CN115154425B - 一种pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖靶向纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖靶向纳米粒及其制备方法和应用。本发明提供一种针对弱酸性的肿瘤微环境，利用pH敏感性实现不同程度溶胀的纳米粒的制备方法。采用反相微乳液法，使用铁离子Fe3+作为交联剂，将掺杂氧化镁的羧甲基纤维素制备成纳米粒，再通过静电自组装方法，将羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒与叶酸偶联壳聚糖制备成核‑壳结构的双层复合纳米粒。制备得到的纳米粒是一种具有空腔结构的pH敏感性的药物载体，利用纳米粒子在不同pH条件下会发生不同程度的溶胀，体积增大，破坏细胞或溶酶体结构，从而导致细胞死亡，且制备工艺流程简单，易于操作。
Description
技术领域
本发明属于功能材料技术领域，特别涉及一种pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖靶向纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
迄今为止，癌症作为隐形杀手，在全球范围内造成了巨大且日益严重的健康负担，尽管研究人员已经开发出一些有前途的癌症治疗技术，例如免疫疗法，但传统化学疗法仍起着主导作用。为了达到药物的有效临床血药浓度并确保优异的治疗效果，研究人员已提出了多种方法，例如增加药物剂量、重复或连续给药，但大多数化疗药物都具有较大的毒副作用，并且会在反复用药后产生耐药性，从而导致治疗失败。因此，新型抗癌药物和治疗方式的研究成为解决这些问题的主要手段。
新型抗癌药物的主要特点包括毒性低、抗癌谱广、不易产生耐药性等。其中，天然多糖由于具有无毒、可生物降解、环境友好、成本低等特性，已被广泛用于药物输送载体的制备，含有天然多糖的多种纳米粒已有部分被用于临床治疗癌症。因此，利用天然多糖以制备一种新型的抗癌功能性纳米粒具有极高的研究价值和广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供一种纳米粒，所述纳米粒为羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒为具有核-壳结构的双层复合纳米粒。优选地，所述纳米粒的内核为羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒，外壳为叶酸偶联壳聚糖。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒具有空腔结构，例如细胞状的空腔结构。
根据本发明的实施方案，所述内核和外壳之间存在静电相互作用。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒具有pH响应性。优选地，所述纳米粒的pH响应范围为4.5-7.4。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒呈球形或类球形的形状。优选地，所述纳米粒具有基本如图3所示的形貌。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒的平均粒径为300-700nm，例如为400nm、500nm、600nm。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒包括下述重量份的组分：
羧甲基纤维素钠 100-1300重量份
氧化镁 4-40重量份
叶酸偶联壳聚糖 10-200重量份。
优选地，所述羧甲基纤维素钠的重量份为200-1000份，例如201.0份、300份、400份、404.04份、500份、600份、609.14份、700份、800份、816.33份、900份、1212.12份。
优选地，所述氧化镁的重量份为5-30份，例如4份、5份、6份、8份、8.06份、10.08份、15份、20份、25份。
优选地，所述叶酸偶联壳聚糖的重量份为20-150份，例如30份、40份、50份、80份、100份、120份。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒由羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒与叶酸偶联壳聚糖通过静电自组装法制备得到。
根据本发明的实施方案，所述叶酸偶联壳聚糖由本领域常规方法制备得到，例如参照Mansouri方法(Mansouri S,Cuie Y,Winnik F,et al.Characterization of folate-chitosan-DNA nanoparticles for gene therapy[J].Biomaterials,2006,27(9):2060-2065)制备得到叶酸偶联壳聚糖。
本发明还提供上述纳米粒的制备方法，包括如下步骤：羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒与叶酸偶联壳聚糖通过静电自组装法，制备得到所述纳米粒。
优选地，将羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在水中，超声粉碎，而后将羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒滴加至叶酸偶联壳聚糖溶液中，静置，得到所述纳米粒。
根据本发明的实施方案，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的平均粒径为300-600nm，例如平均粒径为350-550nm。
根据本发明的实施方案，所述超声粉碎可以在细胞粉碎机中进行。例如，所述超声粉碎的时间为10-15min。
根据本发明的实施方案，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备方法包括：采用反相微乳液法，使用铁离子(Fe3+)作为交联剂，将掺杂氧化镁的羧甲基纤维素制备成羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒。
优选地，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备方法包括：将羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物以液滴的形式挤入到含有表面活性剂的液体石蜡中，对所得混合体系进行剧烈搅拌、超声粉碎；而后向混合体系中加入六水合三氯化铁溶液，交联固化，冷冻干燥，得到所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒。
优选地，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物为羧甲基纤维素钠、氧化镁和水的混合物；优选地，所述羧甲基纤维素钠在所述混合物中的质量浓度为0.25-3.0wt％；优选地，所述氧化镁在所述混合物中的质量浓度为0.1-1.0mmol。
优选地，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物可以由氧化镁的水分散液和羧甲基纤维素钠的水分散液混合得到。
优选地，所述氧化镁为氧化镁纳米颗粒；例如，所述氧化镁的平均粒径为5-50nm，优选10-30nm。
优选地，所述表面活性剂与液体石蜡的体积比为(5-50):150；例如，体积比为(10-40):150；示例性地，所述体积比为11:150、22:150、33:150。
优选地，所述表面活性剂选自Span 80和Tween 80中的一种或两种。优选地，所述表面活性剂由Span 80和Tween 80组成，Span 80和Tween 80的体积比为10:(0.5-5)；优选为10:(1-3)；示例性为10:1。
优选地，所述液体石蜡、Span 80和Tween 80的体积比为150:(10-15):1。
优选地，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物与含有表面活性剂的液体石蜡的体积比为5:(15-70)，例如5:(20-60)，示例性为5:20、5:30、5:35、5:40、5:50。
优选地，所述剧烈搅拌的时间为20-40min。优选地，所述超声粉碎可以在细胞粉碎机中进行。优选地，所述超声粉碎的功率为30-50％，例如40％。优选地，所述超声粉碎的时间为30-50min。
优选地，所述六水合三氯化铁与羧甲基纤维素钠的质量比为(1.2-5):1，例如(1.5-4):1，示例性为1.7:1、2:1、2.3:1、2.5:1、3:1、4:1。
优选地，所述六水合三氯化铁溶液与混合体系的体积比为20:(20-70)，例如20:(25-60)，示例性为20:25、20:35、20:40、20:45、20:55。
优选地，所述六水合三氯化铁溶液逐滴加入所述混合体系中。
优选地，所交联固化的时间为0.5-5h，例如1-3h，示例性为1h、2h、3h。
优选地，在冷冻干燥前还可以对交联固化得到的产物进行离心、洗涤。例如，用***和去离子水洗涤离心分离得到的产物，以除去残留在颗粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+。
根据本发明的实施方案，所述叶酸偶联壳聚糖溶液中，叶酸偶联壳聚糖的质量体积浓度为(10-120)mg:(10-50)mL，例如(20-100)mg:20mL，示例性为20mg:20mL、30mg:20mL、50mg:20mL、100mg:20mL。
根据本发明的实施方案，所述叶酸偶联壳聚糖溶液为叶酸偶联壳聚糖的酸溶液，例如为叶酸偶联壳聚糖的HAc(醋酸)溶液。优选地，HAc的体积浓度为0.5-5％。
根据本发明的实施方案，所述叶酸偶联壳聚糖与羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的质量比为(2-10):1，例如为(3-7):1，示例性为4:1、5:1、6:1。
根据本发明的实施方案，所述静置的时间为2-10h，例如为3-8h，示例性为3h、4h、5h、6h、7h、8h。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒的制备方法还包括对静置得到的产物进行分离(例如离心分离)和冷冻干燥的步骤。通过冷冻干燥使所述产物中的水迅速升华，由冰晶区域转变为空腔结构，例如细胞状的空腔结构。
根据本发明的实施方案，所述纳米粒的制备方法包括如下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备：将羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物以液滴的形式挤出到液体石蜡、Span 80和Tween 80的混合液中；在室温条件下剧烈搅拌，超声粉碎；然后在不断搅拌下，将FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化；对交联固化得到的产物进行离心分离和洗涤后，冷冻干燥，得到所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒；
(2)将步骤(1)制备得到的羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎，逐滴加入至叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置；产物离心后，经冷冻干燥得到所述纳米粒。
优选地，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备过程包括：将羧甲基纤维素钠溶解在去离子水中配成羧甲基纤维素溶液，至羧甲基纤维素钠充分溶解后(例如60℃电动搅拌4h使羧甲基纤维素钠充分溶解)，得到羧甲基纤维素钠水溶液；超声法将氧化镁纳米颗粒均匀地分散在去离子水中，立即与所述羧甲基纤维素钠水溶液混合，搅拌(例如搅拌1h)，得到均匀分散的羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物。
本发明还提供由上述方法制备得到的纳米粒。
本发明还提供上述纳米粒作为肿瘤治疗药物的应用。本纳米粒适用于大多数肿瘤细胞。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种同时具有pH敏感性和靶向性的纳米粒，其适于弱酸性的肿瘤微环境，具有生物相容性高、可生物降解、能够实现靶向定位和pH响应型溶胀的特性。
羧甲基纤维素钠是一种阴离子水溶性多糖，由天然纤维素衍生而成，通过引入-CH2COOH基团进行修饰。壳聚糖是一种带氨基的阳离子多糖，是几丁质的脱乙酰基衍生物，由于其低毒性，可生物降解性和生物相容性，已被广泛应用于制药行业。本发明利用弱酸性的肿瘤微环境(pH 6.0-7.0)，制备了一种通过壳聚糖和羧甲基纤维素钠相反电荷之间的静电相互作用形成的灵敏的pH响应型纳米粒，纳米粒尺寸小，比表面积大，具有主动靶向，易被细胞吞噬和穿过人体的生物屏障，特殊的核-壳结构可在中性条件下保护纳米粒被网状内皮***免疫清除且具有小的溶胀系数，靶向到达肿瘤部位后，在微酸性环境下，纳米粒发生溶胀，体积增大，破坏细胞或溶酶体结构，从而导致细胞死亡。
本发明得到的纳米粒易被细胞吞噬，具有pH响应型，有利于药物控释和协同给药，且制备工艺流程简单，易于操作。
附图说明
图1为实施例1中羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的扫描电镜图；
图2为实施例1中羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的红外光谱图；
图3为实施例1中羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的扫描电镜图。
图4为实施例1中羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒在不同pH缓冲液中的粒径图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 201.0mg
氧化镁 4.0mg
叶酸偶联壳聚糖 20mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取201.0mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成约0.5wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，得到羧甲基纤维素钠水溶液，静置备用。取4.0mg氧化镁纳米颗粒(粒径为20nm)溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h，得到均匀分散的羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物以液滴的形式挤出到30mL液体石蜡、2.0mL Span 80和0.20mL Tween 80的混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取1081.2mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.20mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入上述混合体系中，交联固化1-3h。固化物经离心分离后，用***和去离子水依次冲洗，以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥，得到羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒。如图1所示，用此方法制得粒径为437±20nm的羧甲基纤维素钠/氧化镁球形纳米粒。
(3)羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备
取20mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将5.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，记为CMC/MgO@FA-CS/BODIPY纳米粒。
该纳米粒为具有核-壳结构的双层复合纳米粒，其中，内核为羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒，外壳为叶酸偶联壳聚糖，以及由羧甲纤维素钠和Fe3+交联形成的空腔。
对得到的CMC/MgO@FA-CS/BODIPY纳米粒进行红外表征，得到其红外光谱图(图2)，证明该纳米粒制备成功。
如图3所示，CMC/MgO@FA-CS/BODIPY纳米粒的形貌为规整的球状，粒径为500nm左右。
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的pH响应性测定：
取少量CMC/MgO@FA-CS/BODIPY纳米粒分别加入到不同pH值(pH 7.4、6.5、4.5)的缓冲溶液中，超声粉碎5min。吸取适量样品溶液测定不同pH值下三种纳米粒的粒径。
如图4所示，CMC/MgO@FA-CS/BODIPY纳米粒的粒径随着pH的减小而增加，证明羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒具有pH响应性。
实施例2
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 404.04mg
氧化镁 4.0mg
叶酸偶联壳聚糖 20mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取404.04mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成1.0wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，静置备用。取4.0mg氧化镁溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h获得均匀分散的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁溶液以液滴的形式挤出到22.5mL液体石蜡、1.5mL Span 80和0.15mL Tween 80混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取1620.18mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.30mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化1-3h。离心分离后用***和去离子水依次冲洗以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥。
(3)pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备
取20mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将5.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。该纳米粒具有与实施例1制备的纳米粒相同的结构。
按照实施例1中纳米粒pH响应性的测定方法，本实施例制备的纳米粒的粒径同样随着pH的减小而增加。
实施例3
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 609.14mg
氧化镁 8.06mg
叶酸偶联壳聚糖 50mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取609.14mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成1.5wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，静置备用。取8.06mg氧化镁溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h获得均匀分散的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁溶液以液滴的形式挤出到30mL液体石蜡、2.0mL Span 80和0.20mL Tween 80混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取1081.2mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.20mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化1-3h。离心分离后用***和去离子水依次冲洗以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥。
(3)pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备
取50mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将10.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。该纳米粒具有与实施例1制备的纳米粒相同的结构。
按照实施例1中纳米粒pH响应性的测定方法，本实施例制备的纳米粒的粒径同样随着pH的减小而增加。
实施例4
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 609.14mg
氧化镁 8.06mg
叶酸偶联壳聚糖 50mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取609.14mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成1.5wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，静置备用。取8.06mg氧化镁溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h获得均匀分散的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁溶液以液滴的形式挤出到45mL液体石蜡、3.0mL Span 80和0.30mL Tween 80混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取2160.24mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.40mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化1-3h。离心分离后用***和去离子水依次冲洗以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥。
(3)pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备
取50mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将10.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。该纳米粒具有与实施例1制备的纳米粒相同的结构。按照实施例1中纳米粒pH响应性的测定方法，本实施例制备的纳米粒的粒径同样随着pH的减小而增加。
实施例5
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 816.33mg
氧化镁 10.08mg
叶酸偶联壳聚糖 100mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取816.33mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成2.0wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，静置备用。取10.08mg氧化镁溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h获得均匀分散的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁溶液以液滴的形式挤出到45mL液体石蜡、3.0mL Span 80和0.30mL Tween 80混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取2160.24mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.40mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化1-3h。离心分离后用***和去离子水依次冲洗以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥。
(3)pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖靶向纳米粒的制备
取100mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将20.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。该纳米粒具有与实施例1制备的纳米粒相同的结构。
按照实施例1中纳米粒pH响应性的测定方法，本实施例制备的纳米粒的粒径同样随着pH的减小而增加。
实施例6
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，由下述质量的组分组成：
羧甲基纤维素钠 609.14mg
氧化镁 10.08mg
叶酸偶联壳聚糖 50mg
羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物的制备
取609.14mg羧甲基纤维素钠溶解于40mL去离子水中，配成1.5wt％的羧甲基纤维素钠溶液，60℃电动搅拌4h，充分溶解后，静置备用。取10.08mg氧化镁溶解于0.5mL去离子水中，置于超声清洗机中超声10-20min，使氧化镁纳米颗粒均匀地分散在水中后，将其立即与10mL羧甲基纤维素钠水溶液混合，并通过进一步搅拌1-2h获得均匀分散的混合物。
(2)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备
使用细塑料注射器(3cm3)将5mL羧甲基纤维素钠/氧化镁溶液以液滴的形式挤出到30mL液体石蜡、2.0mL Span 80和0.20mL Tween 80混合液中。在室温条件下剧烈搅拌20-40min，开启超声细胞粉碎机，功率40％，粉碎30-50min。取1620.18mg FeCl3·6H2O溶于20mL去离子水中，然后在不断搅拌下将0.30mol/L FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化1-3h。离心分离后用***和去离子水依次冲洗以除去残留在珠粒表面的液体石蜡、表面活性剂和未反应Fe3+离子，冷冻干燥。
(3)pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备
取50mg叶酸偶联壳聚糖加入至20mL 2％(体积分数)HAc中，将10.0mg羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎10-15min后逐滴加入至上述叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置4-6h。产物离心后，经冷冻干燥得到pH响应型羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒。该纳米粒具有与实施例1制备的纳米粒相同的结构。
按照实施例1中纳米粒pH响应性的测定方法，本实施例制备的纳米粒的粒径同样随着pH的减小而增加。
上述实施例制备的具有pH敏感性的纳米粒，能够适于弱酸性的肿瘤微环境(pH6.0-7.0)，具有生物相容性高、可生物降解、能够实现靶向定位和pH响应型溶胀的特性。其具有主动靶向，易被细胞吞噬和穿过人体的生物屏障，特殊的核-壳结构可在中性条件下保护纳米粒被网状内皮***免疫清除且具有小的溶胀系数，靶向到达肿瘤部位后，在微酸性环境下，纳米粒发生溶胀，体积增大，破坏细胞或溶酶体结构，从而导致细胞死亡。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (19)
1.一种纳米粒，所述纳米粒为羧甲基纤维素钠/氧化镁/叶酸偶联壳聚糖纳米粒，所述纳米粒由羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒与叶酸偶联壳聚糖通过静电自组装法制备得到；
所述纳米粒为具有核-壳结构的双层复合纳米粒，所述纳米粒的内核为羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒，外壳为叶酸偶联壳聚糖；
所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒采用反相微乳液法，使用铁离子Fe3+作为交联剂，由掺杂氧化镁的羧甲基纤维素制备得到。
2.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒具有空腔结构。
3.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述内核和外壳之间存在静电相互作用。
4.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒具有pH响应性，所述纳米粒的pH响应范围为4.5-7.4。
5.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒呈球形或类球形的形状。
6.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的平均粒径为300-700nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒包括下述重量份的组分：
羧甲基纤维素钠 100-1300重量份
氧化镁 4-40重量份
叶酸偶联壳聚糖 10-200重量份。
8.权利要求1-7任一项所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒与叶酸偶联壳聚糖通过静电自组装法，制备得到所述纳米粒；
所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒采用反相微乳液法，使用铁离子Fe3+作为交联剂，由掺杂氧化镁的羧甲基纤维素制备得到。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，将羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在水中，超声粉碎，而后将羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒滴加至叶酸偶联壳聚糖溶液中，静置，得到所述纳米粒。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的平均粒径为300-600nm。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备方法包括：将羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物以液滴的形式挤入到含有表面活性剂的液体石蜡中，对所得混合体系进行剧烈搅拌、超声粉碎；而后向混合体系中加入六水合三氯化铁溶液，交联固化，冷冻干燥，得到所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物为羧甲基纤维素钠、氧化镁和水的混合物；
和/或，所述表面活性剂与液体石蜡的体积比为(5-50):150；
和/或，所述表面活性剂选自Span 80和Tween 80中的一种或两种；
和/或，所述六水合三氯化铁与羧甲基纤维素钠的质量比为(1.2-5):1；
和/或，所述六水合三氯化铁溶液与混合体系的体积比为20:(20-70)；
和/或，所交联固化的时间为0.5-5h；
和/或，在冷冻干燥前还需要对交联固化得到的产物进行离心、洗涤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠在所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物中的质量浓度为0.25-3.0wt％，所述氧化镁在所述羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物中的含量为0.1-1.0mmol；
和/或，所述氧化镁为氧化镁纳米颗粒；
和/或，所述表面活性剂由Span 80和Tween 80组成，Span 80和Tween 80的体积比为10:(0.5-5)。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述叶酸偶联壳聚糖溶液中，叶酸偶联壳聚糖的质量体积浓度为(10-120)mg:(10-50)mL；
和/或，所述叶酸偶联壳聚糖与羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的质量比为(2-10):1；
和/或，所述静置的时间为2-10h。
15.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述叶酸偶联壳聚糖溶液为叶酸偶联壳聚糖的酸溶液。
16.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述叶酸偶联壳聚糖溶液为叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液。
17.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述纳米粒的制备方法还包括对静置得到的产物进行分离和冷冻干燥的步骤。
18.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纳米粒的制备方法包括如下步骤：
(1)羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒的制备：将羧甲基纤维素钠/氧化镁的混合物以液滴的形式挤出到液体石蜡、Span 80和Tween 80的混合液中；在室温条件下剧烈搅拌，超声粉碎；然后在不断搅拌下，将FeCl3·6H2O溶液逐滴加入，交联固化；对交联固化得到的产物进行离心分离和洗涤后，冷冻干燥，得到所述羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒；
(2)将步骤(1)制备得到的羧甲基纤维素钠/氧化镁纳米粒分散在去离子水中，超声粉碎，逐滴加入至叶酸偶联壳聚糖的HAc溶液中，静置；产物离心后，经冷冻干燥得到所述纳米粒。
19.权利要求1-7任一项所述的纳米粒作为肿瘤治疗药物的应用。
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2021
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备;柳时 等;医药导报(06);第561-563页 * |
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