erm-DN、UP-P1503-mPheS-Erm-DN、UP-P1815-mPheS-Erm-DN和UP-P1868-mPheS-Erm-DN。经1％琼脂糖电泳检测大小分别为4983bp、4799bp、4696bp、4851bp和4756bp(图2C)。
表2重叠延伸PCR模板和引物组合
(3)肽诱导转化和整合鉴定
肽诱导转化参考文献进行(Zaccaria等人，2014年)。多肽(SEQ ID NO.3所示，GNWGTWVEE)由GenScript(中国)合成，纯度为95％。溶解于去离子水中至终浓度5mM，分装后在-20℃下储存备用。将猪链球菌05ZYH33菌株过夜培养后，以1:100接种于新鲜TSBS培养基，37℃、5％CO2条件下，静置培养1.5h、2h、2.5h和3h。每个时间点取50μl菌液，与2.5μl多肽和1μg步骤(2)得到的5个UP-P-mPheS-Erm-DN的融合片段分别混合。混合物培养4小时后，涂布添加了红霉素的TSAS平板(TSAS-Erm)。
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
SeqF:5’-GCGGAGCCCTTACCAG-3’
SeqR:5’-AATACAGAAGTTAAACGATTTGT-3’
挑取TSAS-Erm平板上的单菌落，培养后采用SeqF/SeqR引物进行PCR鉴定，经1％琼脂糖电泳检测大小分别为2004bp、1820bp、1717bp、1872bp和1777bp(图2D)，确认各个UP-P-mPheS-Erm-DN片段整合到了目的位点，说明获得了基因组中整合了P-mPheS-Erm的片段，简称PPE。这些菌株分别命名为gP0177PE、gP0530PE、gP1503PE、gP1815PE和gP1868PE(g代表基因组整合)(图2E)。
实施例4不同gPPE菌株对p-Cl-phe的敏感性检测
猪链球菌菌株过夜培养后，转接至新鲜培养基生长至OD600nm 0.6后，取5μl滴于含有指定浓度p-Cl-phe的TSAS平板上。在37℃、5％CO2条件下静置培养24h后，观察并拍照记录菌株的生长情况。p-Cl-phe对每个菌株的最小抑制浓度(MIC)定义为抑制该菌株生长的最低浓度。p-Cl-phe对gP0177PE、gP0530PE、gP1503PE、gP1815PE和gP1868PE菌株的MIC分别为0.02％、0.01％、0.01％、0.08％和0.06％(图2F)，而野生菌株(WT)对0.15％以下浓度的p-Cl-phe不敏感。说明5个P-mPheS均能赋予菌株对p-Cl-phe的敏感性，而其中gP0530PE和gP1503PE的MIC最低，说明P0530-mPheS和P1503-mPheS赋予的敏感性最强，最适合作为猪链球菌的反向筛选标记。
实施例5P1503-mPheS作为反向筛选标记的筛选效率
为了检测P1503-mPheS作为猪链球菌反向筛选标记的效率，将其用于ireB基因的无痕缺失。设计PCR引物，核苷酸序列如下：
UP1-F:5’-GAAGAAGCTCCTGTTGTTGC-3’
UP1-R:5’-CTTCGGTAAATCCCATACTTAC-3’
PPE-F:5’-GTAAGTATGGGATTTACCGAAGTGTTTCGCCAGAGGCTT-3’
PPE-R:5’-GTCAATCCCATTCCCTTTCCCAAATTCCCCGTAGGC-3’
DN1-F:5’-GAAAGGGAATGGGATTGAC-3’
DN1-R:5’-GCGTCTTCTGGGATAGGTT-3’
UP2-F:5’-ACAACGCCTGGTGGACG-3’
UP2-R:5’-ACTTACACCTTCTTTCCCT-3’
DN2-F:5’-AGGGAAAGAAGGTGTAAGTTGAGAATAATGGGATTAGACGT-3’
DN2-R:5’-TGATAGGCTGGATAGTTTTGATA-3’
ireB-F:5’-GAAACGACTTCAAGTGGGC-3’
ireB-R:5’-GTTCGGTCAAACGCTCCA-3’
分别采用UP1-F/UP1-R和DN1-F/DN1-R引物，从猪链球菌WT菌株中扩增ireB基因的上游UP1和下游序列DN1；采用PPE-F/PPE-R引物，从gP1503PE菌株基因组DNA中扩增P1503PE序列(简称PPE)(图3A)。通过重叠延伸PCR，扩增获得融合DNA片段UP1-PPE-DN1(图3B)。片段转化猪链球菌WT菌株并在TSAS-Erm平板上筛选，菌落经PCR鉴定获得阳性菌落(图3C)。阳性菌落接种添加0.05％p-Cl-phe的TSAS平板确认其对p-Cl-phe的敏感性，获得含有反向筛选标记P1503-mPheS的中间菌株(图3D)。
分别采用UP2-F/UP2-R和DN2-F/DN2-R引物，从猪链球菌WT菌株中扩增ireB基因的上游序列UP2和下游序列DN2(图3E)。通过重叠延伸PCR，扩增获得融合DNA片段UP2-DN2(图3F)。片段转化上述对p-Cl-phe敏感的中间菌株，并在含有0.05％p-Cl-phe的TSAS平板上进行反向筛选。随机挑取100个菌落，培养后用引物ireB-F/ireB-R对其进行PCR鉴定，挑取的所有耐受0.05％p-Cl-phe的菌落中，全部含有目标ireB基因无痕缺失(图3G)，说明P1503-mPheS作为反向筛选标记，其筛选效率为100％。三次重复试验进一步证实了这一点。
实施例6以P1503-mPheS为反向筛选标记的猪链球菌无痕基因操作策略
P1503-mPheS的100％筛选效率使进行猪链球菌高效无痕基因操作成为可能。通过***和去除P1503-mPheS两步，以p-Cl-phe为抑制剂，形成了一种只需两步的猪链球菌高效无痕基因操作策略。如图4所示，该策略只需要两个融合片段和两次转化。首先，将突变位点的上游和下游序列与含有P1503-mPheS标记P1503PE片段融合，获得用于第一次转化的UP-P1503PE-DN片段，该片段由其携带的阳性选择标记erm进行选择，获得含有P1503PE的中间菌株。然后，突变位点的上游和下游序列或者直接融合在一起(用于基因缺失)，或者与特定基因或片段融合(例如用于基因融合的荧光蛋白基因或FLAG标签)，或者与突变基因融合(用于基因突变)，获得用于第二次转化的第二个片段，转化中间菌株后由p-Cl-phe进行反向选择，即获得目的突变。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 一种猪链球菌的反向筛选标记、含有该反向筛选标记的猪链球菌及其应用
<141> 2022-06-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1044
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atgtctaaca tcgagcaaca acttgcagaa ctttcacaaa ctactttgga aaaacttaag 60
gaaattcaac accaaggtga aaaggaattg caagatcttc gtgtagctgt acttggcaaa 120
aaaggttcac ttactgattt gcttaaaggt cttaaggatt tgtcaaacga tatgaagcct 180
attgtaggca aacaagtaaa cgaagttcgt gacgttttga ctacagcttt cgaagagaca 240
gcacaaaaag ttgctgctgc taaaatccaa caacaattgg catcagaaac tatcgacgtt 300
actcttcctg gacgtcaagt aaaagttggt aaacgtcacg ttcttactca aacatcagaa 360
gaaatcgaag acatcttcct tggtatgggt ttccaaattg tagatggttt cgaagttgaa 420
aaagattatt ataacttcga acgtatgaac cttccaaaag accaccctgc tcgtgacatg 480
caagacactt tctacattac tgaagagatc ttgatgcgta ctcacacttc accagtacaa 540
gctcgtacta tggatcaaca cgacttctct aagggcgcac ttaaaatgat ctcaccaggc 600
cgtgtattcc gccgcgacac tgacgacgct actcactcac accaattcca ccaaatcgaa 660
ggtcttgtag ttggcgaaaa cgtttcaatg ggtgacttga aaggcacttt ggaaatgatc 720
attaaaaaaa tgttcggtga agaacgtcaa atccgtcttc gcccttctta tttccctttc 780
tcagaaccat cagtagaagt tgacgtatca tgtttcaaat gtggaggtga tggctgtaac 840
gtttgtaaaa aaactggttg gatcgaaatc ttgggtgctg gtatggttca cccacaagtt 900
cttgaaatgt caggtatcga ttctactaaa tactcaggtt tcggtttcgg cttgggacaa 960
gagcgtatcg ctatgttgcg ctacggaatt aacgatattc gtggcttcta ccaaggcgac 1020
gttcgtttct cagaacaatt ctaa 1044
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Met Ser Asn Ile Glu Gln Gln Leu Ala Glu Leu Ser Gln Thr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Lys Leu Lys Glu Ile Gln His Gln Gly Glu Lys Glu Leu Gln Asp
20 25 30
Leu Arg Val Ala Val Leu Gly Lys Lys Gly Ser Leu Thr Asp Leu Leu
35 40 45
Lys Gly Leu Lys Asp Leu Ser Asn Asp Met Lys Pro Ile Val Gly Lys
50 55 60
Gln Val Asn Glu Val Arg Asp Val Leu Thr Thr Ala Phe Glu Glu Thr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Val Ala Ala Ala Lys Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ser Glu
85 90 95
Thr Ile Asp Val Thr Leu Pro Gly Arg Gln Val Lys Val Gly Lys Arg
100 105 110
His Val Leu Thr Gln Thr Ser Glu Glu Ile Glu Asp Ile Phe Leu Gly
115 120 125
Met Gly Phe Gln Ile Val Asp Gly Phe Glu Val Glu Lys Asp Tyr Tyr
130 135 140
Asn Phe Glu Arg Met Asn Leu Pro Lys Asp His Pro Ala Arg Asp Met
145 150 155 160
Gln Asp Thr Phe Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Leu Met Arg Thr His Thr
165 170 175
Ser Pro Val Gln Ala Arg Thr Met Asp Gln His Asp Phe Ser Lys Gly
180 185 190
Ala Leu Lys Met Ile Ser Pro Gly Arg Val Phe Arg Arg Asp Thr Asp
195 200 205
Asp Ala Thr His Ser His Gln Phe His Gln Ile Glu Gly Leu Val Val
210 215 220
Gly Glu Asn Val Ser Met Gly Asp Leu Lys Gly Thr Leu Glu Met Ile
225 230 235 240
Ile Lys Lys Met Phe Gly Glu Glu Arg Gln Ile Arg Leu Arg Pro Ser
245 250 255
Tyr Phe Pro Phe Ser Glu Pro Ser Val Glu Val Asp Val Ser Cys Phe
260 265 270
Lys Cys Gly Gly Asp Gly Cys Asn Val Cys Lys Lys Thr Gly Trp Ile
275 280 285
Glu Ile Leu Gly Ala Gly Met Val His Pro Gln Val Leu Glu Met Ser
290 295 300
Gly Ile Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Phe Gly Leu Gly Gln
305 310 315 320
Glu Arg Ile Ala Met Leu Arg Tyr Gly Ile Asn Asp Ile Arg Gly Phe
325 330 335
Tyr Gln Gly Asp Val Arg Phe Ser Glu Gln Phe
340 345
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Gly Asn Trp Gly Thr Trp Val Glu Glu
1 5

Claims (7)

1.一种猪链球菌的反向筛选标记，其特征在于，所述的反向筛选标记为突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因，突变后的pheS基因导致了编码的猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基发生了T261S和A315G双取代突变，PheS突变体通过与菌株自身的野生PheS蛋白竞争，翻译过程中将苯丙氨酸类似物对-氯-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)错误地掺入到合成的蛋白质中，从而在p-Cl-Phe存在条件下，表达PheS突变体的菌株死亡，不表达PheS突变体的菌株生存，所述的突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的猪链球菌的反向筛选标记，其特征在于，所述的突变后的编码猪链球菌苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的pheS基因编码的PheS突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种含有权利要求1或2所述的反向筛选标记的猪链球菌。
4.如权利要求3所述的猪链球菌，其特征在于，所述的反向筛选标记由启动子P0177、P0530、P1503、P1815或P1868驱动表达。
5.如权利要求3所述的猪链球菌，其特征在于，所述的猪链球菌通过以下方法制备得到：
(1)mPheS突变体基因的合成
合成SEQ ID NO.1所示的mPheS突变体基因序列；
(2)mPheS与强启动子融合片段P-mPheS的构建
1)mPheS与5个强启动子片段克隆：
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
P0177-F:
5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATTGGTAAGAGAAATGTGAGTG-3’
P0177-R:
5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATATCTTTATAAGACATGATATCCTC-3’
P0530-F:
5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAGTAGGATAACTGAATGGAGAA-3’
P0530-R:
5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTTTGGTAAAAGCCTCCAATAA-3’
P1503-F:
5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAATGTTTCGCCAGAGGCTT-3’
P1503-R:
5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATTATATTACTCTCCTTTGAGTTT-3’
P1815-F:
5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAACAGCGCCTCAAAAACTA-3’
P1815-R:
5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAGTCCTCCATATAAGTACTTC-3’
P1868-F:
5’-CCGGCGGAAGAAGGAGTAAAAAAACAGCAAGGATTGTAG-3’
P1868-R:
5’-GTTGTTGCTCGATGTTAGACATAAAACACCTCTGTTTTCTTT-3’
mPheS-F:5’-ATGTCTAACATCGAGCAAC-3’
mPheS-R:5’-TTAGAATTGTTCTGAGAAACGAAC-3’
以步骤(1)合成的mPheS基因为模板，以mPheS-F/mPheS-R为引物得到mPheS基因的扩增产物；以猪链球菌05ZYH33菌株基因组DNA为模板，分别以P0177-F/P0177-R、P0530-F/P0530-R、P1503-F/P1503-R、P1815-F/P1815-R、P1868-F/P1868-R为引物得到5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815、P1868的扩增产物；
2)融合片段P-mPheS的构建
分别以各启动子的扩增产物和mPheS的扩增产物混合为模板，通过重叠延伸PCR进行融合，获得产物即为mPheS与强启动子的融合片段P-mPheS，分别命名为P0177-mPheS、P0530-mPheS、P1503-mPheS、P1815-mPheS和P1868-mPheS；
(3)通过红霉素抗性基因(erm)将P-mPheS融合片段整合到猪链球菌基因组
1)猪链球菌ssu05_0630基因上游序列及含erm基因的ssu05_0630基因下游序列扩增
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
UP0630-F:5’-TGCTAACGATGCTACAAATGC-3’
UP0630-R:5’-TTACTCCTTCTTCCGCCGG-3’
Erm-DN0630-F:
5’-CGTTCGTTTCTCAGAACAATTCTAAAGAAGGAGGGATTCGTCATG-3’
Erm-DN0630-R:5’-CAAAGATAGCGGTGGTCGT-3’
分别以UP0630-F/UP0630-R和Erm-DN0630-F/Erm-DN0630-R为引物，以erm基因替代ssu05_0630基因的猪链球菌ssu05_0630基因缺失株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ssu05_0630基因上游序列扩增产物UP0630和含erm基因的ssu05_0630基因下游序列扩增产物Erm-DN0630；
2)融合片段UP0630-P-mPheS-Erm-DN0630的构建
将UP0630和Erm-DN0630片段与上述5个融合片段P-mPheS分别组合后作为模板，以UP0630-F/UP0630-R为引物，采取上述PCR反应条件，进行重叠延伸PCR，扩增获得5个对应的融合片段，分别命名为UP-P0177-mPheS-Erm-DN、UP-P0530-mPheS-Erm-DN、UP-P1503-mPheS-Erm-DN、UP-P1815-mPheS-Erm-DN和UP-P1868-mPheS-Erm-DN；
3)肽诱导转化和整合鉴定
合成SEQ ID NO.3所示的多肽，纯度为95％，溶解于去离子水中至终浓度5mM，分装后在-20℃下储存备用；将猪链球菌05ZYH33菌株过夜培养后，以1:100接种于新鲜TSBS培养基，37℃、5％CO2条件下，静置培养1.5h、2h、2.5h和3h；每个时间点取50μl菌液，与2.5μl多肽和1μg步骤2)得到的5个UP-P-mPheS-Erm-DN的融合片段分别混合，混合物培养4小时后，涂布添加了红霉素的TSAS平板；
设计PCR引物，核苷酸序列如下：
SeqF:5’-GCGGAGCCCTTACCAG-3’
SeqR:5’-AATACAGAAGTTAAACGATTTGT-3’
挑取TSAS-Erm平板上的单菌落，培养后采用SeqF/SeqR引物进行PCR鉴定，经1％琼脂糖电泳检测大小分别为2004bp、1820bp、1717bp、1872bp和1777bp，确认各个UP-P-mPheS-Erm-DN片段整合到了目的位点，说明获得了基因组中整合了P-mPheS-Erm的片段，简称PPE；这些菌株分别命名为gP0177PE、gP0530PE、gP1503PE、gP1815PE和gP1868PE。
6.权利要求3-5任一项所述的猪链球菌在猪链球菌无痕基因编辑中的应用。
7.一种猪链球菌无痕基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：从猪链球菌WT菌株中扩增突变基因的上游UP1和下游序列DN1；从权利要求3-5任一项所述的猪链球菌菌株基因组DNA中扩增得到含有启动子、反向筛选标记以及红霉素抗性基因的片段PPE；通过重叠延伸PCR，扩增获得融合DNA片段UP1-PPE-DN1；片段转化猪链球菌WT菌株并在TSAS-Erm平板上筛选，菌落经PCR鉴定获得阳性菌落，获得含有反向筛选标记P-mPheS的中间菌株；
从猪链球菌WT菌株中扩增突变基因的上游UP2和下游序列DN2；突变基因的上游和下游序列或者直接融合在一起，或者与特定基因或片段融合，或者与突变基因融合，获得用于第二次转化的第二个片段；片段转化上述对p-Cl-phe敏感的中间菌株，并在含有0.05％p-Cl-phe的TSAS平板上进行反向筛选；随机挑取菌落，培养后用对其进行PCR鉴定，即获得目的突变。
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