CN115151810A - 实现使用单细胞样品作为单色补偿对照的双特异性探针 - Google Patents

实现使用单细胞样品作为单色补偿对照的双特异性探针 Download PDF

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詹姆斯·贾迪亚里
米尔科·科尔塞利
亚当·莱特
亚伦·雅各布·泰兹尼克
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Abstract

本文的公开内容包括适用于多参数流式细胞术中的光谱解混和补偿的方法、组合物和试剂盒。本文的公开内容包括包含两个彼此缀合以形成双特异性试剂(例如，双特异性探针)的抗体的试剂。第一抗体可以具有对感兴趣细胞的表面上的高表达抗原的亲和力，并且第二抗体可以具有对多参数组中的每种抗体‑染料缀合物的亲和力。在一些实施方案中，提供了使用双特异性试剂来确定溢出、进行补偿和产生补偿矩阵的方法。

Description

实现使用单细胞样品作为单色补偿对照的双特异性探针
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年2月25日提交的美国临时申请第62/981479号的优先权以及2020年5月7日提交的美国临时申请第63/021363号的优先权。这些申请的全部内容特此明确地通过引用以其整体并入。
背景
领域
本公开内容总体上涉及使用荧光检测试剂的检测测定领域，例如荧光免疫测定，诸如通过流式细胞术进行的检测测定，并且更具体地涉及用于减少样品分析中误差的方法。
对相关技术的描述
颗粒分析仪，诸如流式细胞仪和扫描细胞仪，是本领域熟知的。在这些***中，通过使每个颗粒暴露于激发光(通常是一束或更多束激光)并测量来自每种染料标记的所得荧光，来单独分析荧光标记的颗粒，诸如分子、被分析物结合的珠或单个细胞。每个颗粒都可以用多于一种光谱不同的荧光染料标记。通常，检测是使用多于一个光检测器进行的，每个待检测的不同染料对应一个光检测器。流式细胞仪和扫描细胞仪二者都可以从例如BDBiosciences(San Jose,California)商购。在流式细胞仪中，例如，流体悬浮液中的颗粒(诸如分子、结合分析物的珠或单个细胞)通过检测区域，在该检测区域中颗粒暴露于通常来自一束或更多束激光的激发光，并测量颗粒的光散射和荧光特性。标志物(诸如细胞的其存在可用作区分特征的细胞表面蛋白组分)可以由包括荧光染料的试剂(例如检测试剂)识别以促进检测、鉴定和表征。每种检测试剂可以包括与检测器分子缀合的标记，通常是荧光分子或“染料”，所述检测器分子将与特定标志物(例如，单克隆抗体)选择性附接。通过使用光谱不同的荧光染料标记标志物，可以区分多于一种不同的颗粒或组分。在一些实现中，分析仪中包括多于一个光检测器。当颗粒通过激光束时，在前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)检测器并且可能还在荧光发射检测器上将产生时间相关脉冲。这就是“事件”，并且对于每个事件，存储每个检测器、FSC、SSC和荧光发射检测器的检测器输出的幅度。所获得的数据包括对每个光散射参数和荧光发射测量的信号。
细胞仪还可以包括用于存储检测器输出和分析数据的组件。例如，可以使用连接到检测电子设备的计算机来执行数据存储和分析。例如，数据可以以表格形式进行逻辑存储，其中每一行对应于一个颗粒(或一个事件)的数据，并且列对应于每一个测量的参数。使用标准文件格式(诸如“FCS”文件格式)来存储来自流式细胞仪的数据有助于使用单独的程序和/或机器分析数据。使用当前的分析方法，数据通常以二维(2D)图展示以便于可视化，但其他方法可用于可视化多维数据。
使用流式细胞仪测量的参数通常包括FSC、SSC和从光谱的一个或更多个通道(频带)中的荧光分子发射的光，FSC是指由颗粒沿大致前向方向散射的激发光，SSC是指由颗粒沿大致侧向散射的激发光，从光谱的一个或更多个通道(频带)中的荧光分子发射的光称为FL1、FL2等或以主要在该通道中发射的荧光染料为名。由于用染料标记的抗体标记不同的细胞蛋白，可以通过散射参数和荧光发射来鉴定不同的细胞类型。
流式细胞仪和扫描细胞仪二者都可以从例如BD Biosciences(San Jose,California)商购。流式细胞术在例如以下中描述：Landy等人(编著),Clinical FlowCytometry,Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677(1993)；Bauer等人(编著),Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,Williams&Wilkins(1993)；Ormerod(编著),Flow Cytometry:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人(编著),Flow Cytometry Protocols,Methods in MolecularBiology No.91,Humana Press(1997)；和Practical Shapiro,Flow Cytometry,第四版,Wiley-Liss(2003)；全部通过引用并入本文。荧光成像显微术在例如Pawley(编著),Handbook of Biological Confocal Microscopy,第二版,Plenum Press(1989)中描述，其通过引用并入本文。
在采用多于一个光检测器来检测多于一种染料的流式细胞仪和其他仪器中，收集的光通常由频率依赖滤光器和二向色镜***分离成特定的波长范围，使得由特定光检测器检测到的光被限制到预先定义的波长范围，称为检测通道。选择检测通道和染料使得每种染料的发射光谱的峰值在不同检测通道的频率范围内，例如，每个检测通道主要检测来自单一染料的发射。然而，由于荧光染料发射光谱的广度，通常染料会在多于一个检测通道中发出荧光，并且因此染料荧光的测量不是独立的。一种染料在意图用于检测其他染料的检测通道中的发射由许多术语来表示，诸如溢出(spillover)、光谱重叠和串扰。
降低光谱重叠对染料荧光测量的影响的方法是本领域已知的。这样的方法包括以计算的补偿来自除了待检测的主要染料之外的染料的贡献的量调整由每个光检测器测量的信号。流式细胞术领域中的实例包括Bagwell等人,1993,“Fluorescence SpectralOverlap Compensation for any Number of Flow Cytometer Parameters”,Ann.N.Y.Acad.Sci.677:167-184；Roederer等人,1997,“Eight Color,10-Parameter FlowCytometry to Elucidate Complex Leukocyte Hetrogeneity”,Cytometry 29:328-339；和Bigos等人,1999,Cytometry 36:36-45；Verwer,2002,BD FACSDiVaTMOption for the BDFACSVantage SE Flow Cytometer White Paper,以及美国专利第6,897,954号；每一项通过引用并入本文。WinListTM(Verity Software House,Topsham,Me.)和FlowJo 5.7.2软件(Tree Star,Inc.,Ashland,Oreg.)是允许对流式细胞仪产生的存储数据文件进行软件补偿的独立的软件包。
通常，所需的荧光光谱重叠补偿的量是使用补偿对照珠、具有在测定中使用的荧光染料之一的单色颗粒染料来实验确定的。在每个通道中测量每个珠的荧光信号，这直接提供了光谱重叠在每个通道中的量度。测量荧光标记的抗体试剂(例如，检测试剂)在每个检测通道中的光谱重叠的一种方法是使用BDTMCompBead补偿颗粒(BD Biosciences,SanJose,Calif.)。被抗Ig抗体包被的颗粒与被捕获在珠的表面上的荧光标记的抗体试剂组合，以产生用荧光染料标记的颗粒。通过测量每个检测通道中标记的颗粒的发射来确定染料的光谱重叠。测量通常相对于未标记颗粒的发射进行。对多参数流式细胞术中能够改进光谱解混(spectral unmixing)和补偿(并从而改进分辨率)的方法和组合物存在需求。
概述
本文的公开内容包括用于确定溢出的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与包含第一标记的第一检测试剂特异性结合的捕获探针，其中第一标记的发射光谱包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器，其中第一检测器能够检测第一检测波长范围内的发射并且第二检测器能够检测第二检测波长范围内的发射，其中第一峰值发射波长在第一检测波长范围内而不在第二检测波长范围内，其中第一发射波长范围的一部分与第二检测波长范围重叠；以及对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值，其中溢出包括第二参考值。在一些实施方案中，捕获探针能够与第二检测试剂特异性结合，该方法包括：提供与双特异性试剂和包含第二标记的第二检测试剂关联的细胞；以及对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值。
本文的公开内容包括用于在包括第一检测器和第二检测器的仪器上进行多标记实验的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合，并且其中第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值；以及对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。
本文的公开内容包括用于进行补偿的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合并且第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值；对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。
该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个以及第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
本文的公开内容包括对用于使用多于一个检测器分析多于一种标记的仪器产生补偿矩阵的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；以及基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
在一些实施方案中，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵包括：对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个以及第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。在一些实施方案中，提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞包括：使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与双特异性试剂接触以形成与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包括能够与细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中双特异性试剂包含能够与第一检测试剂和/或第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及将第一检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触以形成与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞。在一些实施方案中，提供与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞包括：使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与双特异性试剂接触以形成与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包括能够与细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中双特异性试剂包含能够与第一检测试剂和/或第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及将第二检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触以形成与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞。
该方法可以包括：对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。该方法可以包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合，并且其中第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；以及对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。
该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于溢出矩阵和/或补偿矩阵调整第一实验值和/或第二实验值。在一些实施方案中，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于溢出矩阵产生补偿矩阵。在一些实施方案中，补偿矩阵是溢出矩阵的倒数(inverse)。在一些实施方案中，补偿矩阵存储在仪器中以供后续使用。在一些实施方案中，溢出包括由第二检测器检测到的第一标记的发射和/或由第一检测器检测到的第二标记的发射。
在一些实施方案中，多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞源自同一细胞样品。在一些实施方案中，多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞包括多于一个单细胞。在一些实施方案中，多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞包括异质细胞群体。在一些实施方案中，多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞包括两种或更多种细胞类型。在一些实施方案中，一个或更多个事件包括约10个事件至约100,000个事件。在一些实施方案中，多于一个未标记细胞不与第一检测试剂或第二检测试剂关联。在一些实施方案中，多于一个未标记细胞不与标记关联。在一些实施方案中，多于一个未标记细胞不与荧光团关联。
在一些实施方案中，与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射和与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射一样高。在一些实施方案中，与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射比与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射高至少约5％。在一些实施方案中，与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射和与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射一样高。在一些实施方案中，与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射比与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射高至少约5％。
在一些实施方案中，仪器包括流式细胞仪。在一些实施方案中，流式细胞仪包括常规流式细胞仪。在一些实施方案中，流式细胞仪包括光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合。在一些实施方案中，仪器包括多荧光成像***。在一些实施方案中，仪器包括荧光显微镜。在一些实施方案中，仪器包括蛋白阵列。在一些实施方案中，测量包括进行免疫组织化学测定。在一些实施方案中，测量包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，第一检测器和/或第二检测器与一个或更多个滤光器配对。在一些实施方案中，一个或更多个滤光器包括长通滤光器、短通滤光器、带通滤光器或其任何组合。在一些实施方案中，仪器包括一个或更多个激发激光器。在一些实施方案中，第一检测器和/或第二检测器包括光检测器。在一些实施方案中，第一检测器和/或第二检测器包括荧光发射检测器。在一些实施方案中，第一标记和/或第二标记包含荧光团。在一些实施方案中，发射包括荧光发射。在一些实施方案中，第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个包括荧光强度值。在一些实施方案中，第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个包括平均荧光强度值。在一些实施方案中，第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个包括中位荧光强度值。在一些实施方案中，第一背景发射值和/或第二背景发射值包括自体荧光。在一些实施方案中，第一检测试剂包括第三标记，其中第一标记和第三标记在紧密靠近时能够进行荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)。在一些实施方案中，第一标记和第三标记包括串联染料。
在一些实施方案中，第一标记的发射光谱包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长。在一些实施方案中，第二标记的发射光谱包括第二发射波长范围和第二峰值发射波长。在一些实施方案中，第一检测器能够检测第一检测波长范围内的发射。在一些实施方案中，第二检测器能够检测第二检测波长范围内的发射。在一些实施方案中，第二发射波长范围不同于第一检测波长范围。在一些实施方案中，第二峰值发射波长不同于第一峰值发射波长。在一些实施方案中，第一发射波长范围不同于第二检测波长范围。在一些实施方案中，第一峰值发射波长范围不同于第二峰值发射波长范围。在一些实施方案中，第一发射波长范围的一部分与第二检测波长范围重叠。在一些实施方案中，第二发射波长范围的一部分与第一检测波长范围重叠。在一些实施方案中，第一峰值发射波长在第一检测波长范围内，并且其中第一峰值发射波长不在第二检测波长范围内。在一些实施方案中，第二峰值发射波长在第二检测波长范围内，并且其中第二峰值发射波长不在第一检测波长范围内。在一些实施方案中，第一检测器是第一标记的主检测器，并且其中第二检测器是第一标记的次检测器。在一些实施方案中，第二检测器是第二标记的主检测器，并且其中第一检测器是第二标记的次检测器。
在一些实施方案中，仪器包括前向散射检测器和侧向散射检测器。该方法可以包括：对于未标记细胞的一个或更多个事件，对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，和/或对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。该方法可以包括：基于前向散射值和侧向散射值确定未标记细胞的一个或更多个事件、与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件和/或与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。该方法可以包括：将未标记细胞的一个或更多个事件、与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件和/或与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。在一些实施方案中，前向散射-侧向散射图区域包括多于一个相邻的前向散射-侧向散射图位置。在一些实施方案中，前向散射-侧向散射图区域包括约10个事件至约100,000个事件的前向散射-侧向散射图位置。在一些实施方案中，同一细胞类型的细胞的事件与同一前向散射-侧向散射图区域关联。在一些实施方案中，不同细胞类型的细胞的事件与不同前向散射-侧向散射图区域关联。在一些实施方案中，两种或更多种细胞类型与不同的前向散射-侧向散射图区域关联。
该方法可以包括：将与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第一参考值和/或第二参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：将与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第三参考值和/或第四参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：将未标记细胞的一个或更多个事件的第一背景发射值和/或第二背景发射值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，产生用于一个或更多个前向散射-侧向散射图区域的溢出矩阵和/或补偿矩阵。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。该方法可以包括：基于前向散射值和侧向散射值确定与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。该方法可以包括：将与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的溢出矩阵和/或补偿矩阵调整第一实验值和/或第二实验值。
在一些实施方案中，与不使用双特异性试剂的可比方法相比，使用双特异性试剂将分辨灵敏度增加至少约5％，其中分辨灵敏度包括仪器在模糊标记细胞(dimly labeledcell)和未标记细胞之间进行区分的能力。在一些实施方案中，模糊标记细胞包括与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，第一实验值比第一背景发射值大以下：少于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在一些实施方案中，模糊标记细胞包括与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，第二实验值比第二背景发射值大以下：少于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在一些实施方案中，可比方法采用补偿珠。在一些实施方案中，可比方法采用补偿珠来产生溢出矩阵和/或补偿矩阵。在一些实施方案中，补偿珠包括BD CompBead、OneComp珠、UltraComp珠、VersaComp珠或其任何组合。
在一些实施方案中，第一检测试剂、第二检测试剂、双特异性试剂、捕获探针和锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。在一些实施方案中，捕获探针能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合。在一些实施方案中，第一检测试剂和/或第二检测试剂包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域。在一些实施方案中，重链恒定结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是λ轻链恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是κ轻链恒定结构域。在一些实施方案中，抗体或其片段源自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猴、牛、猪、马、山羊、绵羊或其任何组合。在一些实施方案中，双特异性试剂包括抗体或其片段和抗体或其片段的缀合物。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与抗体或其片段缀合。在一些实施方案中，缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。在一些实施方案中，缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。在一些实施方案中，缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方案中，抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体(diabody)、三特异抗体(triabody)、四特异抗体(tetrabody)、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv(disulfide-linked Fv)、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
该方法可以包括：基于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第一实验值和/或第二实验值确定样品细胞的一个或更多个特征。在一些实施方案中，一个或更多个特征包括多于一个样品细胞中的一个或更多个中第一细胞靶和/或第二细胞靶的拷贝数。在一些实施方案中，第一细胞靶和/或第二细胞靶包括碳水化合物、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，第一细胞靶和/或第二细胞靶在细胞表面上。
在一些实施方案中，细胞表面靶包括碳水化合物、脂质、蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，细胞表面靶包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、HLA蛋白、β2微球蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，细胞表面靶的丰度是第一细胞靶和/或第二细胞靶的至少约2倍。
双特异性试剂可以包括多于一种双特异性试剂。在一些实施方案中，多于一种双特异性试剂包括相同的双特异性试剂。在一些实施方案中，多于一种双特异性试剂包括两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物。在一些实施方案中，双特异性试剂包括包含两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物的双特异性试剂组合物。在一些实施方案中，两种或更多种不同的双特异性试剂能够与不同的检测试剂特异性结合。在一些实施方案中，两种或更多种不同的双特异性试剂能够与不同的细胞表面靶特异性结合。该方法可以包括：在使多于一种双特异性试剂与多于一个对照细胞接触之后，去除多于一种双特异性试剂中未与多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂。在一些实施方案中，去除未与多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂包括：去除未与细胞表面靶接触的一种或更多种双特异性试剂。
在一些实施方案中，第一检测试剂包括多于一种第一检测试剂和/或其中第二检测试剂包括多于一种第二检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂与多于一个样品细胞接触之后，去除多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂中未与多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂。在一些实施方案中，去除多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂中未与多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂包括：分别去除未与第一细胞靶和第二细胞靶接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第一检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除多于一种第一检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂。在一些实施方案中，去除多于一种第一检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂包括：去除未与双特异性试剂接触的一种或更多种第一检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第二检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除多于一种第二检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂。在一些实施方案中，去除多于一种第二检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂包括：去除未与双特异性试剂接触的一种或更多种第二检测试剂。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包括：与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含与细胞上的细胞表面靶特异性结合的锚定探针和能够与检测试剂特异性结合的捕获探针。在一些实施方案中，检测试剂能够与细胞靶特异性结合，并且其中细胞表面靶的丰度是细胞靶的至少约2倍。在一些实施方案中，双特异性试剂、检测试剂、捕获探针和/或锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。在一些实施方案中，捕获探针能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合。在一些实施方案中，检测试剂包括重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域，任选地其中检测试剂包含荧光团。在一些实施方案中，重链恒定结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域包括λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。在一些实施方案中，双特异性试剂包括抗体或其片段和抗体或其片段的缀合物。在一些实施方案中，抗体或其片段经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与抗体或其片段缀合。在一些实施方案中，缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。在一些实施方案中，缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。在一些实施方案中，缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
附图简述
图1描绘了在本文提供的方法和组合物中采用的非限制性示例性流式细胞仪。
图2描绘了在本文提供的方法和组合物中采用的标记的发射光谱和光检测器的滤光器窗口的非限制性示例性图。
图3描绘了用于多参数流式细胞术的非限制性示例性补偿工作流程。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列，以及其他数据库在相关技术方面通过引用以其整体并入。
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见例如，Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第二版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。
图1示出了根据本文提供的方法和组合物的说明性实施方案用于流式细胞术的***100。***100包括流式细胞仪110、控制器/处理器190和存储器195。流式细胞仪110包括一个或更多个激发激光器115a-c、聚焦透镜120、流通室125、前向散射检测器130、侧向散射检测器135、荧光收集透镜140、一个或更多个分束器145a-g、一个或更多个带通滤光器150a-e、一个或更多个长通(“LP”)滤光器155a-b和一个或更多个荧光发射检测器160a-f。
激发激光器115a-c发射激光束形式的光。在图1的示例***中，从激发激光器115a-c发射的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过分束器145a和145b中的一个或更多个。分束器145a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器145b透射UV光(波长在10nm至400nm范围内的光)并反射488nm和633nm的光。
激光束然后被引导到聚焦透镜120，聚焦透镜120将光束聚焦到流通室125内流体流中样品颗粒所在的部分上。流通室是流体***的一部分，所述流体***将流中的颗粒(通常一次一个)引导到聚焦的激光束进行询问(interrogation)。流通室可以包含台式细胞仪中的流通池或在空气中流式(stream-in-air)细胞仪中的喷嘴尖端。
来自一个或多于一个激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收与样品中的颗粒相互作用，并以各种不同的波长再发射，这取决于颗粒的特征，诸如其尺寸、内部结构以及附接到颗粒的或天然存在于颗粒上或颗粒中的一个或更多个荧光分子的存在。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以通过分束器145a-g、带通滤光器150a-e、长通滤光器155a-b和荧光收集透镜140中的一个或更多个被发送到前向散射检测器130、侧向散射检测器135和一个或更多个荧光发射检测器160a-f中的一个或更多个。
荧光收集透镜140收集从颗粒-激光束相互作用发射的光，并将该光发送到一个或更多个分束器和滤光器。带通滤光器(诸如带通滤光器150a-e)允许窄范围的波长通过滤光器。例如，带通滤光器150a是510/20滤光器。第一个数字代表一个光谱带的中心。第二个数字提供光谱带的范围。因此，510/20滤光器在光谱带中心的每一侧延伸10nm，或从500nm延伸至520nm。短通滤光器透射等于或短于指定波长的光波长。长通滤光器(诸如长通滤光器155a-b)透射等于或长于指定光波长的光波长。例如，作为670nm长通滤光器，长通滤光器155a透射等于或长于670nm的光。通常对滤光器进行选择以优化检测器对于特定荧光染料的特异性。可以对滤光器进行配置使得透射到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
分束器将不同波长的光导向不同的方向。分束器可以用滤光器特性(诸如短通和长通)来表征。例如，分束器145g是620SP分束器，这意味着分束器145g透射620nm或更短的光波长，并在不同方向上反射长于620nm的光波长。在一个实施方案中，分束器145a-g可以包括光学镜，诸如二向色镜。
前向散射检测器130被定位为略微偏离穿过流通池的直接光束的轴，并且被配置为检测衍射光，即主要在前向方向上穿过颗粒或绕过颗粒行进的激发光。前向散射检测器检测到的光的强度取决于颗粒的总体尺寸。前向散射检测器可以包括光电二极管。侧向散射检测器135被配置为检测来自颗粒的表面和内部结构的折射的和反射的光，并且随着颗粒结构复杂性的增加而趋于增加。可以通过一个或更多个荧光发射检测器160a-f检测来自与颗粒关联的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器135和荧光发射检测器可以包括光电倍增管。在前向散射检测器130、侧向散射检测器135和荧光发射检测器处检测到的信号可以由检测器转换为电子信号(电压)。该数据可以提供关于样品的信息。
本领域技术人员将认识到，根据所公开的方法和组合物的实施方案的流式细胞仪不限于图1中描绘的流式细胞仪，而是可以包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有任何数目的各种波长和各种不同的配置的激光器、分束器、滤光器和检测器。
在操作中，细胞仪操作由控制器/处理器190控制，并且来自检测器的测量数据可以存储在存储器195中并由控制器/处理器190处理。尽管未明确示出，但控制器/处理器190被耦合到检测器以接收来自检测器的输出信号，并且还可以被耦合到流式细胞仪100的电组件和机电组件以控制激光器、流体流动参数等。还可以在***中提供输入/输出(I/O)电容197。存储器195、控制器/处理器190和I/O 197可以作为流式细胞仪110的集成部分而完整提供。在这样的实施方案中，显示器还可以形成I/O电容197的一部分，用于向细胞仪100的使用者呈现实验数据。可选地，存储器195和控制器/处理器190以及I/O电容中的一些或全部可以是一个或更多个外部设备(诸如通用计算机)的一部分。在一些实施方案中，存储器195和控制器/处理器190中的一些或全部可以与细胞仪110无线或有线通信。控制器/处理器190与存储器195和I/O 197一起可以被配置为执行与流式细胞仪实验的准备和分析有关的各种功能。
图1的***包括六个不同的检测器，所述检测器检测六个不同波长带中的荧光(对于给定的检测器，其在本文中可称为“滤光器窗口”或“荧光通道”)，这是由从流通池125到每个检测器的光束路径中滤光器和/或分光器的配置所定义的。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子会在其自身的特征波长带发射光。用于实验的特定荧光标记及其相关的荧光发射带可被选择为大致与检测器的滤光器窗口重合。然而，随着更多的检测器被提供和更多的标记被使用，滤光器窗口和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。一般真实的是，尽管特定荧光分子的发射光谱的峰值可能位于一个特定检测器的滤光器窗口内，但该标记的一些发射光谱也将与一个或更多个其他检测器的滤光器窗口重叠。这可以称为溢出。
I/O 197可以被配置为接收关于流式细胞仪实验的数据，所述流式细胞仪实验具有一组荧光标记和带有多于一种标志物的多于一个细胞群体，每个细胞群体具有多于一种标志物的子集。I/O 197还可以被配置为接收将一种或更多种标志物分配到一个或更多个细胞群体的生物数据、标志物密度数据、发射光谱数据、将标记分配到一种或更多种标志物的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据(诸如标记光谱特性和流式细胞仪配置数据)也可以存储在存储器195中。控制器/处理器190可被配置为评价标记到标志物的一次或更多次分配。
图2示出了由不同标记的重叠发射光谱引起的溢出(例如，光谱重叠)的说明性实例。图2示出了用FITC标记的标志物的发射光谱(由从波长约475nm延伸至650nm的曲线表示)和用于“FITC检测器”的滤光器窗口。一个或更多个滤光器，诸如如图1中描绘的带通滤光器150b，可以放置在检测器的前面，限制可以到达检测器的波长范围，该波长范围构成滤光器窗口。用于FITC检测器的滤光器窗口是530/30，这意味着滤光器窗口从515nm延伸至545nm。FITC滤光器窗口由从515nm延伸至545nm的带阴影的矩形表示。图2还示出了用PE标记的标志物的发射光谱，由从约525nm延伸至约725nm的曲线表示。一个或更多个滤光器，诸如如图1中描绘的带通滤光器150c，可以放置在检测器的前面。用于PE检测器的滤光器窗口是585/42，这意味着滤光器窗口从564nm延伸至606nm。PE滤光器窗口由从564nm延伸至606nm的带阴影的矩形表示。图2图示了，FITC的一部分发射光谱与用于PE检测器的滤光器窗口重叠，标记为“FITC向PE的溢出”。因此，在PE检测器中检测到FITC标记的一些荧光发射，并与PE标记的荧光发射一起测量。溢出可以引起对存在于颗粒上的标记的丰度得出不准确的结论。随着更多的标记和检测器被利用，减少了荧光峰和滤光器窗口的分离，这一问题在流式细胞仪的最近使用中可以尤其严重。还由于可用的荧光标记的数目不断增加(对实验人员可用的通常有几十种(dozens)选择)，和不同的峰值波长、发射强度和能量、光谱宽度特性、细胞上被表征的不同的标志物密度，以及在一些情况下可选择的滤光器窗口，设计用于流式细胞仪实验的合适的设置是非常具有挑战性的。另外的困难是被表征的细胞或其他颗粒的自体荧光。这种自体荧光信号还将与一个或更多个滤光器窗口重叠，在测量中引起噪声。自体荧光噪声信号还可以取决于被询问的颗粒/细胞的类型。
在一些实施方案中，为了考虑多于一种标记在多于一个检测器上的溢出，可以通过每个相应的滤光器窗口来表征所有检测器中所有标记的光谱重叠值。例如，在每个检测事件中，给定检测器的响应可以是给定检测器滤光器窗口的重叠与每个标记分别乘以检测事件期间存在的每个标记的量的乘积之和。对于在实验期间用于检测n个不同标记的一组m个检测器，将事件的观察到的m个检测器响应与事件的n个标记中的每个的标记丰度关联的线性方程组可以表示为d＝Ma，其中d是事件的所有m个检测器之中的输出测量的m×1列向量，a是实验中使用的n个标记中的每一个的标记丰度的n×1列向量，并且M是m行×n列“溢出矩阵”。溢出矩阵M具有项Sij，其中Sij对应于检测器i(其中i从1运行至m)对标记j(其中j从1运行至n)的响应。例如，图2的“FITC溢出到PE”区域的面积指示溢出矩阵项，其中检测器i对应于PE检测器，并且标记j对应于FITC标记。当运行实验时，测量每个事件的检测器输出，并且每个事件的标记丰度使用公式a＝M-1d导出，基于在每个事件测量的检测器输出产生每个事件的每个标记的丰度值。
用于确定光谱重叠、产生溢出矩阵、产生补偿矩阵和进行补偿的方法先前已经公开在例如美国专利第8,779,387号、第8,004,674号、第8,158,429号、第8,158,429号、第7,507,588号、第4,704,891号、第6,897,954号、第8,865,470号、第8,415,161号和第5,528,045号中，这些中的每一项的内容通过引用以其整体并入本文。此外，用于确定光谱重叠、产生溢出矩阵、产生补偿矩阵和进行补偿的方法先前已经公开在例如2018年8月16日公布的美国专利申请公布2018/0231452和BD Biosciences Technology Bulletin:AnIntroduction to Compensation for Multicolor Assays on Digital Flow Cytometers(2009年8月发表)中，这些中的每一项的内容通过引用以其整体并入本文。
在荧光发射检测器处捕获的信号可以包括来自一个或更多个荧光标记、***背景信号和自体荧光噪声信号的贡献。通常被称为“基线”的***背景可以通过基线恢复过程从测量信号中去除，其中基线信号可以从没有事件发生的细胞术实验中的时间间隔来估计，并且然后从测量信号中减去。为了补偿自体荧光，在常规补偿技术中，可以测量细胞术实验中将要使用的每一种荧光染料的“阴性”或未染色的样品，以及“阳性”样品，所述样品包含用单一染料染色的细胞。可以从每种染料的未染色样品中定义单一全局阴性群体。单一全局阴性群体的中位荧光强度(MFI)可以视为样品的自体荧光噪声信号，并可以从阳性样品的数据中被减去以计算自体荧光溢出值。在一些实施方案中，当感兴趣的标志物在样品中的多于一种细胞类型上表达时，由于每种细胞类型的自体荧光噪声信号的强度可以变化，因此常规方法可能无法准确地去除自体荧光噪声信号。因此，在一些实施方案中，即使在给定细胞类型上不存在一个或更多个标志物的情况下，自体荧光也可能被错误地表征为此类标志物的荧光发射，这可能使得难以区分不表达特定标志物的群体和具有该标志物弱表达的群体。
在本文描述的一些实施方案中，自体荧光噪声信号估计(autofluorescencenoise signal estimation)可适用于细胞散射特性。补偿方法先前已经公开，例如在美国专利第10,145,793中，该专利的内容在此明确地通过引用以其整体并入。具有相似尺寸和复杂性的细胞更有可能具有相似的自体荧光。由于颗粒的尺寸和复杂性可以分别与由前向散射检测器和侧向散射检测器测量的强度相关，因此针对小面积的前向散射-侧向散射图估计自体荧光噪声信号可以导致比基于单个中位荧光强度估计自体荧光噪声信号更准确的值。前向散射和侧向散射的强度测量可以与关联的荧光强度值一起使用，以提供多于一个估计的自体荧光噪声信号，每一个信号与前向散射-侧向散射图的面积相关。然后，可以至少部分地基于与自体荧光噪声信号相关的前向散射-侧向散射图的面积，从由荧光发射检测器捕获的对应染色样品的信号中减去估计的自体荧光噪声信号值，使得测量的数据将更直接地与感兴趣的标志物和标记相关。
在一些实施方案中，提供了用于对多参数流式细胞术进行补偿的***、方法、组合物和试剂盒。本文的公开内容包括利用双特异性探针(例如，双特异性试剂)的方法，所述双特异性探针能够使任何单细胞样品用作其自身优化的单色补偿对照样品。
在一些实施方案中，提供了具有双重识别的结合部分，其可用作用于制备细胞荧光对照样品的桥接剂。在多参数流式细胞术中，本文公开的结合部分(例如，双特异性探针、双特异性试剂)可以显著改进光谱解混和/或补偿，并从而改进分辨率。
在标准的多参数流式细胞术中，存在对解决多于一个荧光团发射溢出到专用于其他荧光团的检测器中(光谱重叠)的需求。这通常使用被称为补偿的计算方法来解决。
新技术不是将一个检测器专用于一种荧光团，而是使用比染料更多的检测器和使来自每种荧光团的信号在光谱上解混(光谱流式细胞术)来更多地利用每种荧光团的光谱特征。这利用了每种染料更多的荧光发射，并且可以改进不同细胞群体的信号和分辨率。
为了解决标准流式细胞术或光谱流式细胞术中的光谱重叠，可需要单一染色的对照来建立补偿矩阵。为了计算精确的补偿矩阵，可以有利的是使单一染色的对照至少与多参数组中的染色一样明亮。这些单一染色的对照通常由在多参数组中仅用一种荧光团染色的细胞或颗粒(补偿珠)组成。但是，这些方法中的任一种都有几个缺点：(i)补偿珠固有地具有与细胞不同的自体荧光；(ii)聚合物颗粒可能影响一些染料的荧光特性；(iii)不同类型的细胞固有地具有彼此不同的自体荧光；(iv)一些细胞靶在感兴趣的细胞上很少表达，使得很难分辨阳性群体和阴性群体来建立补偿矩阵；和/或(v)批次间的荧光团缀合抗体(尤其是串联荧光团)的光谱特性经常存在差异，因此理想情况下，对于单一染色对照，应使用与多参数组中使用的同一试剂样品。
因为由于对于每种荧光团都收集了更多的光谱，单个染色的对照和多参数组之间的光谱特征的任何差异都是复合的，这些潜在的缺点在光谱流式细胞术中可能会加剧。
本文提供的方法和组合物可以解决本领域中的上述问题。本文的公开内容包括包含两个彼此缀合以形成双特异性探针(例如，双特异性试剂)的抗体的试剂。一种抗体(例如，锚定抗体、锚定臂、锚定探针)可以具有对感兴趣细胞的表面上的高表达抗原(诸如例如，针对人类PBMC的抗CD44或抗CD45)的亲和力，并且另一种抗体(例如，捕获抗体、捕获臂、捕获探针)可以具有对多参数组(例如，抗小鼠κ轻链)中的每种抗体-染料缀合物(例如，检测试剂)的亲和力。对于组中每种荧光标记的抗体，该方法可以包括用该双特异性试剂染色感兴趣的细胞样品，然后用组中抗体-染料缀合物之一染色来用作单一染色对照。
本文提供的方法和组合物可以减少或消除单一染色对照细胞或珠与多参数样品中的感兴趣细胞之间的任何固有的自体荧光差异。此外，所公开的方法和组合物可以为计算补偿矩阵提供最大和一致的信号，并说明批次间的荧光团缀合抗体的任何潜在变化。如本文描述的，可以使用点击化学(例如，位点定向化学)方便地产生所公开的试剂，使得能够快速和相对便宜地建立小的、可重复的批次，从而可以利用锚定抗体和捕获抗体的不同组合，使其可用于多参数组中的各种感兴趣的细胞和不同的染色试剂。
本文提供的方法和组合物提供了与当前可用方法相比的多个优点和改进，诸如例如，(i)消除单一染色对照和感兴趣细胞之间的任何自体荧光差异；(ii)允许任何抗体-荧光团缀合物的充足信号，而不论在感兴趣细胞上的表达水平如何；(iii)维持生物模型的试剂荧光特性(相对于合成聚合物对照颗粒)；和/或(iv)允许对单一染色对照和多参数组二者使用同一抗体-荧光团试剂，以考虑荧光团光谱特性的潜在批次间变化。
在一些实施方案中，产生本文提供的双特异性试剂可以包括经由点击化学使锚定探针和捕获探针缀合。本文提供的方法能够使得快速和相对便宜地建立双特异性试剂来对不同的感兴趣细胞类型(诸如例如，小鼠对比人类，原代免疫细胞对比细胞系)染色。本文提供的方法和组合物可以用作使用补偿颗粒的替代。
图3描绘了用于多参数流式细胞术的非限制性示例性补偿工作流程。单细胞样品可以用独特双特异性(锚定/捕获)探针标记。双特异性探针(例如，双特异性试剂)可以包含锚定臂(例如，锚定探针)和捕获臂(例如，捕获探针)。这可以是快速(例如，5分钟)抗体标记步骤。示例性锚定靶(例如，被双特异性探针的捕获臂结合的细胞表面靶)包括普遍存在的免疫***蛋白，诸如例如CD44和/或CD45。然后可以用荧光缀合抗体单独标记特定的细胞样品。双特异性探针的捕获臂(例如，捕获探针)可以是对所有特定宿主物种的抗体(例如，抗鼠κ轻链)具有高亲和力的通用抗体。细胞样品现在可以用作明亮标记的单色荧光补偿颗粒。单色对照样品可以是几乎所有多参数流式细胞术实验中的黄金标准。
本文提供的方法可以用作标准多色流式细胞术工作流程中补偿对照样品管(诸如用将在多色组中使用的单个试剂染色的补偿对照珠，或用感兴趣的试剂或与同一荧光团缀合的替代抗体直接染色的细胞)的替换。样品可以与实验样品分开运行，通常是在实验样品之前。本文提供的产生准确荧光对照的方法不限于流式细胞术，还可在用于分析细胞或组织的任何多荧光平台(诸如例如，免疫荧光成像应用)中利用。
在一些实施方案中，本文提供的试剂包括彼此共价结合的抗体。在一些实施方案中，提供了包含两个抗原结合部分(例如，锚定探针和捕获探针)的双特异性试剂。两个抗原结合部分中的每一个可选自多种亲和部分。亲和部分可以通过本领域中已知的任何方式相互关联(例如，共价附接)。在一些实施方案中，该方法包括通过双特异性探针在细胞表面捕获荧光标记的抗体以用作荧光对照样品。本文的公开内容包括试剂，其中采用全尺寸抗体的共价连接产生高效双特异性。在一些实施方案中，提供了具有对不同表位(例如，细胞表面靶和检测试剂)特异性的两个不同的可变结构域的单个工程化(重组)抗体。在一些实施方案中，提供了两种彼此缀合的单克隆抗体。
在一些实施方案中，该方法包括将本文提供的补偿对照组合物添加到样品的级分。在一些实施方案中，锚定抗体(例如，锚定探针)靶向在感兴趣细胞上相对高表达的抗原。在本文描述的方法的一些实施方案中，对标准流式细胞术或光谱流式细胞术的充分补偿要求补偿对照与多重组中的实际靶向染色一样明亮或更明亮。靶抗体可以被本文提供的双特异性探针的捕获抗体(例如，捕获探针)识别(例如，抗小鼠κ将仅与来自小鼠宿主的抗体结合)。靶抗体可以是在多色实验(其需要单色荧光对照)中采用的使用者试剂。
在一些实施方案中，提供了优化的荧光对照样品，其使多色流式细胞术民主化(democratize)并改进细胞群体分辨率。
在标准的多参数流式细胞术中，从多于一种荧光团发射到专用于其他荧光团的检测器中的溢出(光谱重叠)通常使用单一染色对照经由补偿来解决。显著的溢出可以导致阴性群体的传播增加和低表达的感兴趣靶的分辨率降低。新技术不是将一个检测器专用于一种荧光团，而是通过使用比染料更多的检测器和使来自每种荧光团的信号在光谱上解混(光谱流式细胞术)来更多地利用每种荧光团的光谱特征。这利用了每种染料更多的荧光发射，并且可以改进不同细胞群体的信号和分辨率。
对于标准流式细胞术或光谱流式细胞术，为了计算准确的补偿矩阵，可能必需使单一染色对照至少与多参数组中的染色一样明亮。这些单一染色的对照通常由在多参数组中仅用一种荧光团染色的细胞或颗粒(补偿珠)组成。但是，这些方法中的任一种都有几个缺点，包括但不限于：(i)补偿珠固有地具有不同于细胞的自体荧光；(ii)聚合物颗粒可能影响一些染料的荧光特性；(iii)不同类型的细胞固有地具有彼此不同的自体荧光；(iv)一些细胞靶在感兴趣的细胞上很少表达，这使得很难分辨阳性群体和阴性群体以建立准确的补偿矩阵；和/或(v)批次间的荧光团缀合抗体的光谱特性经常存在差异。
在较少优化的组设计或较高参数的实验中，荧光溢出可能相当显著。由于当前补偿技术中的不准确性，科学家们经常手动调整由软件使用单一染色珠或细胞自动产生的补偿矩阵。这需要针对特定组和样品并不总是已知的流式细胞术的专业知识和生物学理解。随着科学家对疾病状态的进一步阐明和对表型生物标志物的更深入探索，执行高参数流式细胞术的复杂性成为下一代精确诊断和治疗的最大障碍。
本文的公开内容包括用于从细胞产生优化的单色染色对照的组合物和方法。将本文提供的补偿方法和组合物直接与基于标准珠的补偿对照以及单色染色样品进行比较。单独利用标准的自动补偿算法，极大地改进了关键群体的分辨率，简化了流式细胞术工作流程，并使先进的多参数单细胞分析得到更广泛的适用。
在一些实施方案中，提供了用于确定溢出的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括：提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与包含第一标记的第一检测试剂特异性结合的捕获探针，其中第一标记的发射光谱包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器，其中第一检测器能够检测第一检测波长范围内的发射并且第二检测器能够检测第二检测波长范围内的发射，其中第一峰值发射波长在第一检测波长范围内而不在第二检测波长范围内，其中第一发射波长范围的一部分与第二检测波长范围重叠；以及对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值，其中溢出包括第二参考值。在一些实施方案中，捕获探针能够与第二检测试剂特异性结合，该方法包括：提供与双特异性试剂和包含第二标记的第二检测试剂关联的细胞；以及对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值。
在一些实施方案中，提供了用于在包括第一检测器和第二检测器的仪器上进行多标记实验的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合，并且其中第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值；以及对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。
在一些实施方案中，提供了用于进行补偿的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合并且第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值；对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。
在一些实施方案中，提供了对用于使用多于一个检测器分析多于一种标记的仪器产生补偿矩阵的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括：提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与第一检测试剂和第二检测试剂特异性结合的捕获探针；对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量第二检测器中的发射以获得第二参考值；对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量第二检测器中的发射以获得第四参考值；以及基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
在一些实施方案中，提供了用于产生补偿矩阵的方法和组合物。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个以及第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵可以包括：对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个以及第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞可以包括：使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与双特异性试剂接触以形成与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包括能够与细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中双特异性试剂包含能够与第一检测试剂和/或第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及将第一检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触以形成与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞。提供与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞可以包括：使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与双特异性试剂接触以形成与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包括能够与细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中双特异性试剂包含能够与第一检测试剂和/或第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及将第二检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触以形成与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞。
该方法可以包括：对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。该方法可以包括：使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中第一检测试剂能够与第一细胞靶特异性结合，并且其中第二检测试剂能够与第二细胞靶特异性结合；以及对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量第二检测器中的发射以获得第二实验值。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于溢出矩阵和/或补偿矩阵调整第一实验值和/或第二实验值。
在一些实施方案中，提供了用于产生溢出矩阵的方法和组合物。在一些实施方案中，基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个产生溢出矩阵。该方法可以包括：基于溢出矩阵产生补偿矩阵。补偿矩阵可以是溢出矩阵的倒数。补偿矩阵可以存储在仪器中以供后续使用。溢出可以包括由第二检测器检测到的第一标记的发射和/或由第一检测器检测到的第二标记的发射。
多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞可以源自同一细胞样品。多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞可以包括多于一个单细胞。多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞可以包括异质细胞群体。多于一个对照细胞、多于一个未标记细胞和/或多于一个样品细胞可以包括两种或更多种细胞类型。细胞样品中的细胞类型的数目可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种或在这些值中的任何之间的数字或范围的细胞类型。一个或更多个事件可以包括约10个事件至约100,000个事件。在一些实施方案中，事件的数目可以是以下或可以是约以下：10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，事件的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个或109个。多于一个未标记细胞可以不与第一检测试剂或第二检测试剂关联。多于一个未标记细胞可以不与标记关联。多于一个未标记细胞可以不与荧光团关联。
与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射和与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射可以一样高。与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射可以比与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第一检测器中的发射高以下或可以高约以下：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射和与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射可以一样高。与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射可以比与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在第二检测器中的发射高以下或可以高约以下：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。
本文提供的方法和组合物可用于各种仪器。仪器可以包括流式细胞仪。流式细胞仪可以包括常规流式细胞仪。流式细胞仪可以包括光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合。仪器可以包括多荧光成像***。仪器可以包括荧光显微镜。仪器可以包括蛋白阵列。测量可以包括进行免疫组织化学测定。测量可以包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。第一检测器和/或第二检测器可以与一个或更多个滤光器配对。一个或更多个滤光器可以包括长通滤光器、短通滤光器、带通滤光器或其任何组合。仪器可以包括一个或更多个激发激光器。第一检测器和/或第二检测器可以包括光检测器。第一检测器和/或第二检测器可以包括荧光发射检测器。第一标记和/或第二标记可以包含荧光团。
发射可以包括荧光发射。第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个可以包括荧光强度值。第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个可以包括平均荧光强度值。第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个，第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，和/或第一实验值和第二实验值中的一个或更多个可以包括中位荧光强度值。第一背景发射值和/或第二背景发射值可以包括自体荧光。第一检测试剂可以包含第三标记。第一标记和第三标记在紧密靠近时，可以能够进行荧光共振能量转移(FRET)。第一标记和第三标记可以包含串联染料(例如，PE-CYTM7、APC-CYTM7)。
第一标记的发射光谱可以包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长。第二标记的发射光谱可以包括第二发射波长范围和第二峰值发射波长。第一检测器可以能够检测第一检测波长范围内的发射。第二检测器可以能够检测第二检测波长范围内的发射。第二发射波长范围可以不同于第一检测波长范围。第二峰值发射波长可以不同于第一峰值发射波长。第一发射波长范围可以不同于第二检测波长范围。第一峰值发射波长范围可以不同于第二峰值发射波长范围。在一些实施方案中，第一发射波长范围的一部分与第二检测波长范围重叠。在一些实施方案中，第二发射波长范围的一部分与第一检测波长范围重叠。第一峰值发射波长可以在第一检测波长范围内，并且第一峰值发射波长可以不在第二检测波长范围内。第二峰值发射波长可以在第二检测波长范围内，并且第二峰值发射波长可以不在第一检测波长范围内。第一检测器可以是第一标记的主检测器，并且第二检测器可以是第一标记的次检测器。第二检测器可以是第二标记的主检测器，并且第一检测器可以是第二标记的次检测器。在一些实施方案中，第二发射波长范围与第一检测波长范围重叠的百分比和/或第一发射波长范围与第二检测波长范围重叠的百分比可以是以下或可以是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.99％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，第二发射波长范围与第一检测波长范围重叠的百分比和/或第一发射波长范围与第二检测波长范围重叠的百分比可以是至少以下或可以是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.99％。
仪器可以包括前向散射检测器和侧向散射检测器。该方法可以包括：对于未标记细胞的一个或更多个事件，对于与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，和/或对于与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。该方法可以包括：基于前向散射值和侧向散射值确定未标记细胞的一个或更多个事件、与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件和/或与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。该方法可以包括：将未标记细胞的一个或更多个事件、与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件和/或与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。在一些实施方案中，前向散射-侧向散射图区域可以包括多于一个相邻的前向散射-侧向散射图位置。在一些实施方案中，前向散射-侧向散射图区域可以包括约10个事件至约100,000个事件的前向散射-侧向散射图位置。在一些实施方案中，前向散射-侧向散射图区域包括约以下的前向散射-侧向散射图位置：10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的事件。同一细胞类型的细胞的事件可以与同一前向散射-侧向散射图区域关联。不同类型细胞的细胞的事件可以与不同前向散射-侧向散射图区域关联。两种或更多种细胞类型可以与不同的前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：将与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第一参考值和/或第二参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：将与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第三参考值和/或第四参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：将未标记细胞的一个或更多个事件的第一背景发射值和/或第二背景发射值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个，产生用于一个或更多个前向散射-侧向散射图区域的溢出矩阵和/或补偿矩阵。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。该方法可以包括：基于前向散射值和侧向散射值确定与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。该方法可以包括：将与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的第一参考值、第二参考值、第三参考值和第四参考值中的一个或更多个和/或第一背景发射值和第二背景发射值中的一个或更多个调整第一实验值和/或第二实验值。该方法可以包括：对于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的溢出矩阵和/或补偿矩阵调整第一实验值和/或第二实验值。
在一些实施方案中，与不使用双特异性试剂的可比方法相比，使用双特异性试剂将分辨灵敏度增加至少约5％，其中分辨灵敏度包括仪器在模糊标记细胞和未标记细胞之间进行区分的能力。模糊标记细胞可以包括与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，第一实验值比第一背景发射值大以下：少于约50％(例如，0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围)。模糊标记细胞可以包括与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，第二实验值比第二背景发射值大以下：少于约50％(例如，0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中，可比方法采用补偿珠(例如，BD CompBead、OneComp珠、UltraComp珠、VersaComp珠或其任何组合)。在一些实施方案中，可比方法采用补偿珠来产生溢出矩阵和/或补偿矩阵。
在一些实施方案中，该方法包括基于与第一检测试剂和第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的第一实验值和/或第二实验值确定样品细胞的一个或更多个特征。一个或更多个特征可以包括多于一个样品细胞中的一个或更多个中第一细胞靶和/或第二细胞靶的拷贝数。第一细胞靶和/或第二细胞靶可以包括碳水化合物、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。第一细胞靶和/或第二细胞靶可以在细胞表面上。
双特异性试剂可以包括多于一种双特异性试剂。多于一种双特异性试剂可以包括相同的双特异性试剂。多于一种双特异性试剂可以包括两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物。双特异性试剂可以包括包含两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物的双特异性试剂组合物。两种或更多种不同的双特异性试剂可以能够与不同的检测试剂特异性结合。两种或更多种不同的双特异性试剂可以能够与不同的细胞表面靶特异性结合。该方法可以包括：在使多于一种双特异性试剂与多于一个对照细胞接触之后，去除多于一种双特异性试剂中未与多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂。去除未与多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂可以包括：去除未与细胞表面靶接触的一种或更多种双特异性试剂。
第一检测试剂可以包括多于一种第一检测试剂。第二检测试剂可以包括多于一种第二检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂与多于一个样品细胞接触之后，去除多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂中未与多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂。去除多于一种第一检测试剂和多于一种第二检测试剂中未与多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂可以包括：分别去除未与第一细胞靶和第二细胞靶接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第一检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除多于一种第一检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂。去除多于一种第一检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂可以包括：去除未与双特异性试剂接触的一种或更多种第一检测试剂。该方法可以包括：在使多于一种第二检测试剂和与双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除多于一种第二检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂。去除多于一种第二检测试剂中未和与双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂可以包括：去除未与双特异性试剂接触的一种或更多种第二检测试剂。
双特异性试剂
在一些实施方案中，提供了包含一个、两个或更多个抗原结合部分的双特异性试剂。捕获探针可以包含被配置为结合如本文描述的检测试剂(例如，第一检测试剂、第二检测试剂)的抗原结合部分。锚定探针可以包含被配置为结合如本文描述的细胞表面靶的抗原结合部分。检测试剂可以包含被配置为结合如本文描述的细胞靶(例如，第一细胞靶、第二细胞靶)的抗原结合部分。抗原结合部分可以包括抗体、抗体片段和变体。在一些实施方案中，抗体片段和变体可以包括来自完整抗体的抗原结合区。抗体片段和变体的实例可以包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子诸如单链可变片段(scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
为了本文的目的，术语“抗体”应被给予其普通含义，并且还可以包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及Fc区。如本文使用的，术语“天然抗体”可指约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链可以通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链中的二硫键(disulfidelinkages)的数目不同。每条重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VT)，然后是一些恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并在其另一端具有恒定结构域：轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
如本文使用的，术语“可变结构域”可指在抗体重链和轻链上发现的特异性抗体结构域，这些结构域的序列在抗体之间广泛不同并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变结构域可以包含高变区。如本文使用的，术语“高变区”可指可变结构域内包含负责抗原结合的氨基酸残基的区域。存在于高变区中的氨基酸决定成为抗体的抗原结合位点的一部分的互补决定区(CDR)的结构。如本文使用的，术语“CDR”可指包含与其靶抗原或表位互补的结构的抗体的区域。可变结构域的其他部分(不与抗原相互作用)被称为框架(FVV)区。抗原结合位点(也称为抗原结合部位或互补位)包含与特定抗原相互作用所必需的氨基酸残基。组成抗原结合位点的确切残基通常通过与结合的抗原的共晶体学来阐明，然而也可以使用基于与其他抗体比较的计算评估。确定组成CDR的残基可以包括使用编号方案，包括但不限于由Kabai、Chothia和Honegger教导的那些。
VH和VL结构域各有三个CDR。按照沿着可变结构域多肽从N-末端向C-末端移动时的出现顺序，VL CDR在本文中被称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。按照沿着可变结构域多肽从N-末端向C-末端移动时的出现顺序，VH CDR在本文中被称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。除了CDR-H3之外，每一个CDR都具有有利的典型结构，CDR-H3包含的氨基酸序列的序列和长度在抗体之间可能高度可变，导致在抗原结合结构域中产生多种三维结构。在一些情况下，可以在一组相关抗体中分析CDR-H3，以评估抗体多样性。确定CDR序列的各种方法是本领域已知的，并且可以应用于已知的抗体序列。
如本文使用的，术语“Fv”可指包含形成完整抗原结合位点所需的抗体上的最小片段的抗体片段。这些区域由处于紧密的非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。Fv片段可以通过蛋白水解性裂解产生，但很大程度上是不稳定的。本领域已知用于产生稳定Fv片段的重组方法，通常通过在轻链可变结构域和重链可变结构域之间***柔性接头(以形成单链Fv(scFv))或通过在重链可变结构域和轻链可变结构域之间引入二硫桥。
如本文使用的，术语“轻链”可指基于恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一的来自任何脊椎动物物种的抗体组分。取决于抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以指定为不同的类别。完整的抗体有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的若干种可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
如本文使用的，术语“单链Fv”或“scFv”可指VH和VL抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域通过柔性肽接头连接在一起成为单个多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。在一些实施方案中，scFv与噬菌体展示、酵母展示或其他展示方法一起使用，其中它们可以与表面成员(例如，噬菌体外壳蛋白)关联表达，并用于鉴定针对给定抗原的高亲和力肽。利用分子遗传学，由接头结构域分开的两个scFv可以串联工程化为单个多肽，称为“串联scFv”(tascFv)。用两个不同scFv的基因构建tascFv产生“双特异性单链可变片段”(bis-scFv)。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”可指能够结合两种不同抗原的抗体。这样的抗体通常包含来自至少两种不同抗体的区域。如本文使用的，术语“双特异抗体”可指具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双特异抗体是功能性双特异性单链抗体(bscAb)。双特异抗体在同一多肽链中包含连接到轻链可变结构域VL的重链可变结构域VH。通过使用太短以至于同一链上的两个结构域之间不能配对的接头，这些结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”可指从基本上同质的细胞(或克隆)群体中获得的抗体，即除了在单克隆抗体产生过程中可能出现的可能的变体(这样的变体通常以少量存在)之外，构成该群体的单个抗体是相同的和/或结合同一表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
修饰词“单克隆”可以指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得的，而不被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与抗体中源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，而链的其余部分与抗体中源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段。
如本文使用的，术语“抗体变体”可指修饰的抗体(相对于天然抗体或起始抗体)或在结构和/或功能上类似天然抗体或起始抗体的生物分子(例如，抗体模拟物)。与天然抗体相比，抗体变体可以在其氨基酸序列、组成或结构上发生改变。抗体变体可以包括但不限于具有改变的同种型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM)的抗体、人源化变体、优化的变体、多特异性抗体变体(例如，双特异性变体)和抗体片段。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合部分包括抗体模拟物(例如，单特异抗体(monobodies))。如本文使用的，术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或效果并特异性结合它们的分子靶且对它们的分子靶具有高亲和力的任何分子。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是被设计为掺入纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)作为蛋白支架(例如，美国专利第6,673,901号和第6,348,584号中公开的蛋白支架)的单特异抗体。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域已知的那些，包括但不限于亲和体分子、affitin、anticalin、avimer、Centyrin、DARPINSTM、Fynomer和Kunitz和结构域肽。在其他实施方案中，抗体模拟物可以包含一个或更多个非肽区。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合部分包括结合多于一个表位的多特异性抗体。如本文使用的，术语“多特异抗体(multibody)”或“多特异性抗体(multispecificantibody)”可指其中两个或更多个可变区结合到不同表位的抗体。表位可以在相同或不同的靶上。在一些实施方案中，多特异性抗体是识别相同或不同抗原上的两个不同表位的“双特异性抗体”。在一方面，双特异性抗体能够结合两种不同的抗原。这样的抗体通常包含来自至少两种不同抗体的抗原结合区。例如，双特异性单克隆抗体(BsMAb,BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段组成，从而允许BsAb与两种不同类型的抗原结合的人工蛋白。已经开发出新一代BsMAb，称为“三功能性双特异性”抗体。它们由两条重链和两条轻链组成，每一个来自两种不同的抗体，其中两个Fab区(臂)针对两种抗原，并且Fc区(足)包含两个重链并形成第三结合位点。
在一些实施方案中，提供了双特异性试剂。第一检测试剂、第二检测试剂、双特异性试剂、捕获探针和锚定探针中的一种或更多种可以包括抗体或其片段。捕获探针可以能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合。第一检测试剂和/或第二检测试剂可以包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域。重链恒定结构域可以包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域。轻链恒定结构域可以是λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。抗体或其片段可以源自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猴、牛、猪、马、山羊、绵羊或其任何组合。抗体或其片段可以包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
双特异性试剂可以包括抗体或其片段和抗体或其片段的缀合物。抗体或其片段可以包括单克隆抗体。抗体或其片段可以经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与抗体或其片段缀合。缀合物可以通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。缀合物可以通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。缀合物可以通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。
细胞表面靶可以包括碳水化合物、脂质、蛋白或其任何组合。细胞表面靶可以包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、HLA蛋白、β2-微球蛋白或其任何组合。细胞表面靶的丰度可以是第一细胞靶和/或第二细胞靶的至少约2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或在这些值中的任何之间的数字或范围)。
组合物和试剂盒
在一些实施方案中，提供了试剂盒和组合物。在一些实施方案中，组合物(例如，试剂盒)包括：与双特异性试剂关联的细胞，其中双特异性试剂包含与细胞上的细胞表面靶特异性结合的锚定探针和能够与检测试剂特异性结合的捕获探针。检测试剂可以能够与细胞靶特异性结合。细胞表面靶的丰度可以是细胞靶的至少约2倍(例如，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或在这些值中的任何之间的数字或范围)。双特异性试剂、检测试剂、捕获探针和/或锚定探针中的一种或更多种可以包括抗体或其片段。捕获探针可以能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合。检测试剂可以包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域。检测试剂可以包含荧光团。重链恒定结构域可以包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域。轻链恒定结构域可以包括λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。双特异性试剂可以包括抗体或其片段和抗体或其片段的缀合物。抗体或其片段可以经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与抗体或其片段缀合。缀合物可以通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。缀合物可以通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。缀合物可以通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。抗体或其片段可以包括单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都意图落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及意图涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常意图作为“开放性的”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述中的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种此类陈述的实施方案，甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的***”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的***)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的***”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的***)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到，本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围组合。任何列举的范围可以被容易地认为充分地描述了并且使得同一范围能够被分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言诸如“多达(up to)”、“至少”、“大于”、“少于”等包括所述及的数字并且指随后可以被分成如以上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不意图限制，实际范围和精神由以下权利要求指出。

Claims (99)

1.一种用于确定溢出的方法，所述方法包括：
提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与包含第一标记的所述第一检测试剂特异性结合的捕获探针，其中所述第一标记的发射光谱包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长；
提供包括第一检测器和第二检测器的仪器，其中所述第一检测器能够检测第一检测波长范围内的发射，并且所述第二检测器能够检测第二检测波长范围内的发射，其中所述第一峰值发射波长在所述第一检测波长范围内而不在所述第二检测波长范围内，其中所述第一发射波长范围的一部分与所述第二检测波长范围重叠；以及
对于与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二参考值，其中溢出包括所述第二参考值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针能够与第二检测试剂特异性结合，所述方法包括：
提供与所述双特异性试剂和包含第二标记的第二检测试剂关联的细胞；以及
对于与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第四参考值。
3.一种用于在包括第一检测器和第二检测器的仪器上进行多标记实验的方法，所述方法包括：
使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞，其中所述第一检测试剂能够与所述第一细胞靶特异性结合，并且其中所述第二检测试剂能够与所述第二细胞靶特异性结合；
提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂特异性结合的捕获探针；
提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；
对于与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二参考值；
对于与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第四参考值；
对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二实验值；以及
对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。
4.一种用于进行补偿的方法，所述方法包括：
使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞，其中所述第一检测试剂能够与所述第一细胞靶特异性结合并且所述第二检测试剂能够与所述第二细胞靶特异性结合；
提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂特异性结合的捕获探针；
提供包括第一检测器和第二检测器的仪器；
对于与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二参考值；
对于与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第四参考值；
对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二实验值；
对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及
对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个和/或所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个调整所述第一实验值和/或所述第二实验值。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包括：基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述方法包括：基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个以及所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
7.一种对用于使用多于一个检测器分析多于一种标记的仪器产生补偿矩阵的方法，所述方法包括：
提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞以及与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够特异性结合细胞表面靶的锚定探针和能够与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂特异性结合的捕获探针；
对于与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二参考值；
对于与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第三参考值并测量所述第二检测器中的发射以获得第四参考值；以及
基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵包括：
对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二背景发射值；以及
基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个以及所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个产生补偿矩阵。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中提供与双特异性试剂和第一检测试剂关联的细胞包括：
使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与所述双特异性试剂接触以形成与所述双特异性试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够与所述细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中所述双特异性试剂包含能够与所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及
使所述第一检测试剂和与所述双特异性试剂关联的细胞接触以形成与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中提供与双特异性试剂和第二检测试剂关联的细胞包括：
使包含细胞表面靶的多于一个对照细胞与所述双特异性试剂接触以形成与所述双特异性试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含能够与所述细胞表面靶特异性结合的锚定探针，并且其中所述双特异性试剂包含能够与所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂特异性结合的捕获探针；以及
使所述第二检测试剂和与所述双特异性试剂关联的细胞接触以形成与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括：
对于多于一个未标记细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一背景发射值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二背景发射值。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法包括：
使包含第一标记的第一检测试剂和包含第二标记的第二检测试剂与包含第一细胞靶和第二细胞靶的多于一个样品细胞接触以形成与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞，其中所述第一检测试剂能够与所述第一细胞靶特异性结合，并且其中所述第二检测试剂能够与所述第二细胞靶特异性结合；以及
对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量所述第一检测器中的发射以获得第一实验值并测量所述第二检测器中的发射以获得第二实验值。
13.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，所述方法包括对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个和/或所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个调整所述第一实验值和/或所述第二实验值。
14.根据权利要求3-13中任一项所述的方法，所述方法包括对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于溢出矩阵和/或补偿矩阵调整所述第一实验值和/或所述第二实验值。
15.根据权利要求5-14中任一项所述的方法，其中基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个产生补偿矩阵包括：基于所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个产生溢出矩阵。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法包括基于以下产生溢出矩阵：(i)所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和第四参考值中的一个或更多个；和/或(ii)所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个和/或所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个。
17.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，所述方法包括基于溢出矩阵产生补偿矩阵。
18.根据权利要求5-17中任一项所述的方法，其中所述补偿矩阵：(i)是所述溢出矩阵的倒数；和/或(ii)存储在仪器中以供后续使用。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中溢出包含由所述第二检测器检测到的所述第一标记的发射和/或由所述第一检测器检测到的所述第二标记的发射。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述多于一个对照细胞、所述多于一个未标记细胞和/或所述多于一个样品细胞(i)源自同一细胞样品；(ii)包括多于一个单细胞；(iii)包括异质细胞群体；和/或(iv)包括两种或更多种细胞类型。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中一个或更多个事件包括约10个事件至约100,000个事件。
22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，其中所述多于一个未标记细胞不与以下关联：(i)第一检测试剂或第二检测试剂关联；(ii)标记；和/或(iii)荧光团。
23.根据权利要求3-22中任一项所述的方法，其中与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第一检测器中的发射(i)和与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第一检测器中的发射一样高；和/或(ii)比与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第一检测器中的发射高至少约5％。
24.根据权利要求3-23中任一项所述的方法，其中与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第二检测器中的发射(i)和与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第二检测器中的发射一样高；和/或(ii)比与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件在所述第二检测器中的发射高至少约5％。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述仪器包括流式细胞仪、荧光显微镜、蛋白阵列、一个或更多个激发激光器、多荧光成像***。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述流式细胞仪包括常规流式细胞仪、光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述测量包括进行免疫组织化学测定和/或进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中第一检测器和/或第二检测器与一个或更多个滤光器配对，任选地所述一个或更多个滤光器包括长通滤光器、短通滤光器、带通滤光器或其任何组合。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述第一检测器和/或所述第二检测器包括光检测器和/或荧光发射检测器。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中：(i)所述第一标记和/或所述第二标记包含荧光团；和/或(ii)所述发射包括荧光发射。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个，所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个，和/或所述第一实验值和所述第二实验值中的一个或更多个包括荧光强度值。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个，所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个，和/或所述第一实验值和所述第二实验值中的一个或更多个包括平均荧光强度值。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个，所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个，和/或所述第一实验值和所述第二实验值中的一个或更多个包括中位荧光强度值。
34.根据权利要求3-33中任一项所述的方法，其中所述第一背景发射值和/或所述第二背景发射值包括自体荧光。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂包含第三标记，其中所述第一标记和所述第三标记在紧密靠近时能够进行荧光共振能量转移(FRET)，任选地所述第一标记和所述第三标记包括串联染料。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述第一标记的发射光谱包括第一发射波长范围和第一峰值发射波长。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述第二标记的发射光谱包括第二发射波长范围和第二峰值发射波长。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述第一检测器能够检测第一检测波长范围内的发射。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述第二检测器能够检测第二检测波长范围内的发射。
40.根据权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述第二发射波长范围不同于所述第一检测波长范围。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述第二峰值发射波长不同于所述第一峰值发射波长。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述第一发射波长范围不同于所述第二检测波长范围。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述第一峰值发射波长范围不同于所述第二峰值发射波长范围。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述第一发射波长范围的一部分与所述第二检测波长范围重叠。
45.根据权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述第二发射波长范围的一部分与所述第一检测波长范围重叠。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述第一峰值发射波长在所述第一检测波长范围内，并且其中所述第一峰值发射波长不在所述第二检测波长范围内。
47.根据权利要求38-46中任一项所述的方法，其中所述第二峰值发射波长在所述第二检测波长范围内，并且其中所述第二峰值发射波长不在所述第一检测波长范围内。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中：(i)所述第一检测器是所述第一标记的主检测器，并且其中所述第二检测器是所述第一标记的次检测器；和/或(ii)所述第二检测器是所述第二标记的主检测器，并且其中所述第一检测器是所述第二标记的次检测器。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述仪器包括前向散射检测器和侧向散射检测器。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，所述方法包括对于所述未标记细胞的一个或更多个事件，对于与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，和/或对于与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。
51.根据权利要求50所述的方法，所述方法包括基于所述前向散射值和所述侧向散射值确定所述未标记细胞的一个或更多个事件、与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，和/或与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法包括将所述未标记细胞的一个或更多个事件、与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件、和/或与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。
53.根据权利要求52所述的方法，其中前向散射-侧散点图区域包括多于一个相邻的前向散射-侧向散射图位置。
54.根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中前向散射-侧向散射图区域包括约10个事件至约100,000个事件的前向散射-侧向散射图位置。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中同一细胞类型的细胞的事件与同一前向散射-侧向散射图区域关联。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中不同细胞类型的细胞的事件与不同前向散射-侧向散射图区域关联。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种细胞类型与不同前向散射-侧向散射图区域关联。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的方法，所述方法包括将与所述双特异性试剂和所述第一检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的所述第一参考值和/或所述第二参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。
59.根据权利要求52-58中任一项所述的方法，所述方法包括将与所述双特异性试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的所述第三参考值和/或所述第四参考值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的方法，所述方法包括将所述未标记细胞的一个或更多个事件的所述第一背景发射值和/或所述第二背景发射值与一个或更多个前向散射-侧向散射图区域关联。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，所述方法包括基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个和/或所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个，产生用于一个或更多个前向散射-侧向散射图区域的溢出矩阵和/或补偿矩阵。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，所述方法包括对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，测量前向散射值和侧向散射值。
63.根据权利要求62所述的方法，所述方法包括基于所述前向散射值和所述侧向散射值确定与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置。
64.根据权利要求63所述的方法，所述方法包括将与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的前向散射-侧向散射图位置与前向散射-侧向散射图区域关联。
65.根据权利要求64所述的方法，所述方法包括对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的所述第一参考值、所述第二参考值、所述第三参考值和所述第四参考值中的一个或更多个和/或所述第一背景发射值和所述第二背景发射值中的一个或更多个调整所述第一实验值和/或所述第二实验值。
66.根据权利要求64-65中任一项所述的方法，所述方法包括对于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件，基于与相应的前向散射-侧向散射图区域关联的所述溢出矩阵和/或所述补偿矩阵调整所述第一实验值和/或所述第二实验值。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中与不采用所述双特异性试剂的可比方法相比，使用所述双特异性试剂使分辨灵敏度增加至少约5％，其中分辨灵敏度包括所述仪器在模糊标记细胞和未标记细胞之间进行区分的能力。
68.根据权利要求67所述的方法，其中模糊标记细胞包括与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，所述第一实验值比所述第一背景发射值大以下：少于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。
69.根据权利要求67-68中任一项所述的方法，其中模糊标记细胞包括与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞，对于所述细胞，所述第二实验值比所述第二背景发射值大以下：少于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述可比方法采用补偿珠，任选地所述补偿珠包括BD CompBead、OneComp珠、UltraComp珠、VersaComp珠或其任何组合。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的方法，其中所述可比方法采用补偿珠来产生溢出矩阵和/或补偿矩阵，任选地所述补偿珠包括BD CompBead、OneComp珠、UltraComp珠、VersaComp珠或其任何组合。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂、所述第二检测试剂、所述双特异性试剂、所述捕获探针和所述锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述捕获探针能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合，任选地所述重链恒定结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域，还任选地所述轻链恒定结构域是λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域，任选地所述重链恒定结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域，还任选地所述轻链恒定结构域是λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段源自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、猴、牛、猪、马、山羊、绵羊或其任何组合。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述双特异性试剂包括抗体或其片段与抗体或其片段的缀合物，任选地所述抗体或其片段经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与所述抗体或其片段缀合。
77.根据权利要求72-76中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包括单克隆抗体。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过以下形成：(i)1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合；(ii)乙炔和叠氮化物之间的反应；和/或(iii)醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应。
79.根据权利要求72-78中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第一检测试剂和所述第二检测试剂关联的细胞的一个或更多个事件的所述第一实验值和/或所述第二实验值确定所述样品细胞的一个或更多个特征，任选地所述一个或更多个特征包括所述多于一个样品细胞的一个或更多个中所述第一细胞靶和/或所述第二细胞靶的拷贝数。
81.根据权利要求3-80中任一项所述的方法，其中所述第一细胞靶和/或所述第二细胞靶包括碳水化合物、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合，任选地所述第一细胞靶和/或所述第二细胞靶在细胞表面上。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述细胞表面靶包括碳水化合物、脂质、蛋白或其任何组合。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述细胞表面靶的丰度是所述第一细胞靶和/或所述第二细胞靶的至少约2倍。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述双特异性试剂包括多于一种双特异性试剂，任选地所述多于一种双特异性试剂包括：(i)相同的双特异性试剂；和/或(ii)两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述双特异性试剂包括包含两种或更多种不同的双特异性试剂的混合物的双特异性试剂组合物。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种不同的双特异性试剂能够(i)与不同的检测试剂特异性结合；和/或(ii)与不同的细胞表面靶特异性结合。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种双特异性试剂与所述多于一个对照细胞接触之后，去除所述多于一种双特异性试剂中未与所述多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂，任选地去除未与所述多于一个对照细胞接触的一种或更多种双特异性试剂包括：去除未与所述细胞表面靶接触的一种或更多种双特异性试剂。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂包括多于一种第一检测试剂和/或其中所述第二检测试剂包括多于一种第二检测试剂。
89.根据权利要求88所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种第一检测试剂和所述多于一种第二检测试剂与所述多于一个样品细胞接触后，去除所述多于一种第一检测试剂和所述多于一种第二检测试剂中未与所述多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂，任选地去除所述多于一种第一检测试剂和所述多于一种第二检测试剂中未与所述多于一个样品细胞接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂包括：分别去除未与所述第一细胞靶和所述第二细胞靶接触的一种或更多种第一检测试剂和一种或更多种第二检测试剂。
90.根据权利要求88-89中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种第一检测试剂和与所述双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除所述多于一种第一检测试剂中未和与所述双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂，任选地去除所述多于一种第一检测试剂中未和与所述双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第一检测试剂包括：去除未与所述双特异性试剂接触的一种或更多种第一检测试剂。
91.根据权利要求88-90中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种第二检测试剂和与所述双特异性试剂关联的细胞接触之后，去除所述多于一种第二检测试剂中未和与所述双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂，任选地去除所述多于一种第二检测试剂中未和与所述双特异性试剂关联的细胞接触的一种或更多种第二检测试剂包括：去除未与所述双特异性试剂接触的一种或更多种第二检测试剂。
92.一种组合物，所述组合物包含：
与双特异性试剂关联的细胞，其中所述双特异性试剂包含与所述细胞上的细胞表面靶特异性结合的锚定探针和能够与检测试剂特异性结合的捕获探针。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述检测试剂能够与细胞靶特异性结合，并且其中所述细胞表面靶的丰度是所述细胞靶的至少约2倍。
94.根据权利要求92-93中任一项所述的组合物，其中所述双特异性试剂、所述检测试剂、所述捕获探针和/或所述锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。
95.根据权利要求92-94中任一项所述的组合物，其中：(i)所述捕获探针能够与轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域特异性结合；和/或(ii)所述检测试剂包含重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域，任选地其中所述检测试剂包含荧光团。
96.根据权利要求95-95中任一项所述的组合物，其中：(i)所述重链恒定结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE或其任何组合的恒定结构域；和/或(ii)所述轻链恒定结构域包括λ轻链恒定结构域和/或κ轻链恒定结构域。
97.根据权利要求92-96中任一项所述的组合物，其中所述双特异性试剂包括抗体或其片段与抗体或其片段的缀合物，任选地所述抗体或其片段经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与所述抗体或其片段缀合。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述缀合物通过以下形成：(i)1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合；(ii)乙炔和叠氮化物之间的反应；和/或(iii)醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其片段包括单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
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