CN115141801B - 基于线粒体代谢活性分析不同淋巴细胞亚群的方法、试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞模型的构建方法、非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞的方法以及所述模型、方法的用途，所述方法和模型可以用于对包括B淋巴细胞亚群、CD4+T淋巴细胞亚群、CD8+T淋巴细胞亚群和NK细胞的主要分化和活化阶段进行分析和鉴定；基于发明提供的不同分化和活化阶段的淋巴细胞亚群，为后续基于淋巴细胞亚群的免疫相关研究或细胞治疗提供了标准。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，尤其是涉及一种基于线粒体代谢活性分析不同淋巴细胞亚群的方法、试剂盒以及用途。
背景技术
免疫***包括固有免疫和适应性免疫，可以保护机体在病菌的环绕下不受伤害。免疫***由许多不同的细胞相互作用达成微妙平衡，而淋巴细胞及其细胞亚群就是构成免疫***的基础。淋巴细胞主要包括B细胞，T细胞和NK细胞，这些细胞都由造血干细胞分化增殖产生各自的前体细胞，再由各自的前体细胞不断分化成成熟细胞。如造血干细胞经过不对称***产生B、T细胞共同的淋巴祖细胞，其中B细胞经过从pro-B细胞，分化产生pre-B细胞，随后向下分化成immature B细胞和mature B细胞。T细胞需要经过阳性选择，阴性选择分化成CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两大类，随后分别向下分化成各种具有专业功能的T细胞。CD4+ T细胞亚群包括naive CD4+ T、memory CD4+ T和nTreg细胞等，CD8+ T细胞亚群包括central memory CD8+ T、effector memory CD8+ T和effector CD8+ T细胞等。
线粒体是细胞内的最重要的细胞器之一，它参与产生ATP、调控活性氧的产生、维持钙的平衡，以及参与信号传递、炎症和细胞死亡等。线粒体功能的改变，如氧化磷酸化损伤、自噬障碍、抑制凋亡、能量代谢异常、信号通路改变和促进免疫逃避等，可能影响疾病的发生。人类疾病如血液***疾病、自身免疫疾病、心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等的发生与发展都与线粒体活动密切相关。
淋巴细胞亚群在分化和活化中的线粒体功能存在差异，线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和线粒体自噬水平等可以作为主要指标来反映线粒体在参与细胞活动、应激及衰老等一系列生理病理过程中发挥的作用。但是目前的缺乏完整地对不同分化和活化阶段的淋巴细胞在同一实验条件、同一***标准内进行了线粒体代谢功能的比较，因此没有基于线粒体代谢功能对细胞群划分的统一标准。
特定免疫细胞采用的细胞代谢类型不仅是产生能量和生物分子前体的一种方式，而且还与该细胞的免疫输出相关，甚至可能决定该细胞的免疫输出。因此，深入研究免疫细胞的线粒体代谢途径，为通过免疫***治疗癌症以及其他免疫***相关疾病提供了一个新的治疗策略和方法。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种基于线粒体代谢活性分析不同淋巴细胞亚群的方法、试剂盒以及用途，以解决不同细胞亚群分化分群的难题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明第一个方面提供一种非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞模型的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1)小鼠骨髓细胞的分离获取；
步骤2)采用流式检测手段，基于细胞表型的分析将步骤1)分离获得的小鼠骨髓细胞划分为不同的淋巴细胞亚群，所述淋巴细胞亚群包括：B细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群和NK细胞亚群；
步骤3)将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行线粒体功能检测，所述线粒体功能检测包括：Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平，进一步的还包括SSC检测以及SSC的rSD水平分析；
步骤4)基于步骤3)的线粒体功能检测的结果获得区分不同淋巴细胞亚群的指标；
步骤5)将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行单细胞测序，检测其中自噬相关基因的表达水平，所述自噬相关基因选自Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2中的一种或者几种；基于自噬相关基因表达的水平验证步骤4)所述区分不同淋巴细胞亚群的指标。进一步的，所述方法步骤2)所述的细胞表型的分析为使用flowjoTM V10.6.1软件进行tSNE、UMAP和FlowSOM分析。
进一步的，所述方法步骤4)所述的区分不同淋巴细胞亚群的指标为：线粒体功能水平由高到低依次为B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；CD4+ T细胞的MM、MMP和ROS水平高于CD8+ T细胞；B细胞的MMP水平高于NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，B细胞和NK细胞的ROS水平分别高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；B细胞的线粒体自噬水平高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；NK细胞的线粒体自噬水平水平高于CD8+ T细胞。
进一步的，所述方法可选的在步骤3)还包括检测B淋巴细胞亚群分化中的线粒体功能的步骤，所述检测包括：Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrialmass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平。
进一步的，所述方法，可选的在步骤4)还包括区分B淋巴细胞不同分化亚群的指标，所述B淋巴细胞不同分化亚群的指标为：pro-B的MM和MMP水平高于pre-B，pro-B的MM水平高于immature B，immature B的MM水平高于mature B；pre-B在B细胞亚群中具有较高的mitophagy水平，高于pro-B和mature B；mature B具有低的mitophagy水平，低于pro-B、pre-B和immature B。
进一步的，所述方法，可选的在步骤3)还包括检测CD4+ T淋巴细胞亚群分化中的线粒体功能的步骤，所述检测包括Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrialmembrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平。
进一步的，所述方法，可选的在步骤4)还包括区分CD4+ T淋巴细胞亚群不同分化亚群的指标，所述CD4+ T淋巴细胞不同分化亚群的指标为：naive CD4+ T的MM、MMP、ROS和线粒体自噬水平高于记忆CD4+ T和nTreg，nTreg的MMP水平高于记忆CD4+ T，nTreg的线粒体自噬水平水平低于记忆CD4+ T。
进一步的，所述方法，其特征在于：所述方法可选的根据权利要求1-3任一的方法，其特征在于，可选的在步骤3)还包括检测CD8+ T淋巴细胞亚群分化中的线粒体功能的步骤，所述检测步骤包括：使用Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrialmass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平。
进一步的，所述方法，可选的在步骤4)还包括区分CD8+ T淋巴细胞不同分化亚群的指标，所述CD8+T淋巴细胞亚群不同分化亚群的指标为：central memory CD8+ T、effector memory CD8+ T和effector CD8+ T的MM水平依次降低；central memory CD8+ T的MMP水平高于effector memory CD8+ T，effector memory CD8+ T的ROS水平高于effector CD8+ T；effector CD8+ T的mitophagy水平高于central memory CD8+ T和effector memory CD8+ T。
本发明第二个方面提供所述的非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞模型的构建方法的应用，所述应用选自以下一种或者几种：
1)用于B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞群的划分；
2)用于pro-B,pre-B,immature B和mature B细胞群的划分；
3)用于naive CD4+ T,memory CD4+ T和nTreg细胞群的划分；
4)用于central memory CD8+ T,effector memory CD8+ T和effector CD8+ T细胞群的划分。本发明第三个方面提供一种非诊断目的基于线粒体代谢活性划分淋巴细胞亚群细胞的方法基于线粒体代谢活性划分淋巴细胞亚群细胞的方法,所述方法包括如下步骤：
步骤1)细胞分离步骤：受试细胞的分离获取；
步骤2)流式检测步骤:采用流式检测手段，基于细胞表型的分析将步骤1)分离获得的细胞划分为不同的淋巴细胞亚群，所述淋巴细胞亚群包括：B细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群和NK细胞亚群；进一步的所述B细胞亚群包括pro-B,pre-B,immature B和mature B细胞；进一步的，所述CD4+T细胞亚群包括naive CD4+ T,memory CD4+ T和nTreg细胞；进一步的，所述CD8+T细胞亚群包括central memory CD8+ T,effector memoryCD8+ T和effector CD8+ T细胞；
步骤3)线粒体功能检测检测步骤：将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行线粒体功能检测，所述线粒体功能检测包括：Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrialmembrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平，，进一步的还包括SSC检测以及SSC的rSD水平分析；
步骤4)细胞亚群划分步骤：使用区分不同淋巴细胞亚群的指标划分不同的淋巴细胞亚群；
进一步的，所述区分B细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群和NK细胞亚群的指标为：线粒体功能水平由高到低依次为B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；CD4+ T细胞的MM、MMP和ROS水平高于CD8+ T细胞；B细胞的MMP水平高于NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+T细胞，B细胞和NK细胞的ROS水平分别高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；B细胞的线粒体自噬水平高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；NK细胞的线粒体自噬水平水平高于CD8+ T细胞；
进一步的，区分naive CD4+ T,memory CD4+ T和nTreg细胞的指标为：naive CD4+T的MM、MMP、ROS和线粒体自噬水平高于记忆CD4+ T和nTreg，nTreg的MMP水平高于记忆CD4+T，nTreg的线粒体自噬水平水平低于记忆CD4+ T；
进一步的，区分central memory CD8+ T,effector memory CD8+ T和effectorCD8+ T细胞的指标为：central memory CD8+ T、effector memory CD8+ T和effector CD8+ T的MM水平依次降低；central memory CD8+ T的MMP水平高于effector memory CD8+ T，effector memory CD8+ T的ROS水平高于effector CD8+ T；effector CD8+ T的mitophagy水平高于central memory CD8+ T和effector memory CD8+ T。
步骤5)验证步骤：将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行单细胞测序，检测其中自噬相关基因的表达水平，所述自噬相关基因选自Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2中的一种或者几种；基于自噬相关基因表达的水平验证步骤4)所述不同淋巴细胞亚群划分的有效性和准确性。
本发明第三个方面为提供一种基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞的装置，所述装置包括：
1)细胞获取模块；
2)流式细胞检测和分析模块，所述流式细胞检测依靠B细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表型进行检测，所述分析模块为使用flowjoTM V10.6.1软件进行tSNE、UMAP和FlowSOM分析；
3)线粒体功能检测模块，所述线粒体功能检测包括：Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平，，进一步的还包括SSC检测和rSD水平分析模块；
4)细胞群划分模块：区分不同淋巴细胞亚群的指标划分不同的淋巴细胞亚群；进一步的，所述区分B细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群和NK细胞亚群的指标为：线粒体功能水平由高到低依次为B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；CD4+ T细胞的MM、MMP和ROS水平高于CD8+ T细胞；B细胞的MMP水平高于NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，B细胞和NK细胞的ROS水平分别高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；B细胞的线粒体自噬水平高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；NK细胞的线粒体自噬水平水平高于CD8+ T细胞；进一步的，区分naive CD4+ T,memory CD4+ T和nTreg细胞的指标为：naive CD4+ T的MM、MMP、ROS和线粒体自噬水平高于记忆CD4+ T和nTreg，nTreg的MMP水平高于记忆CD4+ T，nTreg的线粒体自噬水平水平低于记忆CD4+ T；进一步的，区分centralmemory CD8+ T,effector memoryCD8+ T和effector CD8+ T细胞的指标为：central memory CD8+T、effector memory CD8+T和effector CD8+ T的MM水平依次降低；central memory CD8+ T的MMP水平高于effectormemory CD8+ T，effector memory CD8+ T的ROS水平高于effector CD8+ T；effector CD8+ T的mitophagy水平高于central memory CD8+ T和effector memory CD8+ T。
5)验证模块：将2)流式细胞检测和分析模块划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行单细胞测序，检测其中自噬相关基因的表达水平，所述自噬相关基因选自Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2中的一种或者几种；基于自噬相关基因表达的水平验证细胞群划分模块划分的不同淋巴细胞亚群划分的有效性和准确性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明克服了现有技术单独基于细胞表面标记对淋巴细胞分群进行划分的方法，划分的笼统性，以及划分后同一细胞群内存在异质性的缺陷。通过对不同分化和活化阶段的淋巴细胞在同一实验条件、同一***标准内分别进行了MM、MMP、ROS和线粒体自噬水平的检测，绘制了不同分化和活化阶段的淋巴细胞的线粒体代谢特征，为***地表征免疫细胞的线粒体代谢功能提供了一套完整的方法和基础参考值。
结合单细胞测序技术，以及不同的患者数据库，对不同分化和活化阶段的淋巴细胞的线粒体自噬通路异质性进行了分析，为通过线粒体功能的表征，预测血液疾病、心脑血管疾病、恶性肿瘤和衰老中的发病风险奠定了基础。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1小鼠骨髓中获取不同类型淋巴细胞的示意图；
图2从小鼠骨髓中分离的14种淋巴细胞群的流式细胞仪图；
图3A为B,CD4+ T,CD8+ T和NK细胞的tSNE,MM,SSC,MMP和ROS结果；图3B为B,CD4+T,CD8+T和NK细胞的mitophagy结果；图3C为淋系造血分化过程中的不同类型的造血细胞的自噬相关基因的表达水平热图；图3D为自噬相关基因的表达水平统计；
图4为不同分化和活化阶段的淋巴细胞的rSD(SSC)：图4A为B,CD4+ T,CD8+ T和NK细胞群，图4B为B细胞亚群，图4C为CD4+ T细胞亚群，图4D为CD8+ T细胞亚群；
图5为14个细胞亚群的UMAP,FlowSOM热图和FlowSOM聚类分析，图5A为B,CD4+ T,CD8+ T和NK细胞群，图5B为B细胞亚群，图5C为CD4+ T细胞亚群，图5D为CD8+ T细胞亚群；
图6A-6B分别为不同B细胞亚群的MM、MMP、ROS和mitophagy检测结果，图6C为B细胞分化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因的表达水平热图，图6D为自噬相关基因的表达水平统计；
图7A-7B分别为不同CD4+ T细胞亚群的MM、MMP、ROS和mitophagy检测结果；图7C为CD4+ T细胞分化和活化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因的表达水平热图，图7D为自噬相关基因的表达水平统计；
图8A-图8B分别为不同CD8+ T细胞亚群的MM、MMP、ROS和mitophagy检测结果；图8C为CD8+ T细胞分化和活化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因的表达水平热图图8D为自噬相关基因的表达水平统计；
图9为造血细胞的线粒体功能研究流程图；
图10CML模型小鼠和正常小鼠的HSC和KSL细胞的线粒体自噬相关基因的表达结果，图10A为Bcl2l13图10B为Nbr1图10C为Optn图10D为Park2图10E为Pink1图10F为Drp1图10G为FUNDC1图10H为Bcl2。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
表1英文缩略词
表2实验使用抗体信息
| Antibody | Clonenumber | Fluorochrome | CatalogNo. | Company |
| CD3 | 145-2C11 | PE | 12-0031-83 | eBioscience |
| CD3 | 17A2 | BV711 | 100241 | Biolegend |
| CD4 | GK1.5 | PE-Cy7 | 25-0041-81 | eBioscience |
| CD4 | RM4-5 | BV605 | 563151 | BD |
| CD4 | GK1.5 | APC-eFluor780 | 47-0041-82 | eBioscience |
| CD8 | 53-6.7 | APC | 17-0081-82 | eBioscience |
| CD8 | 63-6.7 | BV650 | 563234 | BD |
| CD25 | PC61.5 | APC | 17-0251-82 | eBioscience |
| CD62L | MEL-14 | BV510 | 563117 | BD |
| CD44 | IM7 | BV605 | 563058 | BD |
| CD127 | A7R34 | APC-Cy7 | 135040 | Biolegend |
| B220 | RA3-6B2 | APC-Cy7 | 103224 | Biolegend |
| B220 | RA3-6B2 | PercP-Cy5.5 | 45-0452-82 | eBioscience |
| CD43 | S7 | APC | 560663 | BD |
| IgM | II/41 | PE-Cy7 | 25-5790-82 | eBioscience |
| NK1.1 | PK136 | PE-Cy7 | 25-5941-82 | eBioscience |
实施例1小鼠骨髓细胞分离和线粒体功能分析
1.实验动物
从雌性C57BL/6J(B6)同类系小鼠骨髓中获取不同类型淋巴细胞(图1)，图9显示了造血细胞的线粒体研究的流程图。
2.小鼠骨髓细胞的分离获取
B6-Ly5.1或MLL-AF9AML小鼠脱颈处死，在医用酒精中浸泡消毒5min，从两条腿上解剖出胫骨和股骨，将它们放入装有预冷PBS(phosphatebuffer saline)溶液的6mm或10mm培养皿中。使用锋利的手术剪刀，从骨骼中移除肌肉。对于每根骨头，使用5毫升注射器和25号针头吸取3ml冰冷的PBE(phosphatebuffer electrolyte)。将针头***骨头的一端，然后将骨髓从小孔中取出，放入5ml管中。彻底混合细胞悬浮液，将细胞通过30-70μm尼龙筛网过滤器后放入新的5ml管中，以去除细胞团块。用血细胞计数器或自动计数器计算有核细胞的数量。将细胞悬浮在冰上备用。
3.流式细胞检测和线粒体功能检测
3.1Mitotracker Green(MM指标检测)流式检测染色及上机
取2只C57小鼠全骨髓细胞，使用红细胞裂解液获得白细胞。细胞计数，将所有细胞分为19管，其中包含Blank组1管，CD44(BV605)单阳1管，CD62L(BV510)单阳1管，Mitotracker Green(MM)单阳1管，B细胞样本组4管(4个副孔)，T cell样本组4管(4个副孔)，NK cell样本组4管(4个副孔)，T cell FMO组1管，B cell FMO组1管，NK cell FMO组1管。调整每管样本细胞浓度为5x106细胞/毫升。分别向对应的细胞管中加入B细胞抗体组合、B细胞抗体组合和NK细胞抗体组合(Table S2)。常温下孵育30min，加入3mL PBS，1500rpm/min离心5min，弃上清。将500μL浓度为5mM的Mitotracker Green(MM)工作液分别加入MM单阳管和全阳样本管，37℃下避光孵育20min后，加入3mLPBS 1500rpm/min离心5min，弃上清，同方法洗涤细胞两次。加入500μLPBS重悬后，经300目黄色滤网过滤制成待测样本，上机前每管加入1μLDAPI染色液，一个小时内完成检测。
表3 MitoTracker Green线粒体质量检测抗体组合方案
3.2Mitotracker Red(MMP指标检测)流式检测染色及上机
取2只C57小鼠全骨髓细胞，使用红细胞裂解液获得白细胞。细胞计数，将所有细胞分为19管，其中包含Blank组1管，CD8(BV650)单阳1管，CD25(APC)单阳1管，MitotrackerRed(MMP)单阳1管，B细胞样本组4管(4个副孔)，T cell样本组4管(4个副孔)，NK cell样本组4管(4个副孔)，T cell FMO组1管，B cell FMO组1管，NK cell FMO组1管。调整每管样本细胞浓度为5x106细胞/毫升。分别向对应的细胞管中加入B细胞抗体组合、B细胞抗体组合和NK细胞抗体组合(Table S3)。常温下孵育30min，加入3mL PBS，1500rpm/min离心5min，弃上清。将500μL浓度为30nM的Mitotracker Red(MMP)工作液分别加入MMP单阳管和全阳样本管，37℃下避光孵育20min后，加入3mLPBS 1500rpm/min离心5min，弃上清，同方法洗涤细胞两次。加入500μLPBS重悬后，经300目黄色滤网过滤制成待测样本，上机前每管加入1μLDAPI染色液，一个小时内完成检测。
表4 MitoTrackerRed线粒体膜电位检测抗体组合方案
3.3MitoSOXRed(ROS指标检测)流式检测染色及上机
取2只C57小鼠全骨髓细胞，使用红细胞裂解液获得白细胞。细胞计数，将所有细胞分为24管，其中包含Blank组1管，CD44(BV605)单阳1管，CD62L(BV510)单阳1管，MitoSOXRed(ROS)单阳1管，B cell样本组4管(4个副孔)，CD4+T样本组4管(4个副孔)，CD8+T样本组4管(4个副孔)，NKcell样本组4管(4个副孔)，CD4+T FMO组1管，CD8+T FMO组1管，B cell FMO组1管，NK cell FMO组1管。调整每管样本细胞浓度为5x106细胞/毫升。分别向对应的细胞管中加入B细胞抗体组合、CD4+T细胞抗体组合、CD8+T细胞抗体组合和NK细胞抗体组合(Table S4)。常温下孵育30min，加入3mLPBS，1500rpm/min离心5min，弃上清。将500μL浓度为5μM的MitoSOX Red工作液分别加入ROS单阳管和全阳样本管，37℃下避光孵育20min后，加入3mL PBS 1500rpm/min离心5min，弃上清，同方法洗涤细胞两次。加入500μLPBS重悬后，经300目黄色滤网过滤制成待测样本，上机前每管加入1μLDAPI染色液，一个小时内完成检测。
表5 MitoSOX Red线粒体活性氧检测抗体组合方案
3.4Mitophagy流式检测染色及上机
取2只C57小鼠全骨髓细胞，使用红细胞裂解液获得白细胞。细胞计数，将所有细胞分为26管，其中包含Blank组1管，CD3(BV711)单阳1管，CD25(APC)单阳1管，CD8(BV650)单阳1管，CD127(APC-Cy7)单阳1管，Mitophagy单阳1管，B cell样本组4管(4个副孔)，CD4+T样本组4管(4个副孔)，CD8+T样本组4管(4个副孔)，NK cell样本组4管(4个副孔)，CD4+T FMO组1管，CD8+T FMO组1管，B cell FMO组1管，NK cell FMO组1管。调整每管样本细胞浓度为5x106细胞/毫升。分别向对应的细胞管中加入B细胞抗体组合、CD4+T细胞抗体组合、CD8+T细胞抗体组合和NK细胞抗体组合(Table S5)。常温下孵育30min，加入3mL PBS，1500rpm/min离心5min，弃上清。将500μL浓度为100nM的Mitophagy工作液分别加入Mitophagy单阳管和全阳样本管，37℃下避光孵育20min后，加入3mL PBS 1500rpm/min离心5min，弃上清，同方法洗涤细胞两次。加入500μLPBS重悬后，经300目黄色滤网过滤制成待测样本，上机前每管加入1μL DAPI染色液，一个小时内完成检测。
表6 Mitophagy检测抗体组合方案
所有流式数据由BDAriaIII流式细胞仪(BD Biosciences，美国)采集，并且通过FlowJoTMv10.6.1(BD Biosciences，美国)软件分析，获得流式图、各通道平均荧光强度(mean)和各通道标准差(SD)数据。
4.流式细胞数据的分析
为了探索基于细胞表面标志分类得到的同一阶段的淋巴细胞划分的准确性，以及基于流式分析获得同一阶段淋巴细胞是否的功能异质性，流式细胞分析被用于进一步的研究。
4.1tSNE分析：
应用tSNE降维分析方法获得tSNE结果，在t-SNE图中，蛋白质表达模式相似的细胞紧密地组织在一起，表型相似的细胞群将表示为高度互联的节点集，使不同细胞亚群实现可视化。最终细胞分类可以以覆盖在t-SNE图上的颜色维度的形式或者以热图的形式可视化。t-SNE图中细胞的邻近程度反映了它们在高维空间中的距离。
4.2UMAP分析和FlowSOM分析：
为了验证基于线粒体划分造血细胞的分化群体的有效性，采用统一流形逼近与投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)和流式自组织特征映射(Flow Self-Organizing feature Map，FlowSOM)技术表征不同分化和活化阶段的淋巴细胞的群体特征。其中UMAP分析可以识别高维度的蛋白标记关联性，将细胞的高维相似性可视化，提供了一种流式细胞群体数据分析的新方法。
5.实验结果：
5.1淋巴细胞的类型：
图1为雌性C57BL/6J(B6)同类系小鼠骨髓中获取不同类型淋巴细胞，共有14种；
5.2UMAP,FlowSOM heatmap and FlowSOM cluster analysis of 14lymphocytepopulations A.B,CD4+ T,CD8+ T andNKpopulation B.B subsets C.CD4+ T subsetsD.CD8+ T subsets
5.2流式细胞数据分析结果
14种淋巴细胞流式检测结果UMAP,FlowSOM heatmap andFlowSOM聚类分析记载在图2，图2A为B,CD4+ T,CD8+ T和自然杀伤细胞(NK)群体；图2B为pro-B、pre-B、未成熟B和成熟B人群；图2C为naive CD4+ T、memory CD4+ T和nTreg群体；图2D为中枢记忆CD8+ T、效应记忆CD8+ T和效应CD8+ T群体。
tSNE、UMAP和FlowSOM分析说明，淋巴细胞可以基于表型特征被分为不同的特征亚群。UMAP分析结果记录在图5A-D中，其反映了B/T/NK群组中B、CD4+ T、CD8+ T和NK，Bsubsets中pro-B、pre-B、immature B和mature B，CD4+ T subsets中naive CD4+ T、memoryCD4+ T和nTreg，以及CD8+T subsets中cemtral memory CD8+ T、effectormemory CD8+ T和effector CD8+ T的抗原表达分布情况，与经典的流式二维逐级圈门所得细胞群比例相符。
如图5A所示，B/T/NK细胞群体经FlowSOM分为8组，热图颜色密度表示给定抗原的平均表达，经归一化后形成热图。热图显示了每个检测到的细胞群的每个蛋白质标记的中位表达强度，并根据蛋白表达强度差异对集群进行聚类。在将数据样本集呈递给FlowSOM之前，在FSC-SSC散点图上手动圈选了活细胞流式门。本发明只提取了活细胞门内的细胞，让FlowSOM做进一步的分析，在分析中使用了六个表面标记，网格的颜色表示荧光标记物强度。网格中依据蛋白表达分配得到的集群Pop3、Pop5、Pop1和Pop4分别对应于经典流式圈门方法中的B、CD4+ T、CD8+ T和NK细胞群。FlowSOM提供的细胞群体聚类分析的可视化表示方法，通过节点颜色、节点间相对位置，表征节点所代表细胞的抗原表达分布情况。节点扇形面积越大，该抗原表达越强。
B subsets经FlowSOM分为8组，依据蛋白表达分配得到的集群Pop7、Pop2、Pop0+Pop1+Pop6和Pop4分别对应于经典流式圈门方法中的pro-B、pre-B、immature B和mature B细胞群。
CD4+ T subsets经FlowSOM分为8组，依据蛋白表达分配得到的集群Pop7、Pop1和Pop2+Pop6分别对应于经典流式圈门方法中的naive CD4+ T、memory CD4+ T和nTreg细胞群。CD8+ T subsets经FlowSOM分为8组，依据蛋白表达分配得到的集群Pop4+Pop6、Pop2和Pop3+Pop5分别对应于经典流式圈门方法中的cemtral memory CD8+ T、effectormemory CD8+T和effector CD8+ T细胞群。
5.3线粒体功能分析结果
5.3.1不同分化类型的淋巴细胞群
图3A-3B展示了显示了B细胞、T细胞和NK细胞的线粒体功能水平。图3A为B细胞,CD4+ T细胞,CD8+ T细胞和NK细胞的MM,SSC,MMP和ROS结果，图3B为B,CD4+ T,CD8+ T和NK细胞的mitophagy结果，由图可以看出，四种淋巴细胞的线粒体功能水平由高到低依次为B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，其中CD4+ T细胞的MM、MMP和ROS水平显著高于CD8+ T细胞。B细胞的MMP水平显著高于另外三类细胞(P<0.001)；B细胞和NK细胞的ROS水平分别显著高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞(图3A)；B细胞的mitophagy水平显著高于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；NK细胞的mitophagy水平显著高于CD8+ T细胞(图3B)。CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK细胞和B细胞之间MM、MMP、ROS和mitophagy水平具有差异，该差异具有统计意义。5.3.2B淋巴细胞亚群分化中的线粒体功能
tSNE、UMAP和FlowSOM分析说明，B淋巴细胞可以基于表型特征被分为不同的特征亚群，为了研究不同B细胞亚群的线粒体功能，MM、MMP、ROS和mitophagy等指标被用于进一步分析。图6A-6B显示了pro-B、pre-B、immature B和mature B细胞的线粒体功能水平。在B细胞分化过程中，pro-B的MM和MMP水平显著高于pre-B，pro-B的MM水平显著高于immatureB，immature B的MM水平显著高于mature B。这一结果表明与相对分化的B细胞亚群相比，相对原始的亚群具有更高的MM(图6A)。Mitophagy结果显示，pre-B在B细胞亚群中具有较高的mitophagy水平，显著高于pro-B和mature B，mature B具有较低的mitophagy水平，显著低于pro-B、pre-B和immature B。这一结果表明与相对原始的亚群相比，mature B具有较低的mitophagy水平(图6B)。
5.3.3CD4+ T淋巴细胞亚群活化中的线粒体功能
tSNE、UMAP和FlowSOM分析说明，CD4+ T淋巴细胞可以基于表型特征被分为不同的特征亚群，为了研究不同CD4+ T细胞亚群的线粒体功能，MM、MMP、ROS和mitophagy等指标被用于进一步分析。图7A-5B分别为不同CD4+ T细胞亚群的MM、MMP、ROS和mitophagy检测结果，显示了naive CD4+ T、memory CD4+ T和nTreg细胞的线粒体功能水平。在CD4+ T细胞分化过程中，naive CD4+ T的MM、MMP、ROS和mitophagy水平显著高于memory CD4+ T和nTreg，nTreg的MMP水平显著高于memory CD4+ T，而nTreg的mitophagy水平显著低于memory CD4+T。这一结果表明与相对分化的T细胞亚群相比，naive CD4+ T亚群具有更高的MM、MMP、ROS和mitophagy水平。
5.3.4CD8+ T淋巴细胞亚群活化中的线粒体功能
tSNE、UMAP和FlowSOM分析说明，CD8+ T淋巴细胞可以基于表型特征被分为不同的特征亚群，为了研究不同CD8+ T细胞亚群的线粒体功能，MM、MMP、ROS和mitophagy等指标被用于进一步分析。图8A-6B分别为不同CD8+ T细胞亚群的MM、MMP、ROS和mitophagy检测结果，显示了central memory CD8+ T、effectormemory CD8+ T和effector CD8+ T细胞的线粒体功能水平。在CD8+ T细胞活化过程中，central memory CD8+ T、effector memory CD8+ T和effector CD8+ T的MM水平依次降低，并且两两之间具有统计学差异。这一结果表明与相对分化的B细胞亚群相比，相对原始的亚群具有更高的MM。central memory CD8+ T的MMP水平显著高于effector memory CD8+ T，effectormemory CD8+ T的ROS水平显著高于effector CD8+ T(图8A)。effector CD8+ T的mitophagy水平显著高于central memoryCD8+ T和effector memory CD8+ T，表明活化的T细胞亚群具有更高的mitophagy水平(图8B)。
6.实验结论
基于表面标记物流式分析的手段对淋巴细胞的划分会出现细胞群划分边界的不清晰，导致划分的细胞群不准确，如图5A-5D展示的UMAP分析图可以看出，依据表面标记划分细胞的方法划分出来的淋巴细胞亚群是相互重叠的，划分获得的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T和NK细胞内部均存在不同程度的异质性；而引入淋巴细胞线粒体功能分析后，对B细胞、CD4+T细胞、CD8+T和NK细胞的划分具有统计意义，尤其是图3A、图3C展示的基于MM、MMP、ROS和mitophagy对B细胞、CD4+T细胞、CD8+T和NK细胞的划分的数据图，显示出将淋巴细胞线粒体功能作为细胞划分依据是准确和有效的。
实施例2基于不同训练模型和验证模型对淋巴细胞划分标记进行优化和验证
1.分析方法：
1.1基于SSC的分析验证MM指标的有效性
为了探索淋巴细胞的细胞器数量的表征方式，挖掘一种简单的表征造血细胞的MM的指标，SSC被用于进一步分析。SSC代表细胞的颗粒度，即细胞内细胞器的复杂程度，能够潜在地反映细胞内的细胞器的种类和数量水平。
在研究不同分化和活化阶段的淋巴细胞的线粒体功能的基础上，为了探索基于细胞表面标志分类得到的同一阶段的淋巴细胞的功能异质性，流式细胞分析被用于进一步的研究，基于SSC的rSD被用于评价一个细胞群体内部的组成成分之间的差异程度，rSD在一定置信度下越小分析结果的相对误差就越小,就越符合标准。
1.2结合单细胞测序技术验证不同分化和活化阶段的淋巴细胞的线粒体自噬通路为了深入了解小鼠淋巴细胞的自噬相关基因表达程序，来源于NCBI数据库的单细胞基因表达分析结果被与流式细胞术相结合进行基因表达水平的探讨。小鼠不同分化和活化阶段的造血细胞的单细胞测序数据下载于NCBI数据库(GSE77098)，分析了九种线粒体自噬相关基因：Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2在造血细胞中的表达情况。
2.实验结果：
2.1不同分化和活化阶段的淋巴细胞SSC结果
SSC能够潜在地反映细胞内的细胞器的种类和数量水平，为线粒体MM表征提供另外一种方式。针对SSC的检测作为训练集、SSC的rSD分析作为验证集给出线粒体功能检测的优化和调整的方向。图3A显示了不同分化和活化阶段的淋巴细胞的SSC结果，表明了NK细胞、B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的SSC数值水平。由图3A图中分布可以看出，四类细胞的SSC水平由高到低依次为NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞。具体地，在淋巴细胞中，NK细胞的SSC水平显著高于另外三群细胞(P<0.001)，B细胞的SSC水平显著高低于另外三群细胞(P<0.001)。在淋巴细胞中，B细胞具有较高的线粒体功能水平和较低的SSC水平，说明其他三种淋巴细胞中的核糖体、高尔基体、内质网和溶酶体等细胞器的含量明显高于B细胞。在B细胞亚群中，低分化的pro-B细胞的SSC水平显著高于pre-B、immature B和matureB细胞(P<0.001)。在CD4+ T subsets中，SSC水平由高到低依次为memory CD4+ T、CD4+T和nTreg细胞(P<0.001)。在CD8+ T substes中，SSC水平由高到低依次为effector CD8+T、central memory CD8+ T和effector memory CD8+ T细胞(P<0.01)。
2.2、SSC的rSD水平
rSD在一定置信度下越小分析结果的相对误差就越小,就越符合标准。图4为不同分化和活化阶段的淋巴细胞SSC的rSD结果。总体上，四类细胞的rSD(SSC)水平由高到低依次为NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和B细胞，与图3A展示的四类细胞的SSC结果相符。具体地，在淋巴细胞中，NK细胞的rSD(SSC)水平显著高于另外三群细胞(P<0.001)，B细胞的rSD(SSC)水平显著高低于另外三群细胞(P<0.001)，与四类细胞的SSC结果相符(图4A)。这一结果表明相对于其他淋巴细胞，B细胞群体内部SSC分布偏离平均值较小，具有较低的异质性；而NK细胞群体内部SSC分布偏离平均值较大，具有较高的异质性。在B细胞群中，低分化的pro-B细胞的rSD水平显著高于pre-B、immature B和mature B细胞(P<0.001)，与SSC结果相符(图4B)。在CD4+ T细胞群中，CD4+T的rSD水平显著低于memory CD4+ T和nTreg细胞(P<0.001)，与SSC结果相符(图4C)。在CD8+ T细胞群中，effector CD8+ T的rSD水平显著高于central memory CD8+ T和effector memory CD8+ T细胞(P<0.01)，与SSC结果相符(图4D)。
实验结论：
不同类型的淋巴细胞的rSD变化情况与它们的SSC特征具有一致性，说明细胞器的复杂程度与细胞的异质性具有正相关性，细胞内的细胞器数量越多，这一细胞群体在流式检测结果中则越离散。由上述两组训练分析模型可以得出结论：采用传统的流式分析的方式通过表面标志物表征淋巴细胞，从而分析得到的具有相同细胞表面标志的淋巴细胞群体其内部的细胞间存在形态和功能上的异质性，因此采用流式细胞的方法划分获得细胞群其内部实际是存在其他不同亚细胞群的，而将细胞线粒体功能作为划分依据可以划分出传统流式细胞不能区分的具有异质性的细胞亚群。
2.3不同分化和活化阶段的淋巴细胞的线粒体自噬通路的实验结果：
NCBI数据库来源的淋巴细胞流式分选表型与本实验图2A中一致，表明本实验分离的细胞类型和流式分选手段与现有技术相符；
Pink1/Park2、BNIP3/NIX和FUNDC1通路为线粒体自噬相关的信号通路，而自噬相关基因Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1和Tax1bp1主要参与Pink1/Park2通路，Drp1和FUNDC1主要参与FUNDC1通路，Bcl-2主要参与BNIP3/NIX通路。图3C展示的热图综合反映淋系造血分化过程中的不同类型的造血细胞的自噬相关基因的表达水平，图3D展示了自噬相关基因如Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2的表达在不同群体中存在明显的差异，该差异性与实施例中线粒体功能反应的差异保持一致。
对B细胞分化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因表达水平的统计分析表明，LT-HSC的Optn表达水平显著高于MPP、CLP和pro-B细胞(P<0.05)。Pink1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够特异性的在去极化的线粒体上定位，通过磷酸化泛素来激活Parkin，并通过招募自噬受体来诱导mitophagy的发生。ST-HSC的Pink1表达水平显著低于immature B细胞(P<0.05)，pro-B的Tax1bp1表达水平显著低于LT-HSC、ST-HSC、MPP和pre-B(P<0.01)。这一结果表明与pre-B、immature B和mature B细胞相比，pro-B细胞在参与Pink1/Park2通路方面继承HSC的特征最少。对BNIP3/NIX通路来说，CLP的Bcl2表达水平显著高于LT-HSC、ST-HSC、pro-B、pre-B和immature B细胞(P<0.01)，表明与CLP参与BNIP3/NIX通路的程度较强(图6C-4D)。
对CD4+ T细胞分化和活化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因表达水平的统计分析表明，LT-HSC和ST-HSC的Optn表达水平分别显著高于naive CD4+ T、memory CD4+ T和nTreg细胞(P<0.05)，nTreg的Tax1bp1表达水平显著低于LT-HSC、ST-HSC和MPP(P<0.01)，ST-HSC的Tax1bp1表达水平显著高于naive CD4+ T细胞(P<0.01)。这一结果表明与naiveCD4+ T、memory CD4+T细胞相比，nTreg细胞在参与Pink1/Park2通路方面继承HSC的特征最少。对BNIP3/NIX通路来说，naive CD4+ T细胞的Bcl2表达水平显著高于LT-HSC和ST-HSC细胞(P<0.01)，表明与CLP相类似，naive CD4+ T细胞参与BNIP3/NIX通路的程度较强(图7C-5D)。
对CD8+ T细胞分化和活化的不同阶段的造血细胞的自噬相关基因表达水平的统计分析表明，LT-HSC和ST-HSC的Optn表达水平分别显著高于central memory CD8+ T细胞(P<0.05)，central memory CD8+ T的Tax1bp1表达水平显著低于LT-HSC、ST-HSC、MPP和effector CD8+ T(P<0.05)。这一结果表明与CLP和effector CD8+ T细胞相比，centralmemory CD8+ T细胞在参与Pink1/Park2通路方面继承HSC的特征最少。对BNIP3/NIX通路来说，effector CD8+ T细胞的Bcl2表达水平显著高于LT-HSC细胞(P<0.01)，表明与CLP相类似，effector CD8+ T细胞参与BNIP3/NIX通路的程度较强(图8C-6D)。
实验结论：
从研究角度来看，造血干祖细胞和淋巴细胞的不同群体基于不同的线粒体自噬相关通路通过招募自噬相关蛋白参与自噬过程；在淋系分化过程中，造血干祖细胞和淋巴细胞的mitophagy异质性不仅体现在mitophagy发生的数量上，也体现为不同细胞发生mitophagy的优势通路的异质性。
上述结果表明，Pink1/Park2、BNIP3/NIX和FUNDC1通路在造血干祖细胞和淋巴细胞的不同群体的线粒体自噬过程中普遍存在，自噬相关基因如Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2的表达在不同群体中存在明显的差异，该差异性与实施例中线粒体功能反应的差异保持一致，为线粒体功能作为细胞划分依据提供了验证依据，而且作为训练模型通过对数据库来源的淋巴细胞线粒体自噬通路相关基因的测序有利于建立基于线粒体功能划分模型。
实施例3基于患病小鼠的动物验证模型
1.实验方法
慢性粒细胞性白血病(CML)小鼠模型和正常小鼠的造血干细胞(HSC)和造血干祖细胞(KSL)的单细胞测序数据下载于NCBI数据库(GSE59337)，分析了九种线粒体自噬相关基因在造血细胞中的表达情况，旨在对慢性粒细胞性白血病模型小鼠和正常小鼠的造血干细胞(HSC)和造血干祖细胞(KSL)的线粒体自噬相关基因的表达分析,用以佐证线粒体自噬通路在动物患病模型中起到重要作用其构成慢性粒细胞白血病小鼠发病的起因，因此使用线粒体自噬通路相关基因的差异表达分析作为训练、验证集对本发明构建的淋巴细胞划分模型继续验证具有实际应用的意义。
2.实验结果：
单细胞测序结果展示在图10中，在四种类型的细胞中，HSC(normal)的Nbr1、Park2、Pink1、Drp1和FUNDC1的表达水平相对较高，体现了HSC的较高的自噬水平，这有助于HSC(normal)保持再生能力，并且以Pink1/Park2和FUNDC1通路为线粒体自噬的优势通路。
与正常小鼠的HSC和KSL细胞相比，CML模型小鼠的HSC和KSL细胞的Nbr1、Optn和Pink1基因的表达下调，而Bcl2基因的表达上调。这一结果表明CML模型小鼠的造血干祖细胞的线粒体自噬能力不及正常小鼠，但参与BNIP3/NIX通路的程度更强。与正常小鼠相比，CML小鼠的HSC和KSL细胞的线粒体自噬水平和优势通路的改变可能影响HSC和KSL细胞对细胞内的线粒体的清除和线粒体功能的维持，导致细胞内ROS水平上升，进而影响细胞的糖脂、核酸和蛋白质等各项生物大分子代谢功能，引起相关病理现象的发生和发展。
实验结论：基于上述慢性粒细胞性白血病(CML)小鼠模型和正常小鼠的造血干细胞(HSC)和造血干祖细胞(KSL)自噬相关基因、通路的分析可知，自噬基因与白血病的发生发展正相关，具有实际的临床应用价值，本发明将自噬相关基因表达和分析作为验证集作为线粒体功能划分细胞模型的验证依据是有效且有价值的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞模型的构建方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：
步骤1)小鼠骨髓细胞的分离获取；
步骤2)采用流式检测手段，基于细胞表型的分析将步骤1)分离获得的小鼠骨髓细胞划分为不同的淋巴细胞亚群，所述淋巴细胞亚群包括：B细胞亚群、CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群和NK细胞亚群；
步骤3)将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行线粒体功能检测，所述线粒体功能检测包括：Mitotracker Green流式检测线粒体质量(Mitochondrial mass，MM)、Mitotraker Red流式检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)、MitoSOX Red流式检测线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和Mitophagy流式检测线粒体自噬水平；
步骤4)基于步骤3)的线粒体功能检测的结果获得区分不同淋巴细胞亚群的指标；所述步骤4)中区分不同淋巴细胞亚群的指标为：线粒体功能水平由高到低依次为B细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞；CD4+T细胞的MM、MMP和ROS水平高于CD8+T细胞；B细胞的MMP水平高于NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞，B细胞和NK细胞的ROS水平分别高于CD4+T细胞和CD8+T细胞；B细胞的线粒体自噬水平高于CD4+T细胞和CD8+T细胞；NK细胞的线粒体自噬水平高于CD8+T细胞；
所述步骤4)中区分B细胞亚群的指标为：pro-B的MM和MMP水平高于pre-B，pro-B的MM水平高于immature B，immature B的MM水平高于mature B；pre-B在B细胞亚群中具有较高的mitophagy水平，高于pro-B和mature B；mature B具有低的mitophagy水平，低于pro-B、pre-B和immature B；
所述步骤4)中区分CD4+T淋巴细胞亚群不同分化亚群的指标，所述CD4+T淋巴细胞不同分化亚群的指标为：naive CD4+T的MM、MMP、ROS和线粒体自噬水平高于记忆CD4+T和nTreg，nTreg的MMP水平高于记忆CD4+T，nTreg的线粒体自噬水平低于记忆CD4+T；
所述步骤4)中区分CD8+T淋巴细胞不同分化亚群的指标为：central memory CD8+T、effector memory CD8+T和effector CD8+T的MM水平依次降低；central memory CD8+T的MMP水平高于effector memory CD8+T，effector memory CD8+T的ROS水平高于effectorCD8+T；effector CD8+T的mitophagy水平高于central memory CD8+T和effectormemoryCD8+T；
步骤5)将步骤2)划分出的不同淋巴细胞亚群分别进行单细胞测序，检测其中自噬相关基因的表达水平，所述自噬相关基因选自Bcl2l13、Nbr1、Optn、Park2、Pink1、Tax1bp1、Drp1、FUNDC1和Bcl-2中的一种或者几种；基于自噬相关基因表达的水平验证步骤4)所述区分不同淋巴细胞亚群的指标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2)所述的细胞表型的分析为使用flowjoTM V10.6.1软件进行tSNE、UMAP和FlowSOM分析。
3.根据权利要求1或2所述的非诊断目的基于线粒体代谢活性区分淋巴细胞亚群细胞模型的构建方法的应用，其特征在于，
所述应用选自以下一种或者几种：
1)用于B细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞群的划分；
2)用于pro-B,pre-B,immature B和mature B细胞群的划分；
3)用于naive CD4+T,memory CD4+T和nTreg细胞群的划分；
4)用于central memory CD8+T,effector memory CD8+T和effector CD8+T细胞群的划分。
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|---|---|---|---|---|
| AU2003230209A1 (en) * | 2002-05-28 | 2003-12-12 | Universita' Degli Studi Di Bologna | Method and kit for measuring mitochondrial activity in human lymphocytes |
| CN110487706A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-11-22 | 泛肽生物科技(浙江)有限公司 | 一种人外周血淋巴细胞的检测方法 |
| CN113567407A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-10-29 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种造血细胞的线粒体功能的检测方法 |
-
2022
- 2022-08-16 CN CN202210982871.2A patent/CN115141801B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003230209A1 (en) * | 2002-05-28 | 2003-12-12 | Universita' Degli Studi Di Bologna | Method and kit for measuring mitochondrial activity in human lymphocytes |
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